Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente Rückverfolgung von Zelllinien und Identitäten in lebenden Embryonen und analysiert gleichzeitig detaillierte Zellmorphologien wie Axone und Dendriten bei der Entwicklung von C.elegans Neuronen. Im Vergleich zur konfokalen Mikroskopie bietet die invertierte selektive Hintergrundbeleuchtungsmikroskopie oder DiSPIM mit doppelter Ansicht ein höheres Rauschensignal, eine isotropere räumliche Auflösung und eignet sich besser für die langzeitige In-vivo-Bildgebung. Beginnen Sie mit 500 Mikrolitern 1%Methylcelluloselösung in die Vertiefung eines konkaven Mikroskopschlittens.
Mit einem Platindrahtpicker werden Erwachsene von einer nematoden Wachstumsmediumplatte in die M9-Methylcelluloselösung übertragen. Verwenden Sie die geschärften Spitzen von 18 Gauge hypodermischen Nadeln, um jedes Tier quer am mittleren Körper auf mindestens ein bis vier Zellembryonen zu schneiden. Mit einem Sauger Mundstück sanft zwischen den Zähnen gehalten, prefill eine Mikrokapillarpipette mit 10 bis 15 Mikroliter M9 Puffer und sanft aspirieren mehrere Embryonen aus dem Rutsch in die Kapillare.
Geben Sie die Embryonen in das zentrale Rechteck des Deckels einer Stahlbildkammer, die mit frischem M9-Puffer gefüllt ist. Richten Sie die Embryonen vorsichtig vertikal aus, so dass die lange Achse jedes Embryos senkrecht zur langen Achse des Deckels verläuft. Legen Sie dann die Stahlbildkammer in den Probenhalter auf der Bühne eines diSPIM.
Um die Embryonen für die Bildgebung vorzubereiten, öffnen Sie Mikromanager und stellen Sie die Laserintensitäten auf 179 Mikrowatt 0,5%Äquivalenz für 488 Nanometer und 79 Mikrowatt 0,25% Äquivalenz für 561 Nanometer. Die Kalibrierung zwischen Softwareeinstellung und echter Laserleistung muss im Voraus erfolgen, um den Spielraum für bestimmte Mikrowatt festzulegen. Wählen Sie im Plugin-Menü die Gerätesteuerung und die angewandte wissenschaftliche Bildgebung diSPIM aus, um das angewandte wissenschaftliche Bildgebungsfenster für die invertierte selektive Ebenezulage zu öffnen.
Bestätigen Sie auf der Registerkarte "Erfassung", dass die Parameter wie angegeben festgelegt sind. Legen Sie unter der Registerkarte Autofokus die angegebenen Parameter fest. Beachten Sie, dass der Autofokuskanal den Kernfluoreszenzkanal für die geplanten Lineaging-Experimente angeben sollte.
Aktivieren Sie die Balken- und Blattfelder für Pfad A oder B, und klicken Sie auf live, um mit der Bildaufnahme zu beginnen. Ein Live-Ansichtsfenster wird geöffnet. Zeichnen Sie dann ein Kästchen um den von Interesse interessierten Embryo, um den Autofokus-Analysebereich des Embryos auszuwählen, und klicken Sie auf Starterfassung, um die langfristige multidimensionale Bildaufnahme zu initiieren.
Für die Bildanzeige, Verarbeitung und Zelllinienanalyse, nach dem Herunterladen und Extrahieren des Software-Bundles, doppelklicken Sie auf die CytoSHOW_app. jnlp-Datei, um mit der Ausführung von CytoSHOW zu beginnen. Wählen Sie im Dateimenü den neuen und diSPIM-Monitor-Mikromanager aus, um den Stammdatensatzordner zu finden, in dem die unformatierten Mikromanager-Images gespeichert wurden.
Wählen Sie einen beliebigen Zeitpunktordner aus, und klicken Sie auf Öffnen. Multidimensionale Navigationsfenster werden automatisch für SPIM A und SPIM B geöffnet. Mit dem Polygonauswahlwerkzeug klicken Sie direkt außerhalb der vorderen, hinteren, dorsalen und ventralen Kanten des von Interesse sind, um ein Bogenbindenmuster über dem Embryo in den SPIM A- und SPIM B-Ansichten zu erzeugen, und klicken Sie auf diSPIM. Richten Sie die grünen und roten Kanäle für jeden SPIM-Arm aus, und klicken Sie erneut auf diSPIM.
Die Verschiebungen werden in allen anderen Positionsfenstern ausgelöst. Klicken Sie als Nächstes auf diSPIM und sichern Sie die Sicherung, um das Dialogfeld für die Entsicherungs-DiSPIM-Rohdatenvolumen zu öffnen, und legen Sie die angegebenen Parameter fest. Wenn alle Parameter festgelegt wurden, klicken Sie auf ja, und geben Sie das Ausgabeverzeichnis an, in dem die verarbeiteten Dateien gespeichert werden sollen, bevor Sie auf OK klicken. Verschieben Sie im Vorschaufenster die t-Scroll-Leiste auf den Zeitpunkt zwei des Fensters, und verschieben Sie den Z-Schieberegler, bis die Ansicht direkt entlang der langen Achse des Embryos angezeigt wird.
Verschieben Sie die t-Scroll-Leiste zurück zum Zeitpunkt 1 im Vorschaufenster, und verwenden Sie das Linienauswahlwerkzeug, um eine Linie aus dem ventralen, rundsten Kern durch die Ebene der AB-Zellmetaphasenplatten zu zeichnen. Klicken Sie auf die Schaltfläche diSPIM-Vorschau, um die Feineinstellungen an der Ausrichtung des in der Vorschau angezeigten Bildvolumens zu speichern. Legen Sie die t-scroll-Balken der diSPIM-Monitorfenster auf die Start- und Endzeitpunkte der gesamten zu verarbeitenden Bildspanne fest.
Klicken Sie dann auf OK. Für eine effiziente und genaue Zelllinienanalyse ist es wichtig, eine präzise ADL-Ausrichtung der Datenmengen vor der Verarbeitung von Starry Night zu erreichen. Um die Starry Night-Abstammungsverfolgungsserie in AceTree zu öffnen, öffnen Sie die bereitgestellte angepasste AceTree-Datei, und wählen Sie die Datei "Konfigurieren" auswählen, um das zuvor angegebene Ausgabeverzeichnis zu finden. Öffnen Sie den Sicherungsunterordner für den von Interesse interessierten Embryo, und wählen Sie die bearbeitete Datei aus.
Klicken Sie dann auf Öffnen, und fahren Sie mit der Linienvisualisierung und -bearbeitung fort, wie zuvor beschrieben. Optimierte Protokolle führen zu keiner nachweisbaren Phototoxizität für die Embryonen, wie sie zum Zeitpunkt des Schlüpfens und dem Zeitlichen im Zusammenhang mit Entwicklungsmeilensteinen beurteilt werden. Mit diesem Protokoll, wie gezeigt, wurden die nicht identifizierten Zellen in diesem transgenen grünen fluoreszierenden Protein, das Nematodenstamm exzessient, bestimmt, um motorischen Neuronen, der Ausscheidungskanalzelle und zwei Muskelzellen zu entsprechen.
Die identifizierten Neuronen wurden bereits nach 360 Minuten nach der Befruchtung schräg geformt, wobei die längere Zellachse die nachfolgende Achse für das Neuritenwachstum darstellte. Von 385 bis 410 Minuten nach der Befruchtung verlängerten die RMDD-Neuriten etwa sechs Mikrometer vor der Zellkörper. Von 415 bis 445 Minuten nach der Befruchtung verlängerten sich beide Neuriten dorsal in und um den mutmaßlichen Nervenring.
Im Durchschnitt verlängerte jedes RMDD-Neurit etwa 11 Mikrometer aus dem Zellkörper, bevor es synchron sein kontralaterales Gegenstück an der Spitze des Rings traf. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass neuronale Entwicklungsmerkmale für einzelne identifizierbare Zellen mit diesem integrierten Protokoll untersucht, verglichen und quantifiziert werden können. Es ist wichtig, daran zu denken, die Embryonen vertikal zu orientieren, so dass die lange Achse jedes Embryos senkrecht zur langen Achse des Deckels ist.
Mit diesem Protokoll haben wir begonnen, das entstehende embryonale Nervensystem aus allen Blickwinkeln zu erforschen. Zum Beispiel während der Zellgeburt, Migration und Differenzierung, Neuritenbildung, Wachstum und Faszikulation.
