Dieses Protokoll zeigt zwei verschiedene Möglichkeiten, NKG2DLs auf der Oberfläche von AML-Zellen zu erkennen. Die Technik bietet eine schnelle, benutzerfreundliche Färbemethode, um alle bekannten und möglicherweise unbekannten NKG2DLs zu erkennen. Diese Methode ermöglicht die Trennung von leukämischen Stammzellen von Massen-AML-Zellen, was es ermöglicht, diese Zellen weiter zu charakterisieren.
Beginnen Sie mit dem Auftauen des Biotins und der NKG2D-Fusionsproteinröhrchen bei Raumtemperatur. Drehen Sie das NKG2D FC-Pulver schnell herunter, fügen Sie dann 500 Mikroliter PBS hinzu, um das Pulver zu rekonstituieren, und mischen Sie es gründlich mit einer P-1000-Mikropipette. Fügen Sie 100 Mikroliter des NKG2DL-Fusionsproteins in eine Biotinröhre hinzu, um eine Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten, und mischen Sie die Lösung gründlich mit einer P-100-Mikropipette.
Um die AML-Zellen aufzutauen, entfernen Sie das kryoviale primäre AML aus dem Flüssigstickstoffspeicher und legen Sie es sofort in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad. Bewegen Sie das Röhrchen vorsichtig im Wasser hin und her, damit der Inhalt der Durchstechflasche auftauen kann, bis nur noch ein kleiner Eiskristall übrig ist. Geben Sie die aufgetauten Zellen sofort in das Medium, das das Röhrchen enthält, und spülen Sie die Durchstechflasche mit einem Milliliter Medium aus.
Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 mal G für 10 Minuten und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Waschen Sie die Zellen mit fünf Millilitern RPMI-Medium, das 10% FCS enthält, und wiederholen Sie die Zentrifugation. Das Zellpellet mit Färbepuffer wird auf eine Endkonzentration von 0,5 mal 10 bis zu den siebten Zellen pro Milliliter resuspendiert.
Dann 100 Mikroliter der Zellsuspension auf eine Zellkultur 96 Well U-Bodenplatte geben und die Platte bei 300 mal G für 10 Minuten zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Bereiten Sie eine Mastermischung aus biotinyliertem NKG2D-Fusionsprotein vor, so dass die Zellen in einem Endvolumen von 50 Mikrolitern pro Vertiefung mit einer endgültigen NKG2D-Konzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter pro Vertiefung resuspendiert werden.
Fügen Sie die vorbereitete Mastermischung hinzu und resuspendieren Sie die Zellpellets mit einer 200 Mikroliter Pipette. Inkubieren und zentrifugieren Sie die Platte wie im Textmanuskript beschrieben. Bereiten Sie eine Mastermischung mit Streptavidin PE vor, so dass die Zellen in einem Endvolumen von 50 Mikrolitern resuspendiert werden.
Fügen Sie die Mastermischung zu den Zellen hinzu und resuspendieren Sie die Pellets mit einer 300 Mikroliter Mehrkanalpipette. Nachdem Sie die Platte zentrifugiert und den Überstand verworfen haben, verwenden Sie eine 300-Mikroliter-Mehrkanal-Mikropipette, um die Zellpellets in 200 Mikrolitern Färbepuffer plus 7-AAD wieder aufzubesiedeln. Dann analysieren Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometriegerät.
Die analysierten AML-Proben sind positiv für CD34 und NKG2DL, aber es gibt auch negative Subpopulationen mit insgesamt vier verschiedenen Populationen. Die typische Gating-Strategie beginnt mit der Auswahl der Hauptpopulation von Zellen über ihren FSC und SSC. Dubstoppeln und abgestorbene Zellen werden in der nachgelagerten Analyse ausgeschlossen.
Die Tore werden mit FMO-Kontrollen eingestellt, um eine ordnungsgemäße Identifizierung positiver Zellen zu gewährleisten. Die Fluoreszenzdichten von Zellen, die für CD34 im Vergleich zu NKG2DL positiv sind, werden hier hervorgehoben. AML-Zellen, die positiv für CD34 sind, zeigen eine geringere Oberflächenexpression von NKG2DL, was darauf hindeutet, dass die NKG2DL-Expression mit einem Mangel an Stammigkeit verbunden ist.
Drei primäre AML-Proben zeigten 19,8, 49,8 und 89,4% positive Ereignisse für die Fusionsproteinfärbung gegenüber 20,4, 50,4 und 90,6% für die gepoolte Anti-NKG2DL-Antikörperfärbung. Auf der anderen Seite zeigte die Einzelligandenfärbung eine Reihe positiver Ereignisse von bis zu 92%, wobei die Prozentsätze je nach Liganden variierten. Bei diesem Versuch ist es sehr wichtig, beim Auftauen der primären AML-Zellen schnell zu sein, da sie zerbrechlich sind und während dieses Schritts leicht absterben können.
Nach der Durchführung dieses Protokolls kann eine Zellsortierung basierend auf dem NKG2DL-Signal durchgeführt werden, um die Populationen weiter zu untersuchen.
