Wir bieten einen Einzelmolekül-Assay an, um die Phasentrennung von Transkriptionsfaktoren auf DNA zu beobachten Diese Technik ermöglicht die Echtzeitrealisierung des dynamischen Prozesses von Transkriptionsfaktoren, die sich als flüssiges Tröpfchen auf DNA zusammensetzen. EWS-FL1 ist eines der am häufigsten beteiligten Fusionsgene bei der Tumorgenese des Ewing-Sarkoms. Unsere Forschung konnte den Zusammenhang zwischen der DNA-Motivzahl und der EWS-FL1-Kondensatbildung identifizieren, die mit einer unfruchtbaren Gentranskription in Tumorzellen assoziiert ist und für die Prognose hilfreich sein kann.
Diese Methode könnte angewendet werden, um alle Transkriptionskondensate oder -komplexe in vitro wie P53 und MED1 zu untersuchen. Um eine Flusszelle mit Zickzack-Nanobarrieren für ein DNA-Vorhangexperiment vorzubereiten, verbinden Sie die Eingangs- und Ausgangsröhren in die richtige Richtung. Dann waschen Sie die Durchflusszelle mit 2,5 Milliliter Lipidpuffer mit zwei Drei-Milliliter-Spritzen, um sicherzustellen, dass sich keine Blase in der Durchflusszelle befindet.
Nehmen Sie die Spritze aus dem Ausgang und injizieren Sie dreimal einen Milliliter der Liposomenlösung mit einer fünfminütigen Inkubation zwischen jeder Injektion. Zur Heilung die Flusszelle mit 2,5 Milliliter Lipidpuffer langsam erneut waschen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Bereiten Sie während der Inkubation den BSA-Puffer wie im Textmanuskript erwähnt vor.
Nach 30 Minuten Heilung waschen Sie die Durchflusszelle mit 2,5 Milliliter BSA-Puffer von der Ausgangsseite. Als nächstes injizieren Sie 800 Mikroliter Streptavidinpuffer in zwei Schritten von der Eingangsseite in die Durchflusszelle mit einer 10-minütigen Inkubation nach jedem Schritt. Dann waschen Sie die Durchflusszelle mit 2,5 Milliliter BSA-Puffer, um alle freien Streptavidinmoleküle zu entfernen.
Als nächstes verdünnen Sie die Biotin-Lambda-DNA mit geklonten Motiven unter Verwendung von BSA-Puffer und injizieren Sie sie viermal langsam in Fünf-Minuten-Abständen. Schalten Sie während der Injektion das Mikroskop im wissenschaftlichen komplementären Metalloxid-Halbleitersystem ein. Dann waschen Sie den Schlauch mit 10 Milliliter doppelt destilliertem Wasser und spülen Sie das Prisma und den Schlauchanschluss mit Wasser, 2% flüssigem Küvettenreiniger und 99% Ethanol.
Als nächstes ziehen Sie mindestens 20 Milliliter des Bildgebungspuffers in eine 30-Milliliter-Spritze. Stellen Sie die Durchflusszelle auf dem Mikroskoptisch auf und verbinden Sie sie mit dem mikrofluidischen System. Mit einer Flussrate von 0,03 Milliliter pro Minute spülen Sie die DNA-Moleküle 10 Minuten lang zur Barriere.
Schalten Sie dann das mikrofluidische System aus und inkubieren Sie für 30 Minuten. mit dem Fluss gestoppt, so dass die DNA seitlich diffundieren kann. Um die EWS-FLI1-Kondensationsbildung auf DNA-Vorhängen abzubilden, öffnen Sie die Bildgebungssoftware und suchen und markieren Sie die Positionen der neun Zickzackmuster unter Hellfeld.
Schalten Sie dann den Fluss bei 0,2 Milliliter pro Minute ein, um die DNA 10 Minuten lang mit doppelsträngigem DNA-Farbstoff zu färben. Als nächstes verdünnen Sie das mCherry EWS-FLI1-Protein mit dem Bildgebungspuffer in einer Konzentration von 100 Nanomol in 100 Mikrolitern. Laden Sie dann die Proteinprobe mit einer 100-Mikroliter-Glasspritze durch das Ventil und ändern Sie die Durchflussrate auf 0,4 Milliliter pro Minute.
Nach dem Einschalten des 488-Nanometer-Lasers scannen Sie jede Region vor, um den DNA-Verteilungszustand zu überprüfen und den Bereich auszuwählen, in dem sich die DNA-Moleküle gleichmäßig verteilen. Stellen Sie dann die Laserleistung auf 10% für den 488-Nanometer-Laser und 20% für den 561-Nanometer-Laser ein. Messen Sie mit dem Leistungsmesser die tatsächliche Laserleistung in der Nähe des Prismas.
Beginnen Sie mit der Aufnahme von Bildern im Abstand von zwei Sekunden mit 488- und 561-Nanometer-Lasern gleichzeitig. Ändern Sie dann das Ventil vom manuellen Modus in den Injektionsmodus, damit der Bildgebungspuffer die Proteinprobe nach 60 Sekunden in die Durchflusszelle spülen kann. Um das freie EWS-FLI1 zu entfernen, waschen Sie die Flusszelle fünf Minuten lang mit dem Bildpuffer, wobei nur der 561-Nanometer-Laser eingeschaltet ist.
Dann stoppen Sie den Fluss und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Schalten Sie nach 10 Minuten den Fluss mit 0,4 Milliliter pro Minute ein, damit sich die DNA ausdehnen kann, und nehmen Sie Bilder in Zwei-Sekunden-Intervallen zwischen verschiedenen Frames auf, um Hochdurchsatzdaten der EWS-FLI1-Kondensatbildung zu erhalten. EWS-FLI1-Moleküle wurden durch Detektion der mCherry-markierten EWS-FLI1-Signale visualisiert, die mit einem 561-Nanometer-Laser erhalten wurden.
Die in vitro Bildung von EWS-FLI1-Kondensat an der Stelle der 25 GGAA-Wiederholungen im DNA-Substrat konnte direkt visualisiert werden. Die Spezifität des in DNA-Vorhängen verwendeten mCherry EWS-FLI1 wurde durch einen elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungstest unter Verwendung einer DNA-Vorlage mit und ohne die 25 GGAA-Wiederholungen separat bestätigt. Wenn die EWS-FLI1-Konzentration von 20 auf 500 Nanomol titriert wurde, stieg die EWS-FLI1-Intensität dramatisch an.
Während die Änderung der FLI-DBD-Intensität vernachlässigbar war, wenn die Proteine gesättigt waren, um die GGAA-Wiederholungen abzudecken, deutet dies darauf hin, dass EWS-FLI1 Kondensate auf der DNA bildete. Die Injektion sollte sehr langsam und weich sein, damit sich das Liposom und die DNA gleichmäßig auf der Flusszelle verteilen können. Es ist wichtig, MSA durchzuführen, um zu bestätigen, dass ein gereinigter Transkriptionsfaktor spezifisch an die Zielsequenz in vitro bindet.
Diese Technik ermöglicht es zu untersuchen, ob das Kondensat die gezielte Suche nach Transkriptionsfaktoren und seine Wirkung auf die Transkription erleichtert.
