Die Autoren sind dankbar, dass Jeremy Teo CM und S. Oliver Ryan für ihren Beitrag und Jolanta Kilarska um Hilfe bei der Bildverarbeitung. Wir danken der BIOP Core Facility an der EPFL für die Unterstützung bei der Zwei-Photonen-Mikroskopie Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse der Europäischen Forschungskommission (DC-Lymph, 206653-2), der europäischen Rahmen Projekt 7 (AngioScaff), der Schweizerische Nationalfonds (31-135756) und der US National Institutes of Health (NIH) / NIH Herz, Lunge und Blut-Institut (NHLBI) (RO1 HL096539). Darüber hinaus Mittel aus dem Robert Wenner-Preis (Krebsliga Schweiz) erlaubt den Kauf der in dieser Studie verwendeten Leica Stereomikroskop. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung zur Veröffentlichung oder Vorbereitung des Manuskripts.

Alle Verfahren an Tieren durchgeführt wurden in strikter Übereinstimmung mit dem Schweizer Tierschutzgesetzes, der Verordnung über den Tierschutz und der Verordnung über die Tierversuche. Wir bestätigen, dass unsere Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC), genannt Commission de Surveillance de l&#39;Etat de Vaud (Ausweis-Nummer: 2687), die speziell genehmigte diese Studie. 1. Tumor Beimpfung des Ohr <ol><li> Kultur B16-F10-Melanom-Zellen GFP in einer 10 cm Petrischale mit DMEM + 10% FBS-Medien. </li><li> Wenn die Zellen 80-90% konfluent, waschen Sie sie mit PBS und trennen sie durch Trypsinierung. Spin down Zellen bei 1.500 xg für 5 min bei 4 ° C, das Pellet in 1 ml Ringer-Lösung und überträgt es in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Spin wieder und entfernen Sie alle Überstand außer einer dünnen Schicht des Mediums, die gerade über dem Pellet bleibt. Resuspendieren der Zellen mit einer dicken Zellaufschlämmung enden. </li><li> Betäuben die Maus mit einer Mischung aus MarktAmin / dorbene [Medetomidin] (75mg/kg-1mg/kg) und bestätigen, dass das Tier ausreichend durch Durchführen einer sanften Prise Zehe betäubt. Erhöhen Sie die Isofluran-Konzentration in Schritten von 0,1% bei Bewegungen beobachtet werden (zB Entzug der Pfote). Halten Sie die Maus auf einem rektalen Thermistor gesteuert Heizkissen (37 ° C) während des gesamten Verfahrens und seine Augen mit einer geeigneten Augensalbe zu schützen. </li><li> Bereiten Sie eine Hamilton-Spritze (33 G-Nadel, 10-ml-Spritze Volumen). Entfernen Sie die Kappe mit der Nadel und laden 20 ul Zellaufschlämmung oben auf der Spitze Kammer. Ziehen Sie den Kolben, bis 5 ml Schlamm wird in der Spritze geladen. Entfernen Sie den überschüssigen Schlamm aus dem Spitzenkammer und schließen Sie die Verschlusskappe. </li><li> Mit Klebeband fixieren den proximalen Rand des Ohres an der Spitze des Zeigefingers. In einem Winkel von 45 °, langsam legen Sie die Hamilton-Spritze Nadel zwischen Rücken Dermis und des Knorpels. Einmal drinnen, durchdringen das Ohr nahe für ca. 2-3 mm distal. <br /&gt; Hinweis: Das Verfahren von Zellinjektion sollte von geschulten und zertifizierten Techniker durchgeführt werden. Darüber hinaus muss dieser Prozess langsam und der Reihe nach durchführen: Erstens sollte die Nadel horizontal zum Ohr Haut platziert und langsam in die Gehör Dermis eingelegt werden. Einmal und nur dann das Nadelende in die Haut, sollte der Kolben gedrückt wird. Durch Drücken des Kolbens wird Zellen Impfung in der Haut auslösen. In dem unwahrscheinlichen Fall der Nadel vorbei an den zwei Schichten der Dermis Ohr, der Schicht des Knorpels und tritt in die Haut der Person, die das Experiment sollte die Schmerzen für den Experimentator Finger zugefügt als alarmierendes Zeichen berücksichtigt und zur sofortigen Rückzug werden der Nadel vom Experimentator Haut. In diesem Fall Kolben sollte nicht gedrückt werden, und die Haut sollte mit Alkohol sterilisiert werden. Alternativ können unbelebten Objekt anstelle eines Fingers zur Stabilisierung der Ohr werden. </li><li> Inject 3 ul Zellaufschlämmung und die Nadel aus dem Ohr langsam zurückzuziehen.Lassen Tumorzellen bilden eine solide Tumor während 7-9 Tagen und folgen dem Tumorwachstum mit Hilfe eines Fluoreszenz-Stereomikroskop. </li><li> Alternativ, um die frühen Schritte der Tumorzelle Interaktion mit Gewebematrix zu folgen, gelten 50 ul von 100.000 Tumorzellen in Ringer-Lösung auf den exponierten und gefärbt Ohr Dermis (nach Schritt 3.3) suspendiert. </li></ol> 2. Ohrenkorrektur <ol><li> Drei Tage vor dem Experiment, rasieren Sie die Maus Kopf, enthaaren die Haare um den Kopf und Ohr (15.10 sec) und mit Wasser abspülen. </li><li> Anesthetize die Maus mit einer Mischung aus Sauerstoff und befeuchtet Isofluran (3-4% Induktion, 1-2% Wartung) und bestätigen, dass das Tier ausreichend durch Durchführen einer sanften Prise Zehe betäubt. Erhöhen Sie die Isofluran-Konzentration in Schritten von 0,1% bei Bewegungen beobachtet werden (zB Entzug der Pfote). Halten Sie die Maus auf einem rektalen Thermistor gesteuert Heizkissen (37 ° C) während des gesamten Verfahrens und seine Augen mit einem Schutzgeeignete Augensalbe. </li><li> Erstellen Sie eine Plattform von 8 Glas geklebt Histologiepräparaten gemacht. Drehen Sie die Maus auf den Rücken und legen Sie die tumortragenden Ohr auf dem Stapel von Glasobjektträger sanft. Verwenden kleine Streifen von Klebeband, um die vorderen und hinteren Kanten des Ohres auf den Stapel zu fixieren. </li><li> Schneiden Sie die Bauchhaut des Ohres entlang der Anthelix der Maus Ohrmuschel mit einem Skalpell. Mit Hilfe der gekrümmten Pinzette vorsichtig abziehen der ventralen Dermis und den Knorpel von den dorsalen Dermis, wo der Tumor überimpft wurde. Ziehen Sie die Bauchhaut und Knorpel mit einer gebogenen Pinzette, Freilegung der dorsalen Dermis. HINWEIS: Wenn die Hauptgefäße des Ohres abgeschnitten oder die Blutzirkulation nicht zu normalen Fluss innerhalb von 15 Minuten zurückkehren, sind das Ohr nicht für die Bildgebung verwendet werden. Immer nass halten das Ohr geöffnet Haut mit Ringer-Puffer und schützen die Feuchtigkeit durch die Verwendung eines Deckglases. </li><li> In Fall gibt es anhaltende Blutungen Form Tumorgefäßen, die Blutung zu stoppen durch Zugabe von 100 ulThrombin (5 U / ml) in Ringer-Puffer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 28 mM Natriumlactat) auf der Oberseite des Ohres für 5 min. </li><li> Zweimal waschen das Ohr mit etwa 5 ml Ringer-Puffer und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit sterilen Tüchern. Gleich mit dem nächsten Schritt fortfahren (nicht das offene Ohr trocknen lassen an einem beliebigen Punkt!). </li></ol> 3. Immunfluoreszenzfärbungen Verwendung Ringer-Puffer mit menschlichem Serum (1:10), Maus-sekundären Antikörper zu polyklonalem menschlichen IgG (1:50) und 125 IU / ml (2,5 mg / ml), Aprotinin (Blockierungspuffer) für alle Färbeschritte ergänzt. Aprotinin hemmt Plasmin Förderung Koagulation ersten Blutung, die nach der Operation auftreten können, zu begrenzen. <ol><li> Falten Sie den Teil des Ohres mit den offenen Lederhaut in die Eminentia Muscheln und trocknen die äußeren Ohr ungeöffnet Dermis mit sterilen Tüchern. Immobilisieren das Ohr auf dem Stapel der Glasträger durch Aufbringen von 0,5 ul chirurgischen Klebstoff auf den vorderen und hinteren Handrückenl Kanten. Dann sanft glätten die Rücken Ohr Dermis auf das Glas. </li><li> Gelten primären Antikörper gegen extrazelluläre Matrixmoleküle bei einer Konzentration von 10 ug / ml in einem Gesamtvolumen von 100 &amp;mgr; l Blockierungspuffer zu der exponierten Ohres. Decken Sie das Ohr mit einem Deckglas, um die Farblösung zu verhindern, um auf den Ohrrändern trocknen. Inkubation: 15 min. Zweimal waschen das Ohr mit etwa 5 ml Ringer-Puffer. </li><li> Anwendung geeigneter sekundärer Antikörper oder Streptavidin-Konjugate (Fluorophore mit einem hohen Anregungswellenlänge wie 594 nm oder 647 nm günstig für intravitalen Imaging sind) in einer Konzentration von 10 ug / ml in einem Gesamtvolumen von 100 &amp;mgr; l Blockierungspuffer zu der exponierten Ohres. Decken Sie das Ohr mit einem Deckglas und Inkubation für 15 min. Zweimal waschen das Ohr mit etwa 5 ml Ringer-Puffer. </li></ol> 4. Wechselwirkung von Blut übertragene Aktiv Splenozyten mit Tumorzellen in situ <ol><li> 7 Tage nach inoculation von GFP-B16-F10 Melanom auf der Rückenhaut kongenen Maus, das Tier einschläfern zu sammeln und die Milz. Isolieren Splenozyten mit mechanischen Störung der Milz durch eine 70 um Zellsieb. </li><li> Etikett Splenozyten für 8 min bei 37 ° C mit roten CMTPX Zytoplasma-Färbung (1 &amp;mgr; M in PBS), wasche 4 Mal in 15 ml bei 4 º C und sofort mit 200 &amp;mgr; l serumfreiem Medium zu injizieren, in die Schwanzvene der Maus, deren Ohren B16-F10-GFP 7 daysearlier inokuliert. </li></ol> 5. Intravital Imaging mithilfe eines Stereomikroskop <ol><li> Für kurzfristige Bildgebung (bis zu 2 Stunden), fügen frisch zubereitet sterile die Ascorbat-Ringer-Puffer mit 140 mM Natriumascorbat, 10 mM HEPES, 4 mM KCl und 5 mM CaCl 2, bei einem pH-Wert von 7,5 (des Ascorbat-Ringer-Puffer endgültige Osmolarität 320 mOsM) auf der Oberseite des immobilisierten Ohr. Decken Sie das Ohr mit einem Deckglas und starten Bildgebung mit Hilfe eines Fluoreszenz-Stereomikroskop mit 2X Objektiv. </li><li> Für die Langzeitabbildungs(Mehr als 2 Stunden), setzen Sie den Ausgang einer Nadel (bis zu einem Reservoir, das die Ascorbat-Ringer-Puffer angeschlossen) unter dem Deckglas, ca. 0,5 cm vom Ohr weg. Verwenden eine peristaltische Pumpe mit einer Geschwindigkeit von 1 ml / min zu liefern, die ständig Ascorbat-Ringer-Puffer in die Kammer unter dem Deckglas. </li><li> Ändern Sie den 1X-Objektiv (Arbeitsabstand 6 cm) 2X Objektiv (Arbeitsabstand 2 cm). Öffnen Sie die Erfassungssoftware und konfigurieren Sie die Einstellungen des Fluoreszenzstereomikroskop. In der Kamera-Einstellungen wählen, wie 12-Bit-Farbtiefe des Bildes und stellen Sie die Kamera Palette von Grauwerte von 0% (Minimum) bis 5,1% (maximal) eingestellt und Gamma-Korrektur zu 2. <ol><li> Stellen Erwerb Verstärkung auf 1 (Minimum), Fluoreszenz-Intensität bis 1000 (maximal), Vergrößerung 280X-320X einstellen und die Belichtungszeit vermeidet Über-oder Unterbelichtung (Belichtungszeit sollte weniger als 1 Sekunde sein). Abhängig von der Anzahl der Abbildungsbereiche (üblicherweise 10 bis 20) das Zeitintervall für die Erfassungszyklus gesetzt werden kannschen 1 bis 2 min. Kürzen Zeiten können die Bleich-und Phototoxizität führen. </li></ol></li><li> Wählen mehrere Felder, die Tumorzellen als auch gefärbten ECM Proteine ​​(wie in Fig. 3) enthalten. Mit dem Motortisch erwerben Bilder der geeigneten Fluoreszenzkanäle (wie GFP-Fluorophor und 647 in Abbildung 3) über die Zeit (zB alle 2 Minuten). </li><li> Nach dem Experiment mit der Maus einschläfern nach institutionellen Tier Richtlinien. In diesem Fall wird am Ende des Experiments euthanize anästhesierten Maus durch zervikale Dislokation gefolgt durch Ausbluten (intrakardiale Perfusion). </li></ol> 6. Intravital Imaging mithilfe eines Multiphotonen-Mikroskop <ol><li> Verwendung von Silikonfett, bauen eine kreisförmige Wand von ca. 2 cm Durchmesser und 2-3 mm Höhe um das Ohr, beginnend an der Basis des Ohrs. Stellen Sie sicher, es gibt keine undichten Stellen. Füllen Sie den Kreis mit der Ascorbat-Ringer-Puffer. </li><li> Bewegen Sie die Mausauf der Bühne und schließen Sie das Heizkissen (37 ° C). </li><li> Offene Erfassungssoftware und konfigurieren Sie die Einstellungen der Multiphotonen-Mikroskop. </li><li> Wählen, bis zu vier verschiedene Bereiche, die Tumorzellen und Bunt ECM Proteine ​​(wie in Fig. 3) enthalten. In diesem Beispiel stimmen die Ti-Saphire Laser bis 850 nm für GFP-Signal ein nachfolgendes Einzelphotonen 647 für Fluorophor 647 und Färbung visualisiert fibrillären Kollagene mit SHG. Erwerben Sie Bilder der geeigneten Fluoreszenzkanäle (wie GFP-Fluorophor und 647 in Abbildung 3) und der zweiten Harmonischen mit der Zeit, z. B. alle 2 min, mit Wasser Eintauchen HCX APO 20X mit 1,00 NA Objektiv und 2 mm Arbeitsabstand. </li><li> Nach dem Experiment euthanize anästhesierten Maus mit zervikale Dislokation gefolgt durch Ausbluten (intrakardiale Perfusion). </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Bedeutung Hier präsentieren wir eine neue Intravitalmikroskopie Ansatz, der hohen Auflösung und dynamische Visualisierung von verschiedenen Gewebemikrokomponenten, einschließlich fibrillären sowie netzartige Matrixproteinen ermöglicht. Dieses Verfahren hat mehrere Vorteile gegenüber aktuellen Intravitalbildgebenden Verfahren: (i) Intravital-Fluoreszenz-Bildgebung hat in der Mikrozirkulation Studien verwendet wurde, um beispielsweise gelösten Austritt aus Blut-oder Lymphgefäße in die Spur, hat aber nicht mit Immunfärbung kombiniert. (Ii) Die Verwendung von gentechnisch veränderten Reporter Mäusen ermöglicht spezifische Zelltypen abgebildet werden soll, erfordert aber ihre Verfügbarkeit (oder erhebliche Anstrengungen, um neue zu schaffen) und begrenzt die Anzahl von interagierenden Zelltypen, die untersucht werden können. (Iii) Die extrazelluläre Matrix kann in vivo unter Verwendung von zweiten Harmonischen dargestellt werden, aber diese Technik kann nur faserige Kollagen zu erfassen, wobei eine große Anzahl von wichtigen extrazellulären Komponentenwie Basalmembranen, Fibronektinen, Tenascine, Wachstumsfaktoren, Chemokine und Gewebe Glykosaminoglykane außerhalb der Reichweite für die aktuelle Forschung. Unser Verfahren überwindet diese Einschränkungen und können Standard-Bildgebungstechniken eingearbeitet und weiter kombiniert mit Immunfärbungen für andere Zelltypen, Gewebestrukturen, Ablagerungen von Heparinsulfat-bindenden Wachstumsfaktoren (z. B. VEGF 26) und Chemokinen (CCL21 und 5,18 zeigt. 2D ) oder extrazellulären Matrixproteinen und gleichzeitig Tracking Blut und / oder lymphatischen fließt. Begrenztheit Die Epi-Fluoreszenz-Bildgebung von Intravital IF ist auf die dünnen Hautlappen, der dicke Unterhaut (Fettgewebe) beraubt begrenzt. Während wir festgestellt, dass die dorsalen Ohr Dermis ist optimal für die relativ harmlosen chirurgischen Darstellung der Ohrhaut, Epi-Fluoreszenz mit Intravital IF-Technik ist nicht auf Ohr Dermis beschränkt und könnte möglicherweise zu z. B. angewendet werdendie freigelegte Haut der Zehen oder der Rückenhaut des neugeborenen Maus. Rapid-Antikörper-Färbung (15 Minuten) in der Immunfluoreszenz IF hängt nicht passive Diffusion, sondern erfordert funktionelle Lymphdrainage und interstitielle Strömung, damit keine Färbung beobachtet, wenn Lymphgefäße 27 verschlossen werden. Im Einklang mit dem, Lymphgefäße Fleck stärker als undichte Blutgefäßsystem (verletzt Gefäße, Arteriolen) 5. Die Trennung des dorsalen und ventralen Hautlappen Ohr ist ein mildes chirurgische Verfahren aber eine Schädigung einigen Kapillaren und Zelltod zu verschiedenen Gewebezellen. Dies könnte ein Problem sein, wenn man völlig intaktem Gewebe zu untersuchen, z. B. Blick auf die milde Wirkung von Drogen auf das Überleben der Zellen benötigt. Auch der Einsatz von Antioxidantien, die die Haut vor Phototoxizität und Photobleaching Schutz dient schließt die Verwendung von Intravital-Immunfluoreszenz-Technik, um z. B. das Gewebe oxidativen Stress oder Stickstoffmonoxid-biologisch studiereny. Schließlich Verblindung der Gewebe Makrophagen mit Immunkomplexe können diese Zellen und Einfluss z. B. die Untersuchung von Gewebeimmunantwort und Aktivierung dendritischer Zellen zu aktivieren. Änderungen und Fehlersuche Um Gewebe oxidativen Stress oder Stickstoffmonoxid Biologie Studie hat Ascorbat mit anderen gewebeverträglichen Medien, die nicht mit dem experimentellen Ausgangs stört ersetzt werden. Ebenso sollten Blockierungs Fc-Rezeptoren auf dermalen Immunzellen vermieden werden, wenn das Ziel der Untersuchung ist die Funktion und Aktivierung des Gewebeimmunantwort und dendritischen Zellen-Aktivierung und Migration. Dies kann mit der Verwendung sekundärer Antikörper mit Fc-Fragment gespalten (F (ab) 2-Antikörperfragmente) oder die Verwendung von biotinylierten Antikörpern und Streptavidin als Fluoreszenznachweisreagenzien durchgeführt werden. Zukünftige Anwendungen Wir präsentieren eine neue und einzigartige innerVital IF-Technik für Bild in nicht-fibrillären Komponenten der extrazellulären Matrix in transplantierbaren Hauttumoren in Kombination mit SHG-erkannt fibrillären Kollagene und gereift mit Zwei-Photonen-Mikroskopie. Einer der Vorteile der Verwendung von Multi-Photonen-(oder konfokale) Mikroskopie über Epi-Fluoreszenz-Bildgebung ist z-Stapeln Möglichkeit und in der Folge räumliche Co-Lokalisation von Ereignissen innerhalb der extrazellulären Matrix auftreten, z. B. Tumor Intravasation in Lymph-oder Blutgefäße, die im Falle von Standard Epifluoreszenzmikroskopie kann nur von morphologischen Veränderungen der Zelle eindringenden abgeleitet werden. Diese Technik besitzt viel breiteres Potential. Zum Beispiel haben wir die intravital verwendet werden, wenn der Mechanismus der Okklusion von lymphatischen lymphatischen spezifische photodynamischen Therapie 27 zu untersuchen. Weitere mögliche Anwendungen dieser Verfahren beinhalten, sind aber während der Entzündung, Mechanismus der Transplantatabstoßung oder Methoden von Blut und Lymphe nicht auf die Untersuchung von Haut Immunität beschränkt<html> tischen Gefäßwachstum während der Tumorgenese. Kritische Schritte in dem Verfahren Der wichtigste Schritt, die kritische Auswirkungen für die Aufrechterhaltung eines physiologischen Gewebeumgebung weist eine chirurgische Trennung der Bauchhaut und Knorpel von dorsal Dermis. Schneiden oder Verschließen der großen Arterie oder Vene wird auf übermäßige Blutungen und lokale Gewebehypoxie führen, die zelluläre Reaktion auf Behandlungen und Zellbewegung 8 beeinflussen. Immobilisierung das Ohr mit chirurgischen Klebstoff sollte mit Vorsicht, da verschüttet den Kleber auf aussetzen Gewebe durchgeführt werden wird eine dauerhafte Schädigung des Gewebes führen durch Verschluss von Blutgefäßen. Die Temperatur der Maus muss kontrolliert und bei 37 ° C gehalten werden, Zusätzlich muss befeuchteten Sauerstoff zu der Isofluran-Narkose verwendet werden, so dass die Augen und Lungen bleiben richtig während des Experiments befeuchtet. Außerdem muss Natriumascorbat frisch hergestellt werden und ihr pH vor der Verwendung überprüft. ntent &quot;&gt; Zusammenfassend überbrückt diese Immunfluoreszenz-Intravitalechtzeit, lokale Messungen der physiologischen Funktion mit der molekularen Bildgebung komplexer zellulärer Ereignisse in der Mäusehaut. Außerdem hat diese Methode ein großes Potential, da es leicht zu zB post-Entwicklungsstudie angewendet werden Mechanismen der Blut-und Lymph-Angiogenese-oder die frühen Phasen der Infektion der Haut durch verschiedene Krankheitserreger Mit seiner Flexibilität und Hochdurchsatz-Potenzial visualisieren., kann diese Technik Intravital deutlich um mehrere Felder der Biologie beitragen.

Intravital-Bildgebung von entzündlichen, metastatischen und Matrix-Umbauprozesse ist ein wichtiger Bereich der Forschung und hat die Schaffung von zahlreichen transgenen Mausmodellen Reporter, die fluoreszierende Proteine ​​exprimieren 1,2 motiviert. Aufgrund out-of-focus Fluoreszenzsignale, die Bildqualität zu verringern und Grenzen Lichteinfall durch das Gewebe, ist Bild dicke Gewebe nur mit konfokaler oder Multi-Photonen-Scanning-Mikroskopie 3 möglich. Verwendung schneller, weniger kostspielig und komplex Epifluoreszenzmikroskopie nur mit nahezu zweidimensionalen Geweben wie Huhn Chorioallantoismembran 4 oder Mäuseohr Dermis 5 möglich. Die meisten Bildgebungssysteme nutzen transgenen Mäusen, die verschiedene fluoreszierende Proteine ​​in einer Zelltyp-spezifische Weise. Auch wenn diese Proteine ​​bieten schwachen Phototoxizität induzieren sie Immunantwort 6. Ferner ist es schwierig, zwischen spezifischen Zelltypen zu wechseln oder zu markieren dieir basale oder aktivierten Zustände als solche Änderung erfordert die Herstellung einer neuen genetischen Modells. Zusätzlich, wie fluoreszierende Proteinexpression wird allgemein intrazellulären Kompartiment beschränkt, ist es meist nicht möglich, die Bildextrazelluläre Strukturen wie Basalmembran-Proteinen oder Gewebeeinlagen 7 Chemokin. Stattdessen indirekte Markierung mit Antikörpern gegen die extrazelluläre Antigene bietet Flexibilität für nahezu jeden Zelltyp-spezifische Komponente oder Matrix 8,9. Jedoch ist der Hauptnachteil dieser Markierungsmethode mit Immun durch Antigen-Antikörper-Immunkomplexe, Komplement-System-abhängige Zelltoxizität und Phagozytose von Zellen und extrazellulären Strukturen 10 auslösen kann vermittelten verbunden. Die extrazelluläre Matrix der Tumor-Mikroumgebung, sondern auch von normalem Gewebe während einer Entzündung oder Wundheilung, erfährt erhebliche Umgestaltung. Stromal Versteifung der Tumor-Mikroumgebung kann promote Tumorwachstum und Invasion durch Stress-induzierten Signalmechanismen und die Ursache Umbau des Blut-und Lymphgefäße 11. Allerdings ist die Live-Darstellung von Matrixproteinen zu fibrillären Kollagene, die mit Multi-Photonen-Mikroskopie durch Erzeugung der zweiten Harmonischen detektiert werden kann begrenzt. Kürzlich wurde ein neues Intravitalbildgebendes Verfahren, das Risiko von Photo-und Immun-toxische Schädigung abzubildenden Zellen und Gewebestrukturen 5 minimiert veröffentlicht. Im Vergleich mit etablierten bildgebenden Verfahren, wo die einzige Runde der kontinuierlichen intravital Visualisierung in einem Bereich von 30 Minuten bis 2 Stunden 12-17, unsere Intravital-Immunfluoreszenz (IF)-Technik erlaubt 12 Stunden (Langzeit-8)-Bildgebung. Es ist wichtig zu beachten, dass die Aufnahmezeit ist auf 12 Stunden wegen Grenzen in unserem Tier Protokoll definiert beschränkt, aber es gibt keine technischen Gegenanzeigen, dass es nicht verlängert werden kann, wenn kritische Gesundheitsparameter des Tieres, wie Blutdruck und HerzRate gesteuert 8. Zusätzlich wird durch Verwendung eines automatisierten Fluoreszenz-Stereomikroskop konnten wir Bilder aus den verschiedenen Bereichen in einem einzigen Experiment sammeln und beobachtet seltene immunologische und Umbauprozesse, die im physiologischen Kontext der durch funktionelle Blut-und Lymphgefäße unterstützt Haut aufgetreten. Da die stereo Linse eine relativ große, 2 cm, Arbeitsabstand im Gegensatz zum Zwei-Photonen-mikroskopische Optik nicht verdampfenden Wasserlagerung erfordern, wurde langfristig Abbildungs ​​nur unter Fluoreszenz-Stereomikroskop durchgeführt. Intravital wenn erlaubt die Immun Markierung und zum Nachweis jeder Komponente der extrazellulären Matrix der normalen Haut. Das Design dieser Technik basiert auf dem innovativen Konzept der Verwendung von Immunfärbung für lebende Zellen und Gewebematrixelemente auf chirurgisch freigelegt Maus Dermis, ohne dass schädliche immunotoxizität 5 basiert. Das chirurgische Verfahren selbst ist sicher an der DermisGefäßsystem, wie es nur auf der Trennung von zwei Hautschichten im Ohr, die unabhängig voneinander innerviert werden, autonom durch Blut zugeführt und durch getrennte Kreisläufe abgeführt lymphatischen beruht. Unser Versuchsaufbau ermöglicht die Abbildung von einer Reihe von wichtigen pathophysiologischen Ereignisse über mindestens 12 Stunden, einschließlich Leukozyten Handel zwischen Blut-und Lymphgefäße und Wundheilungsprozesse. In der ursprünglichen Veröffentlichung, verglichen wir unsere Technik zu State-of-the-art-Standards in verschiedenen Bereichen der Intravital-Bildgebung. Folglich beobachten wir Blutgefäß Extravasation und lymphatischen Intravasation Ereignisse durch verschiedene Arten von Leukozyten, darunter die einzigartige Visualisierung von Immunzellen Eingabe Sammeln statt der erwarteten Anfangs Lymphgefäße 15. Außerdem ergänzen die Beobachtungen von anderen Gruppen 9,18 getan, fanden wir, dass in vivo CCL21 ist in der Lage, um starke, diskontinuierliche Einlagen auf das Sammeln aber nur selten auf initialen Lymphgefäße bilden. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Hier beschreiben wir eine modifizierte Intravital-IF-Technik, die mit Zwei-Photonen-Mikroskopie in Kombination mit dem Netzwerk der fibrillären Kollagene mit Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) zu erkennen. Wir zeigen, dass dieses Verfahren auch für die Bildgebung Invasion von Krebszellen im Rahmen der dynamischen Tumor-Mikroumgebung, die Matrixmoleküle wie Tenascin C, die von aktuellen Bildgebungstechniken 19 weitgehend unerforscht sind, umfasst werden. Wir fanden, dass die fibrillären Matrix des Tumors, wobei die zweite Harmonische detektiert, nimmt verschiedene Stellen der Tumormikroumgebung als die neu abgelagerte Matrix aus Tenascin C zusammen Ferner beschreiben wir Beispiele Gefäß Umbau von lokalen Matrixkontraktion verursacht, lang Ausdruck (12 Stunden) Abbildung von T-Zell-Interaktion mit Tumorzellen und Tumorzellmigration auf Kollagen IV der Basalmembran. Solche Ereignisse können abgebildet werden, während gleichzeitig die Aufnahme lokale physiologische Parameter wie Blutgefäß permeability und Lymphdrainage.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="966">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Mice Strain</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">BALB/C mice (8-12 weeks )</td>
			<td style="width:159px;">Charles River&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Orleans,France</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">C57/Bl6 Mice (8-12 weeks )</td>
			<td style="width:159px;">Harlan&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Carshalton UK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Cell Line&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">B16 F10 Melanoma expressing OVA-GFP&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Anesthesia Maintenance&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Isofluorane&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Minrad Inc.&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2222</td>
			<td>Minrad Inc., Buffalo, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Humidified delivery system&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Rothhacher GmBH&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Berne, Switzerland&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">DC Temperature Control System&#160;</td>
			<td style="width:159px;">FHC Inc&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Bowdoin, MA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Stereomicroscope&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Fluorescence stereomicroscope with a motorized stage .</td>
			<td style="width:159px;">M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:515px;">&#160;1&#215; lens (linear system magnification from 7.5&#215; to 160&#215;)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Leica Microsystems CMS GmbH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:515px;">2&#215; lens (linear system magnification from 15.6&#215; to 320&#215;)</td>
			<td style="width:159px;">Leica Microsystems CMS GmbH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:515px;">DFC 350 FX camera controlled by LAS AF software&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Leica Microsystems CMS GmbH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Multiphoton Microscopy&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">LEICA SP5, two-photon multiplier, motorized stage&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Leica Microsystems CMS GmbH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCX APO 20x/1.2 oil immersion&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chameleon Ultra Laser&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Reagents&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:515px;">Ringer&#39;s buffer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM sodium lactate)</td>
			<td>B. Braun Medical AG</td>
			<td align="right">445968</td>
			<td>Sempach, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Aprotinin&#160;</td>
			<td>Elastin</td>
			<td>AP92</td>
			<td>Owensville, MO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Thrombin&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7326-1KU&#160;</td>
			<td>Taufkirchen, Germany&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium ascorbate</td>
			<td style="width:159px;">Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td>11140-50G&#160;</td>
			<td>Taufkirchen, Germany&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Mouse Serum raised against human IgG&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Abcam&#160;</td>
			<td>ab34834&#160;</td>
			<td>Cambridge, UK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Collagen IV&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB6581</td>
			<td>Cambridge, UK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Perlacan&#160;</td>
			<td style="width:159px;">RnD&#160;</td>
			<td>ab79465&#160;</td>
			<td>Minneapolis, MN</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Tenascin C&#160;</td>
			<td style="width:159px;">RnD&#160;</td>
			<td>AF3358</td>
			<td>Minneapolis, MN</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Podoplanin</td>
			<td style="width:159px;">RnD&#160;</td>
			<td style="width:119px;">AF3244</td>
			<td>Minneapolis, MN</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">LYVE-1&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Reliatech&#160;</td>
			<td>103-PA50&#160;</td>
			<td>Wolfenb&#252;ttel, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">CCL21</td>
			<td style="width:159px;">RnD</td>
			<td style="width:119px;">AF457</td>
			<td>Minneapolis, MN</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Streptavidin Pacific Blue&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td>S11222</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Streptavidin Alexa 647&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td>S21374</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Streptavidin Alexa 488&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S11223</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Donkey Anti Goat 594&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td>A21113</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Donkey Anti Rabbit 594&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td>A21207</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">CMTPX CellTracker</td>
			<td style="width:159px;">Lifetechnologies</td>
			<td style="width:119px;">C34552</td>
			<td>Carlsbad, California</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Histocryl (surgical glue)</td>
			<td style="width:159px;">Braun Aesculap</td>
			<td style="width:119px;">1050060</td>
			<td>Tuttlingen, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Cell Culture Reagents&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>E15-843&#160;</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>25300062</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">PBS&#160;</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term intravital immunofluorescence imaging of tissue matrix components with epifluorescence and two-photon microscopy

Abgesehen davon, dass eine physikalische Gerüst Gewebemorphologie beizubehalten, wird die extrazelluläre Matrix (ECM) aktiv bei der Regulierung der Zell-und Gewebefunktion während der Entwicklung und Homöostase beteiligt Organ. Es tut dies, indem über biochemische, biomechanische und biophysikalische Signalwege, wie zum Beispiel durch die Freisetzung von bioaktiven ECM-Protein-Fragmente handelt, die Regulierung Gewebespannung und die Bereitstellung Wege für die Zellmigration. Die extrazelluläre Matrix der Tumor-Mikroumgebung erfährt erhebliche Umgestaltung, gekennzeichnet durch den Abbau, Ablagerung und Organisation von fibrillärem und nicht-fibrillärem Matrixproteine. Stromal Versteifung der Tumor-Mikroumgebung kann das Tumorwachstum und Invasion zu fördern und dazu führen, Umbau des Blut-und Lymphgefäße. Live-Darstellung von Matrixproteine, zu diesem Punkt ist jedoch begrenzt auf fibrillären Kollagene, die mit Multi-Photonen-Mikroskopie durch Erzeugung der zweiten Harmonischen nachgewiesen werden können, so dass die Mehrheit der Matrixkomponenten largely unsichtbar. Hier beschreiben wir Verfahren zur Tumorimpfung in der dünnen Rückenohrhaut, Immunmarkierung von extrazellulären Matrixproteinen und intravitalen Bildgebung des exponierten Gewebes in lebenden Mäusen mit Epifluoreszenz und Zwei-Photonen-Mikroskopie. Unsere intravitalen Abbildungsverfahren ermöglicht die direkte Detektion von sowohl fibrillärem und nicht-fibrillärem Matrixproteinen im Zusammenhang mit einer zunehmenden Hauttumor. Wir zeigen Beispiele von Schiff Umbau von lokalen Matrix Kontraktion verursacht. Wir fanden auch, dass fibrilläre Matrix der mit der Erzeugung der zweiten Harmonischen detektiert Tumor ist räumlich getrennt von neu abgeschiedenen Matrixkomponenten wie Tenascin C Wir zeigten auch langfristig (12 Stunden) Abbildung von T-Zell-Interaktion mit Tumorzellen und Tumorzellen Migration entlang der Kollagen IV der Basalmembran. Zusammen genommen, erlaubt dieses Verfahren einzigartig für den gleichzeitigen Nachweis von Tumorzellen, deren physische Mikro und der endogenen Gewebeimmunantwort über die Zeit, die prov kannide wichtige Einblicke in die Mechanismen der Tumorprogression und möglichen Erfolg oder Therapieresistenz zugrunde liegen.

Bisher Immunfärbung in lebendem Gewebe normalerweise nicht aufgrund der Bildung von Immunkomplexen, die zu hohen Hintergrundfärbung und Immun 20 verwendet. Dies wurde durch Vorblockierstellung Fcy Rezeptoren auf Makrophagen Gewebe, also &quot;blendend&quot; diese Zellen, um nachfolgende starke indirekte Immunfärbung zu überwinden. Die Markierung wurde als extrazelluläre könnte Phototoxizität und Fluorophor Bleich durch Eintauchen des Gewebes in natürliches Antioxidans gepuffert isosmotische Ascorbinsäure (1A) gesteuert werden. Seit unserer ersten Beschreibung dieser Methode 5, verbesserten wir unsere Anti-Bleich-und anti-Technik, so dass phototoxische Photobleaching können jetzt nicht nur gesperrt werden, sondern vollständig verhindert (Abb. 1B). Dies wird durch Einbetten des Ohres in einer großen Menge an Antioxidationsmittel (100 &amp;mgr; l) in der Kammer, wo das Ohr immobilisiert geführt. Beachten Sie, dass 300 Sekunden konstanter Abbildungszeit entspricht zu 10 Stunden Bild wenn Bilderfür 500 ms jede Minute (die durchschnittliche Bildeinstellungen) gesammelt. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51388/51388fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51388/51388fig1.jpg" /> Abbildung 1. Photobleichen und Phototoxizität wurde durch Ersetzen Chlorid mit Ascorbat in Ringer-Puffer und die Einbettung der exponierten Ohr in 100 ul Volumen dieser Lösung gestoppt. (A) Das Gewebe wurde zunächst mit einem biotinylierten Antikörper gegen Collagen IV, der Bestandteil der Basalmembran gefärbt. Die Färbung wurde später mit Streptavidin-647 (rot) detektiert, und dann 300 Sekunden lang ständig entweder in normaler Ringer-Puffer (oben) oder Ascorbat-Ringer-(unteres Feld) abgebildet. Beachten Sie, dass 300 Sekunden konstanter Abbildungszeit entspricht 10 Stunden Bildgebung, wenn Bilder für 500 msec jeder Minute (die üblichen Bildeinstellungen) gesammelt. Der hellste 25% der pixel Intensitätswerte sind grün gefärbt. (B) Quantifizierung der Immunfluoreszenz-Zerfall (50% in Ringer-vs 0% im Ascorbat-Ringer). Die Werte wurden auf die Anfangsfluoreszenz normalisiert. Bilder mit Immunfluoreszenzstereomikroskop gesammelt. Maßstabsbalken in A, 100 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/51388fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Tumorzellen und Metastasen Tumorstromas ist entscheidend, um den Prozess der Tumorzellmigration und Tumorimmunität zu verstehen. Denn die Tumor-assoziierten Stroma bildet bis zu 90% der Tumormasse und regelt aktiv das Tumorwachstum und Metastasierung 21. Allerdings mechanistischen Einblick in die Matrix Laufwerke Tumorzellmigration in Richtung entweder Lymph-oder Blutgefäße fehlen 22. Dies ist teilweise auf die Tatsache zurückzuführen, dass im intravitalAlterung der Matrixproteinen an der Visualisierung gereift Fasern der fibrillären Kollagene mit Erzeugung der zweiten Harmonischen in der Zwei-Photonen-Mikroskopie 23 begrenzt. Daher passen wir unsere Methode zur Visualisierung von Gewebe-Mikroumgebung, einschließlich Blut-und Lymphgefäße, Perizyten, Nerven-, Muskel-und Fettzellen, die direkte Visualisierung von extrazellulären Matrixkomponenten umfassen. Viele Strukturen können auf der Grundlage ihrer Morphologie nach Immunfärbung für Basalmembran-Komponenten wie Kollagen IV oder Perlecan (2A), aber direkte Färbung für spezifische Zelloberflächenmarker, wie zB LYVE1 (Fig. 2B und C) und podoplanin unterscheiden (Abb. . 2C), ermöglicht eine weitere Unterscheidung Anfangs, Kapillar Lymphgefäße (LYVE1 +) aus lymphatischen Kollektoren (LYVE1 -). Färbung auf Matrix-gebundenen CCL21 in der Haut zeigte Vorkommen dieses Chemokin auf der Basalmembran der lymphatischen Sammler idemit der Färbung für perlecan, der Heparansulfat-Proteoglykan (2D) ntified. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51388/51388fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51388/51388fig2.jpg" /> 2. Beispiele für Lebendfärbung in einem normalen Mausohren. (A) Färbung für perlecan eine Basalmembran Komponente zeigt alle Blut-und Lymphgefäße, Nerven-, Muskel-und Fettzellen Fasern. (B) LYVE1 Färbung markiert den ersten Lymph-kapillaren Netzwerk. (C) Co-Färbung für LYVE1 und podoplanin, einem pan-lymphatische Marker, stellt Netzwerke der Aus-und Lymphgefäße sammeln. Die Rücken Ohr Dermis kann mit klassischen Epifluoreszenzmikroskopie (ohne optische Schnitte) als die Dermis Ohr abgebildet werden, hat eine geringe Anzahl von Fettzellen, die sonst das Bildfeld abdecken würde. (D) CCL21 stai<html> ning (grün) auf lymphatischen Basalmembran für perlecan (rot) gefärbt. Bilder mit Immunfluoreszenzstereomikroskop gesammelt. Maßstabsbalken in A und B, 1 mm; in C, 100 um und 50 um in D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/51388fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Am wichtigsten ist, strukturelle Proteine, die normalerweise nicht von SHG, dem klassischen Nachweisverfahren Matrix 23 festgestellt werden kann, kann sichtbar gemacht werden. Beispielsweise fanden wir, dass Tenascin C (Fig. 3A), die eine Matrix-Protein, das während der Tumorgenese exprimiert wird, wird die Wundheilung und Entzündungs ​​19 an verschiedenen Stellen des Tumorstroma als fibrilläre Kollagene (3B) abgeschieden. Diese Matrix kann Heterogenität von Tumorzellen und Metastasen Verteilung (Fig. 3C) zu beeinflussen. <html> t &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51388/51388fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51388/51388fig3.jpg" /> Abbildung 3. Die Rücken Ohr Dermis kann live mit Multi-Photonen-Mikroskopie abgebildet werden. Ein einzelnes Gebiet der Tumor B16-F10. Tumor-Stroma wurde mit Tenascin-C-Antikörper markiert und die Färbung wurde mit Anti-Ziege-594 Esel Antikörper nachgewiesen. Immunfluoreszenz von Tenascin C (rot) Netzwerk ist in A gezeigt und fibrillären Kollagene mit der zweiten Harmonischen (SGH) in B festgestellt. Diese zwei Netzwerke mit Tumorzellen (Cyan) in C (fusionierten) überlagert. Neue Tumor-Matrix durch Tenascin C markiert ist nicht mit fibrillären Kollagene mit SHG (grün) erkannt lappen. Das Bild mit 44, vier Mal gemittelt z-Schnitte mit z-Schritt 1,0 um wurde in 16 Bit Farbtiefe-Modus erworben. Bilder mit Zwei-Photonen-Mikroskop gesammelt. Maßstabsbalken, 100 um.ref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/51388fig3highres.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Nach der Immunmarkierung verschiedener Tumormatrixkomponenten (z. B. Tenascin C und Kollagen IV) der Tumormatrix wir konnten identifiziert beschränkt und plötzliche Ereignisse der Tumormatrix Richtungs Umbau (Video 1). Kräfte, die in Tumor-Mikroumgebung zu entwickeln kann die Expansion oder Kontraktion des Tumors Matrix und in Folge Umbau und die Dehnung des Tumorgefäßsystems in einem ähnlichen Ausmaß zu führen, wie wir zuvor im Falle der Wundheilung 11,24 gezeigt. Video 1. Erweiterung der Tumor-Matrix mit Kollagen IV (rot) und Tenascin C (Cyan) länglich Blutgefäße (Pfeil) und passiv translozieren drei Tumorzellen (grün) markiert. Lokalisierte Kontraktion teascin C-reiche Matrix translozieren Tumorblutgefäße (rot horizontal ausgerichtete Strukturierunge) während 12 Stunden Abbildungs ​​etwa 100 &amp;mgr; m. Bilder mit Immunfluoreszenzstereomikroskop gesammelt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/Video1_New.avi" target="_blank">Klicken Sie hier, um Video anzusehen.</a> Verwendung von Multi-Photonen-Mikroskopie mit Fluorophor Kennzeichnung ist problematisch, da Photonenfluss in diesen Experimenten verwendet werden schnell zu bleichen Fluoreszenzfarbstoffen, die nicht vom Oxidations 25 geschützt sind. Hier zeigen wir, dass wir Zwei-Photonen-Zeitraffer-Mikroskopie durchführen können, während gleichzeitig die Abbildung immun Tenascin C-Matrix mit minimalem Photobleaching der Fluorophore auch in Zwei-Photonen-Mikroskopie hohe Photonendichte (Video 2). Video 2. Low-Level-Photobleaching von Tenascin C Immunfluoreszenz (rot) während der Zwei-Photonen-Mikroskopie. B16-F10-GFP Tumorzellen (cyan) wurden in der offenen Rücken Ohr 9 Tage nach der Impfung abgebildet. Das Fluoreszenzsignal wurde durch Anwendung der Ascorbat-geschütztRinger-Puffer auf dem abgebildeten Gewebe. Erzeugung der zweiten Harmonischen (grün) nicht mit neuen Matrix von Tenascin C 16-Bit-Farbtiefe mit 11 viermal gemittelten Z-Profilen mit Z-Stufe 1,9 um wurde für 15 min entsprach dem lappen. Die Bilder wurden alle 1 Minute 5 Sekunden 6 z-Ebenen gesammelt gesammelt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/Video2.avi" target="_blank">Klicken Sie hier, um Video anzusehen.</a> Zudem abgebildet Immunzellinteraktionen mit metastatischen Tumorzellen. CMTPX-markierte Splenozyten aus einer tumortragenden Maus 8 Stunden nach der Transfusion von iv Tumor-assoziierten Blutgefäße Extravasaten Invasion der Tumormatrix und mit Tumorzellen aktiv durch Bildung dauerhafte Zellkontakte (Video 2) interagiert. Fluorophor-647-markierten Kollagen IV-Strukturen waren resistent gegen Ausbleichen während der 12-Stunden-Bildgebung. Video 3. Interaktion von CMTPX-markierte Splenozyten von Tumor (B16-F10)-bZipfel Maus mit einzelnen Tumorzellen (GFP-B16-F10). Splenozyten wurden nach iv Gewebe Färbung für Kollagen IV transfundiert. Collagen IV-grün (647), Splenozyten-rot (CMTPX), B16-F10 Cyan (GFP). Bilder mit Immunfluoreszenzstereomikroskop gesammelt. Videodauer 12 Stunden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/Video3-corrected.mov" target="_blank">Klicken Sie hier, um Video anzusehen.</a> Frisch isolierte Tumorzellen wurden auf den freiliegenden Dermis Ohr für Kollagen IV vorgelagert gefärbt. Wir konnten beobachten, dass nach dem zu dem Gewebe haften einige Gruppen von Zellen gestartet kollektive Migration entlang Basalmembran von Blutgefäßen und Adipozyten. Video 4. Tumorzellen wandern entlang Basalmembran. Normale Haut Ohren für Kollagen IV (647, rot) gefärbt wurde mit frisch agiert B16 F10-GFP-Zellen überschichtet und für 5 Stunden abgebildet. Einige Tumorzellen, die Gewebe eingehalten gestartet kollektive Migration entlangBasalmembran der Blutgefäße und Fettzellen. Bilder mit Immunfluoreszenzstereomikroskop gesammelt. Videodauer:. 5 Stunden <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/Video4.avi" target="_blank">Klicken Sie hier, um Video anzusehen.</a> Auch, weil die Ohr Dermis praktisch zweidimensionalen, wir leicht sammeln könnten große Datenmengen unter Verwendung der schnellen Fluoreszenz-Stereomikroskopie, statt langsamer und teurer oder konfokale Multiphotonenmikroskopie. Es ist jedoch auch möglich, eines der genannten Scanning-Mikroskopie-Methoden mit unserer Intravital verwenden IF Zubereitungen (Abb. 3, Video 1).

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Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

Die extrazelluläre Matrix unterliegt erheblichen Umbau während der Wundheilung, Entzündung und Tumorgenese. Wir präsentieren einen neuartigen Ansatz Intravital-Immunfluoreszenz-Mikroskopie, die Dynamik der Fibrillen sowie netzartige Matrix-Komponenten mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung mit Epi-Fluoreszenz-oder Zwei-Photonen-Mikroskopie visualisieren.

Langzeit-Intravitalimmunfluoreszenz-Imaging von Gewebematrix Bestandteile mit Epifluoreszenz und Zwei-Photonen-Mikroskopie

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

long-term-intravital-immunofluorescence-imaging-tissue-matrix

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.9K Aufrufe.  École Polytechnique Fédérale de Lausanne.  Die extrazelluläre Matrix unterliegt erheblichen Umbau während der Wundheilung, Entzündung und Tumorgenese. Wir präsentieren einen neuartigen Ansatz Intravital-Immunfluoreszenz-Mikroskopie, die Dynamik der Fibrillen sowie netzartige Matrix-Komponenten mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung mit Epi-Fluoreszenz-oder Zwei-Photonen-Mikroskopie visualisieren. 

Serie: Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Berührungslose, Label-freie Überwachung von Zellen und extrazellulären Matrix mittels Raman-Spektroskopie

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Forschung

Biotechnik

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Erstellen Adhesive und löslichen Farbverläufe for Imaging Cell Migration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

Die Multi-Organ Chip - Ein Mikrofluidik-Plattform für langfristige Multi-Gewebe Cokultur

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

Langfristige Live Imaging-Gerät für verbesserte experimentelle Manipulation von Zebrafischlarven

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.

Eine neuartige Tenorrhaphy-Nahttechnik mit tissue engineered Collagen Graft zur Reparatur großer Sehnendefekte

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualisierung von Adhäsion Bildung in den Zellen durch erweiterte Spinning-Disk-Total Internal Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

Pankreasgewebe-abgeleitete extrazelluläre Matrix Bioink für den Druck 3D-Zell-Laden Pankreasgewebe Konstrukte

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Ein einfacher mikrofluidischer Chip für Langzeitwachstum und Bildgebung von Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

Im lebenden Organismus Bildgebung von biologischem Gewebe mit kombinierter Zwei-Photonen-Fluoreszenz und stimulierter Raman-Streumikroskopie

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Highly-Multiplexed Tissue Imaging with Raman Dyes

Visualizing a vast scope of specific biomarkers in tissues plays a vital role in exploring the intricate organizations of complex biological systems. Hence, highly multiplexed imaging technologies have been increasingly appreciated. Here, we describe an emerging platform of highly-multiplexed vibrational imaging of specific proteins with comparable sensitivity to standard immunofluorescence via electronic pre-resonance stimulated Raman scattering (epr-SRS) imaging of rainbow-like Raman dyes. This method circumvents the limit of spectrally-resolvable channels in conventional immunofluorescence and provides a one-shot optical approach to interrogate multiple markers in tissues with subcellular resolution. It is generally compatible with standard tissue preparations, including paraformaldehyde-fixed tissues, frozen tissues, and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) human tissues. We envisage this platform will provide a more comprehensive picture of protein interactions of biological specimens, particularly for thick intact tissues. This protocol provides the workflow from antibody preparation to tissue sample staining, to SRS microscope assembly, to epr-SRS tissue imaging.

Electronic pre-resonance stimulated Raman scattering (epr-SRS) imaging of rainbow-like Raman dyes is a new platform for highly multiplexed epitope-based protein imaging. Here, we present a practical guide including antibody preparation, tissue sample staining, SRS microscope assembly, and epr-SRS tissue imaging.

Highly-Multiplexed Tissue Imaging mit Raman-Farbstoffen

Visualizing a vast scope of specific biomarkers in tissues plays a vital role in exploring the intricate organizations of complex biological systems. ...