Wir verwenden dieses Protokoll, um neuronale Vorläuferzellen aus Patientenhaut-Fibroblasten herzustellen und neurologische und neurodegenerative Erkrankungen zu untersuchen. Wir haben das Gefühl, dass dieses Protokoll viele Vorteile gegenüber der klassischen IPS-Technologie hat, einschließlich der Geschwindigkeit, aber auch immer in bestimmten Fällen eine schwerere Krankheit Phänotyp. Wir untersuchen neurologische und neurodegenerative Erkrankungen und ermöglichen es uns, die Vielfalt der Patienten auch wirklich zu bewerten.
Mein Labor interessiert sich besonders für die Rolle von Astrozyten bei Krankheiten und wir verwenden die Astrozyten, die wir aus den NPCs herstellen, um Medikamente zu testen und auch Krankheitsmechanismen zu untersuchen, aber auch in Kokulturen mit menschlichen und Mausneuronen. Wir hoffen, dass dieses Protokoll informativ sein wird und wenden Sie sich bitte an Sie, wenn Sie Fragen haben. Vielen Dank.
Verwenden Sie primäre menschliche Haut-Fibroblasten, die aus Zellbänken oder Hautbiopsien gewonnen werden können. Kulturzellen bei 37 Grad Celsius in einem 5%CO2-Gewebekultur-Inkubator. Durchgangszellen für mindestens ein bis zwei Passagen nach dem Auftauen vor der Verwendung im Experiment.
Sobald die Zellen fertig sind, beschichten Sie einen Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte mit menschlichem Fibronectin in einer Konzentration von 1:200, die in PBS bei Raumtemperatur für 15 bis 20 Minuten verdünnt wird. Bereiten Sie Fibroblastenmedien vor, wie in Tabelle 1 dargestellt. Wenn die Zellen bereit sind, plattiert zu werden, entfernen Sie das Fibronectin aus der Schale und fügen Sie sofort Zelllösung oder zwei Mils Fibroblastenmedien hinzu.
Lassen Sie die Schale nicht vor dem Hinzufügen von Medien austrocknen. Je nachdem, wie schnell die Zellen wachsen, platte 150, 000 bis 200, 000 Fibroblasten in zwei Brunnen einer menschlichen fibronectin-beschichteten Sechs-Brunnen-Platte. Kulturzellen bei 37 Grad Celsius in einem 5%CO2-Gewebekultur-Inkubator.
Überprüfen Sie am Tag nach der Aussaat die Fibroblasten unter dem Mikroskop und stellen Sie sicher, dass die Zelldichte zwischen 70 und 85% liegt, um mit allen vier retroviralen Vektoren einen Brunnen zu erreichen: Okt3/4, Klf4, Sox2 und c-Myc. Verwenden Sie eine Vielzahl von Infektionen von 10 für schnell wachsende oder 15 für langsam wachsende Fibroblasten. Die Transduktionseffizienz muss 70 % oder mehr positive Zellen für jeden Vektor überschreiten.
Fügen Sie regelmäßige Fibroblasten-Medium zu viralen Mischung für ein Gesamtvolumen von einem mil pro Brunnen. Lassen Sie den zweiten brunnen unbehandelt und kehren Sie Die Zellen in den Gewebekultur-Inkubator zurück, um über Nacht zu brüten. Am Tag nach der Transduktion, waschen Sie Zellen einmal mit PBS und fügen Sie ein mil frisches Fibroblastenmedium hinzu.
Kulturzellen bei 37 Grad Celsius in einem 5%CO2-Gewebekultur-Inkubator. Am nächsten Tag, bereiten Sie Konvertierungsmedien, wie in Tabelle 1 gezeigt und waschen Zellen einmal mit PBS, um die verbleibenden Fibroblasten medien loszuwerden, dann fügen Sie ein mil Konvertierungsmedium hinzu. Ändern Sie auch die Medien der unbehandelten Gutmedien in Konvertierungsmedien.
Beobachten Sie Zellen unter dem Mikroskop und beobachten Sie Veränderungen in der Morphologie. Zellmedien sollten während des Konvertierungsprozesses täglich durch ein bis zwei Mils Konvertierungsmedien und für die nachfolgende iNPC-Kultur ersetzt werden. Ändern Sie die Medien, indem Sie sorgfältig 70 % Medien aus dem Brunnen entfernen und gleichzeitig sicherstellen, dass die Zellen in den verbleibenden 30 % der Medien abgedeckt bleiben.
Beobachten Sie die Zellen und wechseln Sie die Medien täglich mit ein bis zwei Mils Konversionsmedien. Nach etwa fünf bis sechs Tagen in Konvertierungsmedien oder wenn Zellen sehr dicht werden, durchziehen Sie sie ein bis zwei oder maximal einbis drei. Ccutase aufwärmen und eine entsprechende Anzahl von Brunnen in einer Sechs-Brunnen-Platte mit einem mil Gesamtfibronectin verdünnt 1:200 in PBS für 15 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur beschichten.
Waschen Sie Zellen sorgfältig mit PBS, ohne Zellen zu lösen. Verwenden Sie die Wand des Brunnens, um PBS sanft auf die Zellen aufzutragen. Entfernen Sie PBS vorsichtig mit Pipetten oder durch Anheben.
500 Mikroliter Akutase hinzufügen und zwei bis drei Minuten bei 37 Grad Celsius in einem Gewebekultur-Inkubator brüten. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob sich die meisten Zellen gelöst haben. Wenn Zellen abgegangen sind, fügen Sie zwei Mils frische Umwandlungsmedien hinzu und pipette zwei- bis dreimal sanft nach oben und unten, um Klumpen zu dissoziieren.
Sammeln Sie die Zellen in einem 15 mil Rohr und fügen Sie drei mils Medien, um die Accutase weiter zu verdünnen. Zentrifuge für vier Minuten bei 200 G bei Raumtemperatur. Entfernen Sie Denrastant aus dem Zellpellet und suspendieren Sie die Zellen in einem mil frischem Medium.
Zwei- bis dreimal sanft Pipetten nach oben und unten, um Zellklumpen aufzulösen. Entfernen Sie Fibronectin aus beschichteten sechs Brunnen und fügen Sie ein mil frische medien sofort zu jedem Brunnen. Für ein Split-Verhältnis von 1:2 500 Mikroliter der Zellsuspension in einem Brunnen und die anderen 500 in einem zweiten Brunnen hinzufügen.
Verteilen Sie die Zellen, indem Sie die sechs Brunnen in Nord-Süd-Ost-West-Richtung sanft schütteln und in 37-Grad-Gewebekultur-Inkubator setzen. Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop am nächsten Tag und wechseln Sie die Medien mit ein bis zwei Mils. Ändern Sie die Medien jeden Tag, bis die Zellen wieder geteilt werden können.
Bereiten Sie NPC-Medien, die FGF enthalten, in erhöhter Konzentration ohne EGF oder Heparin vor, wie in Tabelle 1 zu sehen ist. Bei dieser neuen Spaltung, Samen eine Bohrung von Zellen in Konvertierungsmedien und die andere gut in NPC-Medien. Wechseln Sie die Medien von iNPCs täglich mit ein bis zwei Mils NPC-Medien.
Bereiten Sie Astrozytenmedien gemäß Tabelle 1 vor. Um Astrozyten aus frischen iNPCs herzustellen, säen iNPCs direkt in 10 mils Astrozytenmedien in 10 Zentimeter fibronectinbeschichteten Platten, so dass sie am nächsten Tag etwa 10% Konfluenz haben. Kulturzellen bei 37 Grad Celsius in einem 5%CO2-Gewebekultur-Inkubator.
Wechseln Medium mit 10 mils Astrozytenmedien drei Tage nach der Beschichtung. Halten Sie die Zellen für fünf bis sieben Tage differenzieren. Um experimentel auszusieren, teilen Sie die Astrozyten mit Trypsin oder Accutase, wie in Schritt 2 bis 2.6 beschrieben.
Empfohlene Sädichten sind in Tabelle 2 enthalten. Anweisungen, wie man iNPCs portioniert, um induzierte Astrozyten zu erzeugen, finden Sie in Tabelle 3. Um Astrozyten aus gefrorenen iNPC-Beständen herzustellen, entfernen Sie die Portionsbestandsdatei aus dem Flüssigstickstoffspeicher und tauen Sie schnell bei 37 Grad Celsius auf.
Sobald Zellen aufgetaut sind, pipette zelllösung in einem 15 mil Rohr mit fünf mil Astrozytenmedien. Zentrifuge für vier Minuten bei 200 G Raumtemperatur. Entfernen Sie Überstand und resuspend in einem mil frischen Astrozytenmedium.
Fügen Sie neun Mils frisches Astrozytenmedium zu einer fibronectinbeschichteten 10-Zentimeter-Schale hinzu und fügen Sie eine Mil-Zell-Lösung hinzu, die Zellen in Nord-Süd-Ost-West-Bewegung sanft verteilt. Kulturzellen bei 37 Grad Celsius in einem 5%CO2-Gewebekultur-Inkubator. Dieses Protokoll ermöglicht die schnelle und einfache Generierung von iNPCs direkt aus menschlichen Haut-Fibroblasten mit Retroviren, die die Yamanaka-Faktoren enthalten.
Diese Methode ermöglicht es, den Stammzellzustand und die Notwendigkeit einer klonalen Selektion zu umgehen und so klonale Variationen zu vermeiden. Wichtige Schritte, die sie im Auge behalten sollten, während die Zellen den Umwandlungsprozess durchlaufen, sind die Fibroblasten-Saatdichte, der mediale pH-Wert und die optimale Konfluenz der Zellen. Beispiele für optimale Konfluenz- und Morphologieänderungen während des Konvertierungsprozesses finden Sie in Abbildung 1.
Nach Abschluss des Konvertierungsprozesses zeigen die NPCs stark reduzierte Expression oder keine Expression von Fibroblastenmarkern und Morphologien und drücken NPC-spezifische Zellmarker aus. Darüber hinaus können sie auch für die Erzeugung verschiedener Zelllinien wie induzierte Neuronen, Oligodendrozyten und Astrozyten verwendet werden. Nach unserer Erfahrung sind insbesondere induzierte Astrozyten für Arzneimittel- und Krankheitsmechanismus-Tests sehr wertvoll, da sie in reinen Populationen in reproduzierbaren großen Mengen erzeugt werden können.
Induzierte Astrozyten können von iNPCs unterschieden werden, indem ein kleines Aliquot von Zellen während der Spaltung oder ein zuvor eingefrorener iNPC-Anteil genommen und direkt in Astrozytenmedien plattiert wird. Wichtige Überlegungen während dieses Prozesses sind die Aufrechterhaltung der anfänglichen Saatdichte der iNPCs, da eine hohe Sädichte den Differenzierungsprozess behindert, und zusätzliche Aufmerksamkeit auf den pH-Wert der Medien zu richten, da die Versauerung selbst gesunde Astrozyten aktivieren kann. Zusammenfassend ist das direkte Konvertierungsprotokoll eine sehr schnelle Methode, um neuronale Vorläuferzellen aus Patientenhautproben herstellen zu können.
Dies ermöglicht es, eine größere Anzahl von Zellproben gleichzeitig zu untersuchen und die Vielfalt im Krankheitskontext wirklich zu untersuchen. Wir glauben, dass dies ein sehr starker Test ist, den Sie verwenden können, um neuronale Vorläuferzellen, Neuronen, aber auch Astrozyten herzustellen, die dann entweder in der Kokultur oder selbst für Drogentests oder mechanistische Studien verwendet werden können.
