MT wird von einem Doktoranden-Stipendium [ref unterstützt. 092839/Z/10/Z] und CR von einem New Investigator Award [ref. 095623/Z/11/Z] aus dem Wellcome Trust.

1. Optional: Bereiten Affi-Gel-Heparin-Beads (Perlen Gel) für FBM Art Assay HINWEIS: Bereiten Gelperlen mindestens 1 Tag vor Beginn der Explantation Verfahren. <ol><li> Waschen 100 ul Gel-Heparin Perlensuspension mit sterilem PBS für 20 min auf einer Walze bei Raumtemperatur (RT). </li><li> Pellet Kügelchen in einer Tischzentrifuge 5 min bei 13.000 x g. In sterilem PBS und wiederholen Sie den Waschvorgang 4x. </li><li> Nach dem letzten Waschen, entfernen PBS und genießen Sie die Perlen in einem kleinen Volumen einer sterilen Lösung, die das rekombinante Protein der Wahl enthält, kümmert sich um die Perlen mit der Lösung abzudecken. Dieses Protokoll verwendet 100 ng / ul rekombinanten humanen VEGF165 in PBS, um eine zuvor veröffentlichte Experiment 16 zu reproduzieren. </li><li> Die Gel-Heparin-Kügelchen, die mit dem rekombinanten Protein-Lösung für mindestens 12 Stunden und höchstens 1 Woche auf einer Walze Inkubieren bei 4 ° C. </li></ol> 2. Beschichtung von Kultureinsatzs Hinterhirn Explantate werden auf Corning Kultur kultiviert fügt mit einem 8 um Porengröße oder entsprechende Einsätze. Kultureinsätze können nach Abschluss des Protokolls wieder verwendet werden, sofern sie mit destilliertem Wasser gewaschen, mit Ethanol sterilisiert und in 70% Ethanol bis zum Gebrauch gelagert. HINWEIS: Die folgenden Schritte sollten in einem Strömungshaube unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. <ol><li> Vorbereitung Explantat Kulturmedien aus Neurobasalmedium mit B27 (20 ul / ml) ergänzt, Glucose (6 mg / ml) und Penicillin / Streptomycin (5 ug / ul). </li><li> Waschkultur-Inserts mit sterilem PBS für 5 min und trocken für 5-10 min unter der Flow-Haube. </li><li> Legen Sie ein Kultureinsatz in jede einzelne Vertiefung einer 12well Platte. Hinweis: Einsätze können einen kleinen Push-to-fest in die gut passen müssen. </li><li> Decken Sie die Kultureinsätze mit 10-20 pg / ml Maus-Laminin in Neurobasalmedium und legen Sie sie in einem Brutschrank (37 ° C, 5% CO <sub&gt; 2) für 1 Stunde. Hinweis: Beschichtung sollte am Tag der Explantation vorgenommen werden. </li></ol> 3. Dissektion der Hindbrains von E11.5 Maus Embryonen <ol><li> Cull zeitlich schwangere Frau Maus mit einer ethisch genehmigten Verfahren an embryonalen Tag (E) 11,5 und legen die Gebärmutter, die die Embryonen in einer 100-mm-Kunststoffschale mit eiskaltem L15 Medium. HINWEIS: Alle Dissektion Schritte müssen in eiskaltem L15 durchgeführt werden. </li><li> Mit einem Binokular und Dumont Uhrmacherpinzette Nummer 5, reißen die Uterusmuskulatur Wand, um die Embryonen aussetzen, lassen jeden Embryo, die Nabelschnur durchtrennen und entfernen Sie vorsichtig den Dottersack. </li><li> Mit einem Kunststoff Pasteur-Pipette mit einem Weitbohrungsöffnung, jeder Embryo zu übertragen in eine saubere Plastikschale mit eiskaltem L15. </li><li> Mit Dumont Pinzetten, enthaupten den Embryo direkt über den Vordergliedmaßen. Wenn das Experiment erfordert Genotypisierung der Embryonen, sammeln Gewebeproben für die Isolierung genomischer DNA (z. B. eine kleine piece der Dottersack oder Schwanzspitze 16,20). </li><li> Drehen Sie den Kopf Rückenseite und identifizieren die 4. Herzkammer, die von einer dünnen Gewebeschicht (2B) abgedeckt ist. Sorgfältig durchbohren die roofplate und beginnen, es kaudal entlang der Mittellinie über den hinteren Hinterhirn und Rückenmark abzulösen und rostral über das Mittelhirn. Rautenhirn sollte nun ausgesetzt werden (Fig. 2C). </li><li> Sorgfältig necken das verbliebene Kopfmesenchyms und keine Hirnhäute, die der Pia-Seite des Hinterhirn (Abbildung 2D) befestigt sind. </li><li> Entfernen Mittelhirn und Rückenmark, so dass das Hinterhirn entfaltet und flach in einem offenen Buch Vorbereitung (2E) liegen. </li><li> Mit einem Weit Bohrung Kunststoff Pasteur Pipette jede seziert Hinterhirn zu einer 12-Well-Platte mit eiskaltem L15 und speichern sie auf Eis, bis alle hindbrains wurden seziert. </li><li> Mit einem Weit Bohrung Kunststoff Pasteur Pipette eine Sündegle Hinterhirn in eine leere Schüssel, halten sie ein offenes Buch Vorbereitung, ventrikuläre Seite nach oben in einem Tropfen ca. 100 ul L15. </li><li> Bringen Sie ein paar Mikroliter der Heparin-Gel inkubiert Perlen auf die gleiche Tröpfchen. Hinweis: Da die Größen der Perlen sind variabel, empfiehlt es sich, rund 10 Perlen Transfer und wählen Sie dann eine optimale Größe für die Transplantation in den Hinterhirn. </li><li> Machen Sie einen kleinen Riss in der Hinterhirn Gewebe und vorsichtig einführen 1-3 Gel-Kügelchen in der Hinterhirn Gewebe auf der Ebene der r5 / 6, etwa auf halbem Weg zwischen der Mittellinie und der Seitenkante des Hinterhirn, Senken sie in das Gewebe, so dass die Perle wird direkt unter der Oberfläche positioniert Hinterhirn. HINWEIS: Die Dissektion Verfahren kann zwischen 5-20 min / Hinterhirn dauern, je nach Erfahrung und kann sich über einen längeren Zeitraum zu strecken, wenn Würfe groß sind, in jedem Fall, hindbrains sollte in der Kultur nicht länger als 3 Stunden post mortem für das Gute sein Ergebnisse. </li></ol> 4. HinterhirnExplantation Kultur <ol><li> Entfernen Sie die Platte mit den Kultureinsätze aus dem Inkubator, saugen Sie den Laminin-Beschichtungslösung. </li><li> Legen Sie ein Kultureinsatz in eine separate Kulturschale mit eiskaltem L15 und gefüllt, mit einem breiten Kunststoff-Bohrung Pasteur Pipette jede Hinterhirn Bauchseite nach oben auf der Kultureinsatz (2G). Das Hinterhirn sollte auf den Einsatz Membran vollständig flach liegen. </li><li> Heben Sie die Kultureinsatz aus der Schüssel und tupfen Sie es mehrmals auf saubere Seidenpapier, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Dieser Prozess stellt sicher, dass das Hinterhirn hält sich an die Kultureinsatz in einem flachen, offenen Buch Vorbereitung. Wenn das Hinterhirn rollt sich, kann seine Gewebe irreversibel zusammen wachsen. </li><li> Füllen Sie den ursprünglichen 12-Well-Platte mit 500 ul vorgewärmtes Kulturmedien und setzen Sie den Einsatz wieder in das gut. Die Lautstärke mit einem anderen 400-600 ul Medium, um nur die Hinterhirn decken vorsichtig einstellen, so dass die Hinterhirn nicht schwimmenAus der Membran. Wenn es schwimmt, kehren Sie zu Schritt 4.4 und wiederholen, bis das Hinterhirn bleibt an der Membran angebracht. </li><li> In diesem Stadium ist es möglich, biologische Inhibitoren von Interesse für die Medien zu ihrer Wirkung auf die Migration von FBM Neuronen zu untersuchen. HINWEIS: Wenn die Implantation Perlen oder anderen Behandlungen verabreicht, ist es empfehlenswert, mindestens zwei Steuer Explantate unter normalen Wachstumsbedingungen pro Experiment, um zu gewährleisten, dass das Experiment wurde erfolgreich eingerichtet. </li><li> Explantate Inkubation für 24-30 h in einem Brutschrank (37 ° C, 5% CO 2). </li></ol> 5. Wholemount Immunfluoreszenz-Färbung der Hinterhirn Explantate <ol><li> Saugen Sie das Medium aus jedem Well gründlich in PBS und fixieren für 2 Stunden bei 4 ° C unter leichtem Schütteln in eiskaltem 4% Formaldehyd (frisch zubereitet oder frisch aufgetauten 4% Paraformaldehyd in PBS gelöst). Hinweis: Versuchen Sie nicht, aus dem Hinterhirn Kultureinsatz vor der Fixierung entfernenist abgeschlossen. </li><li> 3x mit PBS spülen. Die hindbrains Sie vorsichtig von den Kultureinsätze mit Dumont Pinzette. Einige Explantate sind schwer zu schälen, kann aber in der Regel durch sanften Druck durch immer wieder vertreiben PBS aus einer Pipette abgehoben werden. </li><li> Übertragen Sie die hindbrains bis 2,0-ml-Rundrohre für Immunfluoreszenz-Kennzeichnung. Durchdringbar hindbrains für 30 min bei Raumtemperatur (RT) in PBS, enthaltend 0,1% Triton X-100 (PBT) mit sanften. </li><li> Inkubation für 1 h bei RT in PBT mit 10% hitzeinaktiviertem normalem Ziegenserum mit sanften. </li><li> Explantate mit sanften Inkubation bei 4 ° C für 5 Tage mit primärer Antikörper, der für ISL1, 1:100 in PBT mit 1% hitzeinaktiviertem normalem Ziegenserum. </li><li> Waschen Sie die Explantate bei RT 4x mit PBT für 15 min je. </li><li> Explantate mit sanften Inkubation bei RT für 3 h mit Fluorophor-konjugierten Ziege-Anti-Maus-Antikörper (z. B. Alexa Fluor 488 Ziege antiMaus, 1:200 verdünnt) in PBT mit 1% hitzeinaktiviertem normalem Ziegenserum. </li><li> Waschen Sie die Explantate 4x bei RT mit PBT für 15 min mit je sanften. </li><li> Postfix die Explantate in 4% Formaldehyd für 30 Minuten bei RT. </li><li> Decken einen Glasobjektträger mit 3 Lagen schwarzem Isolierband und Verbrauch mit einem Skalpell eine kleine Quadrat der Schichtband, um eine Tasche für den Explantaten zu erstellen, alternativ, verwenden Sie eine Depression Glasträger. </li><li> Montieren Sie jede Hinterhirn in Slowfade Reagenz in einer Tasche und mit einem Deckglas sorgfältig vermieden, um Lufteinschlüsse und Bild unter Verwendung eines konfokalen Laserrastermikroskop. HINWEIS: Als Alternative zu Immunfärbung in situ Hybridisierung mit Ribosonden, die FBMs (dh Isl1 oder PHOX2B) erkennen kann zum FBM Neuronen 16,21 visualisieren. </li></ol> Zusammenfassung der Schritte und die Zeit Zeitgesteuerte Paarung E11.25 Schwangerschaften zu erhalten: ~ 14 Tage Optional: Bead Vorbereitung (Protocol 1): ~ 2 Stunden, am Tag vor der Embryo Isolation Bereiten Kultureinsätze und Medien (Protokoll 2): ​​~ 30 min, vor dem Embryo Isolation Embryo Isolation und Hinterhirn-Dissektion (Schritte von 3,1 bis 3,4): ~ 10 min / Embryo Hinterhirn-Dissektion (Schritte von 3,5 bis 3,7): ~ 5-10 min / Hinterhirn Explantation Verfahren (Schritte von 3,8 bis 3,9): ~ 5-10 min / Hinterhirn Optional: Perle Implantation (Schritte 3,10-3,11): ~ 5-10 min / Hinterhirn Explantatkultur (Schritt 4.7): 24 h Fixierung für Antikörperfärbung (Schritt 5.1): 2 Stunden Färbeverfahren und Bildgebung (Protokoll 5): 5 Tage

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Keiner der Autoren konkurrierenden Interessen oder Interessenkonflikte.

Dieses Protokoll beschreibt die Wholemount Kultur von E11.5 Maus hindbrains in einem Transwell-Systems, um die Migration von FBM Neuronen zu untersuchen. Dieses Protokoll ermöglicht hindbrain Motoneuronen der Maus für einen Zeitraum von 24 Stunden am Leben und Migration gehalten werden, wodurch ex vivo-Manipulation. Dieses Verfahren besitzt zahlreiche Vorteile für experimentelle Forscher versucht, die molekularen und zellulären Mechanismen der neuronalen Migration zu identifizieren. Während traditionelle Migrationsassays Explantation kleinen Nervengewebe in Stücke Matrix auf Kulturschalen ermöglichen Beobachtung einzelner Neuronen, wie sie auf exogene Stimuli zu reagieren, ein Hauptvorteil der Transwell-Assay ist seine Eignung für die Migration Neuronen innerhalb der Wirtsorgan Umgebung beeinflussen und damit eine weitere physiologischen Kontext. Wichtig ist, dass Stoffe ohne weiteres an die Ex-vivo-Hinterhirn-Explantate angewandt, um ihre Wirkung auf die neuronale Migration zu testen, Umgehung möglichen Nebenwirkungen in Verbindung gebracht werden mit administeRing, die diese Stoffe zu einer schwangeren Maus. Schließlich erlaubt die Ex-vivo-Modell auch die Prüfung von Stoffen, die die Plazentaschranke, wie funktionsblockierende Antikörper nicht kreuzen. Aufgrund dieser Vorteile bietet die ex vivo-Kultur hindbrain eine alternative und ergänzende Methode zur Verwendung von Zebrafisch-Embryonen, die mit wasserlöslichen niedermolekularen im Aquarienwasser oder in utero Elektroporation der embryonalen Gehirn, was den Einsatz von Spezial erfordert behandelt werden können, Ausrüstung und ist schwieriger zu beherrschen als der hier beschriebenen Kulturverfahren. Ein weiterer Vorteil des hier beschriebenen Protokolls ist dessen Eignung für das Implantieren Perlen in rekombinantes Protein oder andere Reagenzien eingeweicht, so dass deshalb die Anwendung eines Hühnerembryos entwickelt, um zu einem Mausmodell der neuronalen Migration manipulieren Standard embryologischen Verfahren. Insbesondere kann der Ex-vivo-Kulturmodell zu hindbrains von gentechnisch veränderten Mäusen angewandt werden defekttive in spezifischen Molekülen in der neuronalen Wanderung beteiligt, wie z. B. Wachstumsfaktor-Rezeptoren oder Führung, und mit Wulst Implantate zu testen, ob Reaktion auf Liganden verloren. Zusätzlich zu pharmakologischen Manipulation kann die ex vivo-Kulturverfahren auch geeignet ist, um Expressionsvektoren, die die Expression von Genen von Interesse manipulieren könnte Elektroporation werden, geeignete Verfahren für die Elektroporation wurden zuvor beschrieben 22,23. Dieses Protokoll kann auch angepasst, um Neuronenmigration durch Zeitraffer-Mikroskopie in der Hinterhirn Explantate von transgenen Mäusen enthält fluoreszenzmarkierten FBM Neuronen, z. B. Isl1-Cre visualisieren; Rosa26Yfp 21. Schließlich kann dieses Protokoll auch verwendet werden, um andere Arten von migrierenden Neuronen im Hinterhirn, wie diejenigen, die den unteren Olive bilden studieren, was allerdings die Verwendung von hindbrains bei älteren embryonalen Stadien erfordern und Kultur für bis zu 48 Stunden benötigen, abhängig von neuronalen Lebensfähigkeit <em&gt; Ex vivo. Kritische Schritte und Fehlersuche Für den Erfolg dieses Protokolls ist es entscheidend, dass die Embryonen werden früh am Tag E11.5, E11.25 näher an, wenn FBM Neuronenmigration hat gerade erst begonnen gesammelt. Allerdings ist es nicht immer möglich, Embryonen auf dieser Entwicklungsstufe fangen aufgrund der natürlichen Variabilität Paarung von Mäusen, und dementsprechend kann es eine gewisse Variabilität in der Umfang der FBM Migration zwischen verschiedenen Experimenten. Variabilität in FBM Migration kann auch beobachtet, wenn das Experiment nicht innerhalb des Zeitrahmens zugeordnet abgeschlossen, etwa 3 h, wie in Fig. 3E zu sehen ist. Hinterhirn Gewebe von Maus-Embryonen E11.25 ist zart. Bei der Analyse und in dem Explantat Verfahren ist es wichtig, das Hinterhirn Gewebe im Bereich von R4-R6, in dem die FBM Zellen befinden nicht reißen. Wegen der empfindlichen Natur der dissbschnitt Prozess, und weil die Geschwindigkeit, mit der hindbrains werden in Kultur genommen beeinflusst Ergebnis, könnte das Verfahren nehmen ein paar Trainingsläufe zu meistern, insbesondere vor der kostbaren Proben oder Reagenzien verwendet werden. Schließlich ist es wichtig, dass das Hinterhirn Gewebe in einem offenen Buch-Konfiguration auf dem Kultureinsatz gelegt, weil Falten des Hinterhirn Gewebe während der Kultur wird die normale FBM Migration zu verhindern (siehe Abbildung 3F).

Embryonale Neuronen sind in der ventrikulären Zone des Gehirns geboren, aber anschließend wandern zu neuen Zielen, um geeignete Zielregionen, die in großer Entfernung befinden, zu erreichen. Die korrekte Positionierung der neuronalen Zellkörper an geeigneten Stellen entlang der dorso-ventralen und anterior-posterioren Achse des sich entwickelnden Gehirns ist für die korrekte Verdrahtung, das Überleben und die Funktion dieser Nervenzellen nach dem Migrationsstufe 1-4. Ähnlich wie die molekularen Mechanismen, die Axon Führung 5-7 zu steuern, werden die kombinatorische Gruppen von anziehenden und abstoßenden Signale gedacht, um die Migration Neuronen 1,8 führen. Jedoch aufgrund der Wechselwirkungen von mehreren Zelltypen, die Signale, die neuronale Migration wurden weniger intensiv untersucht als die in Axon Führung, die Zelle autonom untersucht werden können beteiligt. Die Entwicklungshinterhirn von Wirbeltieren in mehreren jüngsten Studien verwendet worden, um die molekularen und zellulären Mechanismen zu verstehenneuronaler Migration, zum Beispiel in Hühner, Maus und Zebrafisch 1-4,9. Dieses Organ enthält verschiedene Arten von Neuronen, einschließlich mehrerer Subtypen precerebellar und motorischen Neuronen 5,7,10,11. Hinterhirn Motoneuron in der ventrikulären Zone in der Nähe der Bodenplatte geboren, und sie in bestimmte Untergruppen zu differenzieren nach ihren Herkunfts Rhombomer 1,12. Die Gesichts branchiomotor (FBM) Neuronen in Rhombomer (r) 4 im Hinterhirn erzeugt und erweitern ihre Axone dorsal durch eine r4 Austrittspunkt in den zweiten Kiemenbogen, um die Gesichtsmuskeln 2,9,13 innervieren. FBM Neuronen des Zebrafisch und Maus bieten hervorragende Modelle, um die molekularen und zellulären Mechanismen der neuronalen Migration in einem Prozess, der leicht visualisiert studieren, weil diese Neuronen transloziert reproduzierbar ihre Somata in einer raumzeitlich klar definierten Prozess. Bei Mäusen, FBM Neuronen ersten migrieren cautrödeln durch r5 und dann sowohl kaudal und ventral bis zu ihrer endgültigen Position auf der Pia-Seite des Hinterhirn im Gebiet der r6, wo sie die gepaarten Kerne der VII. Hirnnerv (VIIn) 10,11,14 bilden erreichen. Im Zebrafisch, FBM Neuronen zunächst ventral wandern und ändern Sie dann Richtung bei der R4-R5 Grenze weiterhin die Migration in Richtung der Pia-Oberfläche in einer Laminin-abhängige Weise 4,12,15,16. Diese Migration verläuft über einen Zeitraum von mehreren Tagen in der Entwicklung und in Phasen der tangentialen und radialen Migration unterteilt werden, die eine Identifizierung von Molekülen, die diese beiden unterschiedlichen Prozesse vermitteln. Im Gegensatz dazu sind die FBM Neuronen des embryonalen Hühnerhinterhirn bleiben in R4 3,13,17-19. Während der Migration können FBM Neuronen identifiziert werden, wie andere Arten oder motorischen Neuronen, die durch ihre Expression des Transkriptionsfaktors homoeodomain Insel 1 (ISL1) 14. So wholemount Immunfluoreszenz-Färbung oder in-situ-Hybridisierung für diesen Marker in verschiedenen Entwicklungsstadien zeigt die deutliche Migrationsstrom von FBM Zellkörper, der sich von R4 bis R6 im Zebrafisch oder der Maus 4,15,16. Darüber hinaus haben fluoreszierende transgenen Reporter wie ISL1-GFP als geeignete Werkzeuge zur Visualisierung der Migration FBM Neuronen in Zebrafisch 3,17-19 verwendet. Neben ihrer Eignung für die Bildgebung haben viele Forscher die Migration von Neuronen bei der Entwicklung FBM Zebrafisch untersucht, weil ihre frei lebenden Embryonen kann leicht mit Zelltransplantation Techniken und pharmakologischen Verbindungen direkt an das Aquarienwasser angewendet manipuliert werden. Im Gegensatz dazu entwickelt sich der Maus-Embryos in der Gebärmutter umgeben, dass dadurch der Implantation von Perlen Buchführungssignale oder die Verwaltung von funktionsblockierende Antikörper, die die Plazentaschranke nicht kreuzen. Darüber hinaus können pharmakologische Verbindungen zu der schwangeren Mutter verabreicht haben ungewünschte Nebenwirkungen, die Embryogenese indirekt beeinträchtigen können. Diese Einschränkung zu umgehen, haben wir ein ex vivo-Kulturverfahren für die gesamte Hinterhirn der Maus, die mit FBM Neuron Migration und Überleben für 24 Stunden nach der Explantation 7,16 kompatibel ist, entwickelt. Dieses Verfahren ermöglicht eine einfache pharmakologische Manipulation Implantation Kügelchen mit Führungssignale oder die Verabreichung von funktionsblockierende Antikörper und auch geeignet ist, die Migration von anderen neuronalen Subtypen im Hinterhirn in verschiedenen Entwicklungsstadien zu untersuchen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="575">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Eppendorf round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock)</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">211-2120</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Cell culture plates, 12 well</td>
			<td style="width:111px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;">150628</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Plastic cell culture dish, 100 mm</td>
			<td style="width:111px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;">150288</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">15 mm Netwell insert with Mesh Polyester Membrane</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:104px;">3477</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Watchmaker forceps, no. 5</td>
			<td style="width:111px;">Dumont</td>
			<td style="width:104px;">91150-20</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">P4417</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Laminin mouse protein</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">23017-015</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">Primary antibody, Isl1</td>
			<td style="width:111px;">Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:104px;">39.4D5</td>
			<td style="width:147px;">Dilution 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">AlexaFluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">A11029</td>
			<td style="width:147px;">Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">21103</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">B27 supplement (50x)&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">17504-044</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Leibovitz&#8217;s L-15</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">21083-027</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Penicillin/ streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">15070</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Glucose</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">101174Y</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Heat-inactivated goat serum</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">G9023</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">T8787</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">P6148</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Slowfade Antifade Kit</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">S-2828</td>
			<td style="width:147px;">Alternative mounting solutions may be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">631-0912</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Cover glass</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">631-0137</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">Affi-Gel Heparin Beads</td>
			<td style="width:111px;">Biorad</td>
			<td style="width:104px;">153-6173</td>
			<td style="width:147px;">Glass, latex, or coloured beads may be used alternatively</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:215px;">Recombinant human VEGF165</td>
			<td style="width:111px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:104px;">293-VE</td>
			<td style="width:147px;">Resuspend in PBS, store aliquots at -80oC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Stereo Microscope, Leica MZ16</td>
			<td style="width:111px;">Leica</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Confocal laser scanning microscope&#160; LSM710</td>
			<td style="width:111px;">Zeiss</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse hindbrain ex vivo culture to study facial branchiomotor neuron migration

Embryonale Neuronen sind in der ventrikulären Zone des Gehirns geboren, aber anschließend wandern zu neuen Zielen, um geeignete Ziele zu erreichen. Die Entschlüsselung der molekularen Signale, die kooperativ zu führen neuronalen Migration im embryonalen Gehirn ist daher wichtig zu verstehen, wie die komplexen neuronalen Netzwerke zu bilden, die später unterstützt postnatale Leben. Gesichts branchiomotor (FBM) Nervenzellen in der Maus-Embryo-Hinterhirn wandern von Rhombomer (r) 4 kaudal die gepaarten Gesichts Kerne in der r6 abgeleiteten Bereich der Hinterhirn bilden. Hier bieten wir ein ausführliches Protokoll für wholemount ex vivo Kultur von Maus-Embryo hindbrains geeignet ist, die Signalwege, FBM Migration regulieren zu untersuchen. In diesem Verfahren werden hindbrains von E11.5 Mausembryonen in einem offenen Buch Vorbereitung auf Zellkultur-Einsätzen für 24 h präpariert und kultiviert. Während dieser Zeit wandern FBM Neuronen kaudal hin R6 und können funktionsblockierende Antikörper und molecul ausgesetzt werdenes in den Kulturmedien oder Heparin Perlen mit rekombinanten Proteinen geladen, um Rollen für Signalwege in Führungs neuronalen Migration verwickelt zu untersuchen.

Dieser Abschnitt veranschaulicht Beispiele von Ergebnissen, die durch das Studium FBM Neuronenwanderung im Hinterhirn der Maus durch ex vivo-Kultur erhalten werden können. Wir zeigen, dass die Neuronen im FBM explantiert hindbrains von Tag 11 Maus-Embryonen zunächst eine tangentiale Migration (3A) unterziehen und dann damit beginnen, die Gesichts motorischen Kerne (3B), ähnlich wie ihr Verhalten in utero (siehe Abbildung 1) zu montieren. Wir zeigen weiter, daß die Implantation eines VEGF165-getränkten Wulst zieht FBM Neuronen (Fig. 3C und 3D), wie zuvor gezeigt 16. Wichtig ist, ermöglicht dieses Protokoll Studium FBM Migration in Abwesenheit der Blutgefäße oder Behälter abgeleitete Faktoren, die FBM Migration in utero beeinflussen kann, da der nicht-perfundierte Gefäß degeneriert in Kultur 16. Somit wird, wenn mit der Maus-Antikörper ISL1 auf frisch beobachtet die unspezifische Blutzellmarkierungisolierten Maus hindbrains (Fig. 1) nicht mehr in Rautenhirn Gewebe vorhanden Nach 24 Stunden in Kultur (Fig. 3A-F). Schließlich zeigen wir zwei Beispiele, die nicht korrekt hindbrains explantiert wurden und enthalten FBM Neuronen in einem abnormalen Verteilung daher, entweder weil das Hinterhirn wurde nicht früh genug nach dem Embryo Trennung (3E) oder explantiert, weil das Hinterhirn Gewebe in der Transwell gefaltet ( 3F). <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51397/51397fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51397/51397fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. FBM Neuronenmigration Konfokale Z-Stapel von Wildtyp-Maus hindbrains nach ISL1 wholemount Immunomarkierung und flatmounting;.. Rautenhirn Mittellinie ist mit einem Stern auf allen Seiten angezeigt (A) ventrikuläre Oberfläche eines E11.5 Hinterhirn in die<html> Gebiet mit ISL1 FBM-positiven Neuronen (Pfeil) zeigen ihre tangentiale Migration von R4 bis R6;. die Position von R4, R5 und R6 angegeben ist (A &#39;) Pia-Oberfläche einer Hälfte derselben Rautenhirns in der Umgebung, die die Anlage . von einer der gepaarten Kerne FBM (mit VIIn angegeben), wie auch andere ISL1-positiven Neuronen-Populationen (B) ventrikuläre Oberfläche eines E12.5 hindbrain FBM enthält Neuronen, die tangential migrieren (Pfeil), wobei die Pfeilspitze zeigen ein Beispiel eines Blutgefäßes enthält zirkulierenden Zellen unspezifisch durch Kreuzreaktion des Anti-Maus-Sekundär-Antikörper verwendet, um die ISL1 Maus-IgG-Antikörper nachzuweisen markiert sind. (B &#39;) Pia-Oberfläche einer Hälfte derselben E12.5 Hinterhirn, das enthält einer der gepaarten Kerne FBM. Die Mittellinie ist mit einem Stern in jeder Tafel angegeben. Maßstabsbalken (alle Panels): 200 um. V, ventrale, P, Pia./ 51397fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Ansicht. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51397/51397fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51397/51397fig2.jpg" /> 2. E11.5 Maus Hinterhirn Dissektion und Ex-vivo-Kultur. (A) Head 1 mm des Embryos, nachdem es von dem Rest des Embryos bei forelimb Ebene geschnitten (B) Die rostralen Teil der: Maßstab; (AE) Schlüsselschritte in der E11.5 Hinterhirn Dissektion Protokoll.. Kopf wurde entfernt, und der Rest des Kopfes Gewebe so positioniert, dass der 4. Ventrikel (Pfeil) wurde nach oben ausgerichtet. (C) Das Dach des 4. Ventrikels wurde abgezogen und das Hinterhirn wurde durch Abziehen Gewebe unter der Hinterhirn entfernt ausgesetzt rostral und kaudal. (D) Die Pia-Membran wurde entfernt (beachten Sie, dass in diesem Ex-ausreichend, einige Halsmark (SC) Gewebe an der Hinterhirn befestigt geblieben ist). (E) Überschüssiges Hirn (MB) und des Rückenmarks (SC) Gewebe entfernt worden ist, nur die Hinterhirn erhalten. (F) Kultur-Inserts wurden mit beschichteten Laminin und in eine 12-Well-Gewebekulturplatte gelegt. (G) Jedes Hinterhirn wurde auf einen Einsatz gegeben und mit Medien abgedeckt. (H) Schematische Darstellung des Weges durch die Migration FBM Neuronen (blau) während 24 Stunden der Kultur gemacht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51397/51397fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Fig. 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51397/51397fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51397/51397fig3.jpg" /> 3. Maus-Hinterhirn ex vivo Kultur. (A, B) Ein E11.5 Hinterhirn war für 24 h kultiviert und immunofluoresc<html> hängig für ISL1 FBM Neuronenwanderung in einem Explantat illustrieren markiert, beide Ventrikel (A) und Pia (B) Seiten der Rautenhirn gezeigt sind (C, D) E11.5 Wurf hindbrains wurden in der Gegenwart von Heparin implantiert Wulst getränkten kultiviert. in PBS (C) oder VEGF 165 (D); FBM beachten Sie, dass Neuronen in Richtung und auf die VEGF165 Wulst migriert und die wandernde Strom daher weiter ausgebaut kaudal im Vergleich zu der unbehandelten Seite der gleichen Hinterhirn oder Hinterhirn, das die Steuer Wulst (E. , F) Beispiele für unbefriedigend E11.5 hindbrain Explantaten, wobei FBMs nicht von r4 wandert (E), oder in denen das Hinterhirn Gewebe während der Kultur (F) gefaltet. Die Mittellinie ist mit einem Stern in jeder Tafel angegeben. Maßstabsbalken (für alle Panels): 200 um. V, ventrale, P, Pia.&quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

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Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonale Neuronen sind in der ventrikulären Zone des Neuralrohrs geboren, aber wandern, um geeignete Ziele zu erreichen. Gesichts branchiomotor (FBM) Neuronen sind ein nützliches Modell zur neuronalen Migration zu studieren. Dieses Protokoll beschreibt die wholemount ex vivo Kultur von Maus-Embryo hindbrains zu Mechanismen, die FBM Migration regulieren zu untersuchen.

Maus-Hinterhirn<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur zu Gesichts Branchiomotor Neuron Migrationsstudie

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

mouse-hindbrain-ex-vivo-culture-to-study-facial-branchiomotor-neuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

11.1K Aufrufe.  University College London.  Embryonale Neuronen sind in der ventrikulären Zone des Neuralrohrs geboren, aber wandern, um geeignete Ziele zu erreichen. Gesichts branchiomotor (FBM) Neuronen sind ein nützliches Modell zur neuronalen Migration zu studieren. Dieses Protokoll beschreibt die wholemount ex vivo Kultur von Maus-Embryo hindbrains zu Mechanismen, die FBM Migration regulieren zu untersuchen. 

Serie: Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

Ex vivo Live-Imaging von Single Cell Divisionen in Maus Neuroepithel

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted area of the brain, neural stem cells proliferate and constantly generate neuroblasts that migrate tangentially in chains along the rostral migratory stream (RMS) to reach the olfactory bulb (OB). Once in the OB, neuroblasts switch to radial migration and then differentiate into mature neurons able to incorporate into the preexisting neuronal network. Proper neuroblast migration is a fundamental step in neurogenesis, ensuring the correct functional maturation of newborn neurons. Given the ability of SVZ-derived neuroblasts to target injured areas in the brain, investigating the intracellular mechanisms underlying their motility will not only enhance the understanding of neurogenesis but may also promote the development of neuroregenerative strategies.
This manuscript describes a detailed protocol for the transfection of primary rodent RMS postnatal neuroblasts and the analysis of their motility using a 3D in vitro migration assay recapitulating their mode of migration observed in vivo. Both rat and mouse neuroblasts can be quickly and efficiently transfected via nucleofection with either plasmid DNA, small hairpin (sh)RNA or short interfering (si)RNA oligos targeting genes of interest. To analyze migration, nucleofected cells are reaggregated in &#39;hanging drops&#39; and subsequently embedded in a three-dimensional matrix. Nucleofection per se does not significantly impair the migration of neuroblasts. Pharmacological treatment of nucleofected and reaggregated neuroblasts can also be performed to study the role of signaling pathways involved in neuroblast migration.

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Neuroblast migration is a crucial step in postnatal neurogenesis. The protocol described here can be used to investigate the role of candidate regulators of neuroblast migration by employing DNA/small hairpin RNA (shRNA) nucleofection and a 3D migration assay with neuroblasts isolated from the rodent postnatal rostral migratory stream.

Nucleofection von Nagerneuroblasten zu Neuroblast Migrationsstudie<em&gt; In-vitro-</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Ex-vivo-Bildgebung von Postnatale Kleinhirn-Körnerzellmigration mittels konfokaler Makros

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

Low-Density Primäre Hippocampus Kultur

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded forebrain neuroepithelium is not amenable to wholemount analysis to examine organ-wide neurogenesis patterns. Moreover, defining the mechanisms of forebrain neurogenesis is not necessarily predictive of neurogenesis in other parts of the brain; for example, due to the presence of forebrain-specific progenitor subtypes. The mouse hindbrain provides an alternative model for studying embryonic neurogenesis that is amenable to wholemount analysis, as well as tissue sections to observe the spatiotemporal distribution and behavior of neural progenitors. Moreover, it is easily dissected for other downstream applications, such as cell isolation or molecular biology analysis. As the mouse hindbrain can be readily analyzed in the vast number of cell lineage reporter and mutant mouse strains that have become available, it offers a powerful model for studying the cellular and molecular mechanisms of developmental neurogenesis in a mammalian organism. Here, we present a simple and quick method to use the mouse embryo hindbrain for analyzing mammalian neural progenitor cell (NPC) behavior in wholemount preparations and tissue sections.

This article demonstrates how the mouse embryonic hindbrain can be used as a model for studying developmental neurogenesis in both whole organ and tissue section preparations.

Die Maus Hinterhirn als Modell für die Erforschung embryonaler Neurogenese

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

Ein alternativer Ansatz zur primären Ereignissen in Neurodegeneration mit Ex Vivo Ratte Gehirnscheiben studieren

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Facial Nerve Surgery in the Rat Model to Study Axonal Inhibition and Regeneration

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial nerve can be manipulated along its entire length, from its intracranial segment to its extratemporal course. There are three primary types of nerve injury used for the experimental study of regenerative properties: nerve crush, transection, and nerve gap. The range of possible interventions is vast, including surgical manipulation of the nerve, delivery of neuroactive reagents or cells, and either central or end-organ manipulations. Advantages of this model for studying nerve regeneration include simplicity, reproducibility, interspecies consistency, reliable survival rates of the rat, and an increased anatomic size relative to murine models. Its limitations involve a more limited genetic manipulation versus the mouse model and the superlative regenerative capability of the rat, such that the facial nerve scientist must carefully assess time points for recovery and whether to translate results to higher animals and human studies. The rat model for facial nerve injury allows for functional, electrophysiological, and histomorphometric parameters for the interpretation and comparison of nerve regeneration. It thereby boasts tremendous potential toward furthering the understanding and treatment of the devastating consequences of facial nerve injury in human patients.

This protocol describes a reproducible approach to facial nerve surgery in the rat model, including descriptions of various inducible patterns of injury.

Gesichtsnervenchirurgie im Rattenmodell zur Untersuchung der axonalen Hemmung und Regeneration

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial ...

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and cardiac arrest are remarkably sexually dimorphic diseases, and both induce cerebral ischemia. However, progress in understanding the vascular cognitive impairment, and then developing sex-specific treatments, has been partly limited by challenges in investigating the brain microcirculation from mouse models in functional studies. Here, we present an approach to examine the capillary-to-arteriole signaling in an ex vivo hippocampal capillary-parenchymal arteriole (HiCaPA) preparation from mouse brain. We describe how to isolate, cannulate, and pressurize the microcirculation to measure arteriolar diameter in response to capillary stimulation. We show which appropriate functional controls can be used to validate the HiCaPA preparation integrity and display typical results, including testing potassium as a neurovascular coupling agent and the effect of the recently characterized inhibitor of the Kir2 inward rectifying potassium channel family, ML133. Further, we compare the responses in preparations obtained from male and female mice. While these data reflect functional investigations, our approach can also be used in molecular biology, immunochemistry, and electrophysiology studies.

The present manuscript details how to isolate hippocampal arterioles and capillaries from the mouse brain and how to pressurize them for pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Ex Vivo Druck hippocampal Kapillare-Parenchymale Arteriole Vorbereitung für die funktionelle Studie

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using calcium as a proxy for neuronal activity, these techniques provide a way to monitor the responses of individual cells within large neuronal ensembles to a variety of stimuli in real time. We, and others, have applied these techniques to image the responses of individual geniculate ganglion neurons to taste stimuli applied to the tongues of live anesthetized mice. The geniculate ganglion is comprised of the cell bodies of gustatory neurons innervating the anterior tongue and palate as well as some somatosensory neurons innervating the pinna of the ear. Imaging the taste-evoked responses of individual geniculate ganglion neurons with GCaMP has provided important information about the tuning profiles of these neurons in wild-type mice as well as a way to detect peripheral taste miswiring phenotypes in genetically manipulated mice. Here we demonstrate the surgical procedure to expose the geniculate ganglion, GCaMP fluorescence image acquisition, initial steps for data analysis, and troubleshooting. This technique can be used with transgenically encoded GCaMP, or with AAV-mediated GCaMP expression, and can be modified to image particular genetic subsets of interest (i.e., Cre-mediated GCaMP expression). Overall, in vivo calcium imaging of geniculate ganglion neurons is a powerful technique for monitoring the activity of peripheral gustatory neurons and provides complementary information to more traditional whole-nerve chorda tympani recordings or taste behavior assays.

Here we present how to expose the geniculate ganglion of a live, anesthetized laboratory mouse and how to use calcium imaging to measure the responses of ensembles of these neurons to taste stimuli, allowing for multiple trials with different stimulants. This allows for in depth comparisons of which neurons respond to which tastants.

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Reaktionen auf Geschmacksreize

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...