Astrozyten sind eine interessante autogene Population für die direkte neuronale Programmierung. Dieses Protokoll bietet eine zuverlässige Technik zur Isolierung von Kulturastrozyten mit hoher Reinheit aus verschiedenen Regionen oder dem zentralen Nervensystem. Dieses Protokoll wurde entwickelt und optimiert, um die Fähigkeit von Astrozyten zu untersuchen, in funktionelle Neuronen umprogrammiert zu werden, ohne Störfaktoren wie Unterschiede in der Reinheit der Astrozyten verschiedener Startpopulationen zu beeinträchtigen.
Die Demonstration des Verfahrens wird von Bob Hersbach, Postdoc im Labor, und Tatiana Simon, einer technischen Assistenz in unserem Labor, durchgeführt. Legen Sie zunächst den Torso einer eingeschläferten Maus in eine 35-Millimeter-Petrischale und halten Sie ihn auf Eis. Öffnen Sie die Haut mit einer Schere und entfernen Sie den Wirbel mit einer kleinen Schere.
Dann extrahieren Sie das Rückenmark und legen Sie es in einen Dissektionspuffer auf Eis. Unter einem stereotaktischen Dissektionsmikroskop mit zweifacher Vergrößerung die Hirnhäute mit einer Pinzette aus dem isolierten Rückenmark entfernen und das präparierte und gereinigte Rückenmarksgewebe in ein C-Rohr übertragen. Fügen Sie 50 Mikroliter Enzym P aus dem Neuralgewebedissoziationskit und 30 Mikroliter zuvor vorbereitete Enzymmischung zu jedem C-Röhrchen hinzu.
Drehen Sie die C-Röhrchen um und legen Sie sie auf eine beheizte Dissoziation, um sicherzustellen, dass das gesamte Gewebe im Deckel der Röhre gesammelt wird. Vermeiden Sie Zellen, indem Sie die Säule aus dem Separator entfernen, 800 Mikroliter Astrozytenkulturmedium hinzufügen und Zellen mit dem mitgelieferten Kolben aus der Säule drücken. Plattenzellen in den zuvor hergestellten Kulturkolben durch Zugabe von 4,2 Milliliter Astrozytenkulturmedium ergänzt mit 10 Nanogramm pro Milliliter EGF und bFGF.
Es ist nicht notwendig, die Kulturkolben für Astrozyten zu beschichten, die aus anderen Gehirnregionen isoliert wurden, aber es bietet ein besseres Substrat für Astrozyten, die aus dem Rückenmark isoliert wurden. Kultur der Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Führen Sie Astrozytensitze unter einer biologischen Sicherheitswerkbank mit einer Sicherheitsstufe eins durch und bereiten Sie 24 Well-Platten mit Poly-D-Lysin-beschichteten Glasabdeckungsgläsern vor, wie im Textmanuskript beschrieben.
Für die Beschichtung ergibt die Isolierung von sechs Rückenmark aus P2-Mäusen rund 1 Million Zellen. Medien aus den T-12.5-Kulturkolben mit den kultivierten Astrozyten absaugen und einmal mit 1x PBS waschen. Die Astrozyten aus dem Kulturkolben lösen, indem Sie 0,5 Milliliter 0,05% Trypsin EDTA zugeben und fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Klopfen Sie vorsichtig auf die Seite des Kolbens, um Zellen von der Oberfläche des Kulturkolbens zu lösen, und überprüfen Sie die Ablösung unter einem Hellfeldmikroskop mit einer 10-fachen Vergrößerung. Stoppen Sie die Trypsinazation mit 2,5 Milliliter Astrozytenkulturmedium und sammeln Sie die Zellsuspension in 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie bei 300 RCF für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.
Asspirieren Sie Überstand und senden Sie Zellen in einem Milliliter Astrozytenkulturmedium. Berechnen Sie die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzählsystem. Basierend auf der Anzahl der Zellen wird die Zellsuspension mit frischem Astrozytenmedium, ergänzt mit EGF und bFGF, bei 10 Nanogramm pro Milliliter pro Faktor verdünnt.
In jede Vertiefung der zuvor präparierten 24 Wellplatten und Kulturzellen werden 500 Mikroliter der Zellsuspension bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid gegeben. Bereiten Sie das neuronale Differenzierungsmedium vor, indem Sie einen Milliliter B27-Ergänzung zu 49 Milliliter Basiskulturmedium hinzufügen. Nach 24 bis 48 Stunden, je nachdem, ob Zellen transduziert oder transfiziert wurden, ersetzen Sie das Astrozytenmedium durch ein Milliliter neuronales Differenzierungsmedium pro Well.
Kulturieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 9% Kohlendioxid. Um die Reprogrammierungseffizienz zu erhöhen, ergänzen Sie das neuronale Differenzierungsmedium mit Forskolin und Dorsomorphin auf eine Endkonzentration von 30 Mikromolar bzw. einem Mikromolaren, wenn das Astrozytenmedium durch das Differenzierungsmedium ersetzt wird. Wenn Sie sich für die Behandlung von Zellen mit Forskolin und Dorsomorphin entscheiden, geben Sie zwei Tage nach der Erstbehandlung eine zweite Dosis Dorsomorphin an.
Fügen Sie diese zweite Behandlung direkt zum Kulturmedium hinzu. Primärkulturen von Astrozyten erreichten eine Konflukation von 80 bis 90% zwischen sieben und 10 Tagen nach der magnetisch unterstützten Zellsortierung und -beschichtung. Am Tag nach der Beschichtung bedeckten die Zellen typischerweise 50 bis 60% der Deckglasoberfläche.
Die Kulturen bestanden in diesem Stadium hauptsächlich aus Astrozyten, während andere Zelltypen wie Neuroblasten praktisch fehlten. Sieben Tage nach der Transduktion oder Transfektion waren induzierte neuronale Zellen deutlich von Astrozyten zu unterscheiden. Das neuronale Zellsoma war kleiner als nicht reprogrammierte Astrozyten hatten lange Prozesse und waren positiv für neuronale Marker, Beta-Drei-Tubulin und negativ für Astrozytenmarker GFAP.
21 Tage nach der Transduktion oder Transfektion waren viele induzierte Neuronen in der Lage, Aktionspotentiale abzufeuern und waren positiv für den reifen neuronalen Marker NeuN und das pansynaptische Protein Synaptophysin. Es ist wichtig, die Region von Interesse richtig zu sezieren. Vermeidung von Kontamination durch umliegendes Gewebe.
Es muss darauf geachtet werden, die Hirnhäute und die Rückenwurzelganglien aus dem isolierten Rückenmark zu entfernen. Diese Methode kann verwendet werden, um Astrozyten aus verschiedenen Regionen des zentralen Nervensystems zu isolieren, einschließlich der Großhirnrinde, des dorsalen Mittelhirns und des Kleinhirns. In Zukunft wird diese Technik es uns ermöglichen, unser Wissen über regionale Astrozyten und ihr Potenzial, in funktionelle Neuronen umprogrammiert zu werden, zu erweitern.
