We are grateful to the Canadian Institutes of Health Research (grant MT-5877), the National Institutes of Health (grants NS058668 and NS066664), and the US-Israeli Binational Foundation (grant 2003222) for funding these studies.

(- 350 g 250) in Übereinstimmung mit staatlich vorgeschriebene Tierpflege und Richtlinien zur Verwendung und wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der Universität von Kalifornien San Diego genehmigten Versuchsprotokolle wurden an weiblichen Long-Evans-Ratten durchgeführt. 1. acclimating den Rat zur Körperrückhalte HINWEIS: Setzen Sie die Ratte auf einer eingeschränkten Diät. Führen Sie die Ratte einmal am Tag unmittelbar nach jedem täglichen Umgang Sitzung, um die Ratte auf die Zurückhaltung (siehe unten) zu akklimatisieren. Geben Sie genug Futter, um das Tier bei 80% des Ausgangsgewicht zu halten. Diese Menge ist ungefähr 6 Gramm Futter pro Tag für einen 250 g weibliche Long Evans Ratten. <ol><li> Akklimatisieren die Ratte, die von den Menschen behandelt werden. Zurückhalten vorsichtig die Ratte mit der Hand für einen Zeitraum von ca. 5 s alle 30 sec. Tun Sie dies für 15 Minuten ein Tag, an 2 aufeinander folgenden Tagen. Überwachen Sie die Ratten täglich auf Anzeichen von Stress während der Ausbildungszeit. Symptome sind kämpfen in Reaktion auf Zurückhaltung, Stimmgebung und zahn Rattern. </li><li> Am 3. Tag, legen Sie die Ratte in einem Körper-beschränke Stofffutteral (Bild 1) für 15 Minuten pro Tag an zwei aufeinander folgenden Tagen. </li><li> Am 5. Tag, legen Sie die Ratte in der Socke, und legen Sie die Socke in einem starren Rohr auf der Versuchsvorrichtung (Abbildung 4). Verlassen Sie die Ratte in der Röhre für 15 Minuten ein Tag, an 2 aufeinander folgenden Tagen. </li><li> Feed the rat unmittelbar nach jeder Trainingseinheit. Am Ende der letzten Sitzung (6. Tag) erhalten freien Zugang zu Nahrung. Wählen Sie für die Implantation nur die Ratten, die keine Zeichen einer übermäßigen Betonung auf der letzten Trainingstag zeigen müssen. Hinweis: Obwohl Auswahl von Ratten implantiert ist subjektiv, in der Hand über 90% der Ratten gefunden wurden, die auf die Gewöhnung und fähig Implantation sein. </li></ol> 2. Implantation des Aufnahmekammer und Kopfstützenmechanismus <ol><li> Machen Sie eine WiederKonferenz Draht durch Löten blanken Edelstahldraht mit einem Pin-Anschluss. Schneiden Sie den Draht, so dass 3-5 mm verbleibt durch den Stift aufgedeckt. Autoklavieren den Referenzdraht, zusammen mit allen chirurgischen Instrumenten. </li><li> Verwalten Ketamin / Xylazin Anästhesie. Verabreichen 95 mg / kg Ketamin mit 5 mg / kg Xylazin intraperitoneal gemischt. Die Anfangsdosis dauert 1 ½ bis 2 Stunden. Ergänzen Sie die Betäubung jedes 30-45 Minuten danach, je nach Bedarf. Augen des Tieres Schmieren mit einer Augensalbe. </li><li> Überprüfen Sie die Zehen Rückzug Reflex auf die Ebene der Anästhesie zu bestimmen und Aufrechterhaltung einer Narkose wie nötig. </li><li> Legen Sie die Ratte in einem stereotaktischen Halterahmen mit Ohr Bars (3A). Rasieren Sie die Haare auf dem Kopf und desinfizieren Sie die Wunde mit PVP-Jod (10% ige Lösung). Darauf achten, dass die Ohr Bars angemessen einzusetzen, so dass sie nicht das Trommelfell beschädigen. Ear-Bars mit stumpfen Spitzen sind zu bevorzugen. </li><li> Einen Einschnitt mit einem Skalpell Angleirungsweise entlang der Mittellinie des Schädels vom rostro-kaudale Ebene der Augen nach hinten von den Ohren. Mit einer Schere zu schneiden und entfernen Sie eine 2-3 mm Hautstreifen auf beiden Seiten des Einschnitts. </li><li> Kratzen Sie die Knochenhaut, um die Oberfläche des Schädels aus, um den seitlichen Rillen schützen. Decken Sie die freiliegende Schädel mit dünnen Sekundenkleber. </li><li> Bohren Sie ein kleines Loch, mit einem etwas kleineren Durchmesser als 0-80 Schrauben, mit einem Bohrer Grat ½ mm Durchmesser (siehe Materialien Abschnitt). Bohren Sie das Loch unmittelbar posterior, wo der Bregma Naht trifft die seitliche Kante, und in einem 30-45 ° -Winkel in den Schädel, so dass die Schraube mit dem oberen Seiten mehr als den Grund zu gehen in. </li><li> Schrauben Sie in einem 0-80 Flachboden-Maschinenschraube in das Loch (ca. 3 Umdrehungen), bei 30 bis 45 ° -Winkel. Darauf achten, dass Schrauben in zu tief, um eine Beschädigung der darunter liegenden Hirngewebe. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang für 6 zusätzliche Schrauben in der Konfiguration gezeigt <strong&gt; (3B). Sekundenkleber auf der Basis aller Schrauben. </li><li> Legen Sie eine Spritzennadel in der stereotax Manipulator. Messen Sie von der Bregma Naht und eine Delle in den Schädel mit der Nadel in der Nähe, aber außerhalb des gewünschten Kraniotomie Lage als Referenzmarke. HINWEIS: In dieser Demonstration, die stereotaktischen Koordinaten der Marke sind 3 mm posterior und 1 mm lateral zum Bregma Naht. </li><li> Markieren Sie die Delle mit einem wasserfesten Stift. Beachten Sie die stereotaktischen Koordinaten der Marke, da sie als stereotaktischen Referenzpunkt dienen (3B). </li><li> Einen Kraniotomie auf den gewünschten Koordinaten (3 mm posterior und 3 mm lateral zum Bregma in diesem Beispiel) zentriert ist. Verlassen Sie die Dura mater intakt. Decken die Kraniotomie mit modifizierten künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (125 mM NaCl, 10 mM Glucose, 10 mM HEPES, 3,1 mM CaCl 2, 1,3 mM MgCl 2, pH 7,4), 13 (3C). </li&gt; <li> Schneiden Sie ein 0,2 ml-Zentrifugenröhrchen, um 4 - 5 mm in der Länge, und schneiden Sie die Kappe. Das Röhrchen wird auf dem Schädel und zentrieren es über die Kraniotomie. </li><li> Anwenden Zahnzement auf der Unterseite des Rohres, um den Boden des Rohres zum Schädel abzudichten. Achten Sie darauf, Zement in die freigelegte Schädel (3D) auslaufen. </li><li> Bohren Sie ein anderes kleines Loch (ca. ½ mm Durchmesser) in der Gegenschädelplatte und sorgfältig legen Sie die Referenzdraht. Konstruieren Sie die Referenzdraht durch Löten einen Stift, der mit dem Aufzeichnungsverstärker bis zum Ende des Drahtschnittstellen (siehe Ausstattung Abschnitt). Den Referenzdraht nicht bewegen, sobald es im Gehirn, da dies zu Schäden. </li><li> Sekundenkleber auf das Loch, in dem der Draht eingeführt wird. Dadurch wird der Bolzen und Draht anstelle vorübergehend zu versiegeln. </li><li> Man vermischt die beiden Teile des Silikongels Kit (siehe Materialien Abschnitt) in etwa gleichen Teilen. Warten Sie zwei Minuten Mischen und fill die Zentrifugenröhrchen etwa ⅓ voll mit Gel. </li><li> Befestigen Sie einen rechten Winkel Stützenklemme (siehe Materialien Abschnitt) an der Kopfstütze bar. Befestigen der Kopfplatte (2A) auf die Halteleiste (2B) in einem 45 ° Anstellwinkel so dass die Unterseite der Platte in Richtung auf die Nase des Tieres. Es ist hilfreich, einen Neigungsmesser zu verwenden, um den Neigungswinkel eingestellt, dass der Versuchsvorrichtung (Abbildung 4) entsprechen. </li><li> Befestigen Sie die Haltestange an die stereotax Manipulatorarm so dass die Stange parallel zu den Ohr Bars ist. Senken Sie die Bar und Platte, so dass die Platte posterior der Lambdanaht und anterior der Schwanz äußersten Schraube. </li><li> Ziehen Sie die vordere Kopfschraube (eine 8-32 Bolzen oder Schrauben, siehe Materialien Abschnitt) bei ca. 45 ° Winkel mit einer helfenden Hände Arm und Klemme, so dass der Kopf der Schraube nach unten zeigt und in Richtung der Schwanz des Tieres. Senken Sie die Schraube, so dass es die Ameise berührterior 0-80 Schrauben (3F, G). </li><li> Sichern Sie die Schraube und Platte an Ort und Stelle mit Zahn Acryl. Anwenden Dentalacryl um die Knochenschraubenköpfe Referenzstift, und um die Seiten des Zentrifugenrohrs. Warten Sie ca. 10 Minuten für die Dentalacryl trocknen (3H). </li><li> Eine Schicht Zahnzement an den Rändern des Zahn Acryl-, Zementieren der Haut an das Implantat. Warten Sie, bis der Zement trocknet. </li><li> Poke mehrere Löcher in der Kappe des Zentrifugenröhrchens, und setzen Sie die Kappe auf dem Rohr. </li><li> Entfernen Sie die helfenden Hände Klammer. Dann entfernen Sie vorsichtig den Kopf-Haltestange aus dem stereotax und entfernen Kopfplatte von der Bar (3I). </li><li> Nehmen Sie das Tier von der stereotax und zu verwalten, postoperative Pflege und Überwachung im Einklang mit allen geltenden Vorschriften, Bestimmungen und Gesetze (zB Buprenorphin 0,02 mg / kg, jede 8-12 Stunden für mindestens 24h). Wenn Entzündung entwickelt sich um die Kanten des Implantats, eine dünne Schicht von antibiotischen Salbe auf die betroffene Stelle täglich bis gelöst. </li></ol> 3. Juxtacellular Überwachung der neuronalen Einheiten <ol><li> Ziehen Quarzkapillare Schlauch auf einem Kohlendioxid-Laser-Mikropipettenzieher (siehe Ausstattungsteil) mit Spitzendurchmessern von weniger als 1 um (5A). Hinweis: Die Heizungsparameter entsprechend der jeweiligen Instrument variieren, und dass die erforderliche Halsdurchmesser ist abhängig von der Struktur des Gehirns von Interesse variieren. Für Aufnahmen in Ratten Thalamus, haben Mikro Hälse von 5-7 mm. </li><li> Sichern Sie die Pipette an Ort und Stelle unter einem Differentialinterferenzkontrast (DIC) Mikroskop mit großem Arbeitsabstand Ziele ausgestattet. Verwenden Knetmasse, um die Pipette an Ort und Stelle auf der Bühne des Mikroskops zu halten. </li><li> Bewegen Sie einen Glasblock (0,5-1 cm stark; ein Stück Glas für mak verwendeting ultra Mikrotommessern ist praktisch) in das Sichtfeld mit der Pipettenspitze. Mit der Bühne Mikromanipulator, sanft berühren die Pipettenspitze auf das Glas, wodurch es zu brechen. Bei Bedarf wiederholen, bis die Pipettenspitze Außendurchmesser beträgt zwischen 1-3 um (5B, C). Stellen Sie sicher, dass diese Mikropipetten haben Impedanzen zwischen etwa 5 bis 15 MOhm. </li><li> Bereiten extrazellulären Salzlösung (135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 5 mM HEPES, pH 7,2 mit NaOH) 8 und mit 2% (w / v) Chicago Sky Blue. Unter Verwendung einer Spritze mit einer 30 G-Nadel oder kleiner ist, füllen die Hinterende der Pipette mit der Lösung. Alternativ können für einzelne Zelle juxtacellular Kennzeichnung mit 2% (w / v) Neurobiotin oder biotinylierte Dextran Amin (BDA-3000 oder BDA-10000) mit der Kochsalzlösung anstelle von Chicago Sky Blue. </li><li> Legen Sie die Ratte in der Tuch Socke innerhalb des starren Rohr auf einem geeigneten Versuchs jig ( <strong&gt; Abbildung 4) .Wait ein Minimum von 72 Stunden nach der Operation, bevor das Tier auf der Kopfstütze Lehre. Ziehen der Zugschnur um den oberen Brustbeins, anstatt den Hals, um eine Behinderung der Luftwege zu vermeiden. Bei Atem scheint gearbeitet oder behindert werden, lösen Sie die Kordel oder verschieben Sie sie nach hinten. Führen Sie dieses Verfahren, während die Ratte ist wach. </li><li> Befestigen Sie die Kopfhalteplatte an der Ratte mit dem entsprechenden Teil an der Vorrichtung. Dazu stecken Sie die erste Kopfstützenplatte an Ort und Stelle, und befestigen Sie es mit einem 4-40 Schraube dann. Achten Sie darauf, warten Sie, bis das Tier ruhig, um zu vermeiden übermäßigen Drehmoments auf den Kopf. Als nächstes legen eine 8-32 Mutter an der Kopfrückhaltebolzen, die an der Ratte implantiert wird. Schrauben Sie dann in einer Gewindeedelstahlstange auf den Kopf-Schraube. Das Anbringen der Stange mit dem experimentellen Einspannvorrichtung derart, dass sie an Ort und Stelle angezogen werden (Figur 4). HINWEIS: Die Sicherung der Tier mit Kopf-Schraube sowie der Kopfstütze Platte minimizes Biegen der Vorrichtung und verbessert die Aufzeichnungsstabilität. In den meisten Fällen kann die Aufnahme am ersten Tag beginnen das Tier Kopf-verhalten. Allerdings, wenn das Tier zappelt mäßig oder vokalisiert, liefern einen Tag Kopfstütze Gewöhnungstraining vor Beginn von Aufnahmen. In diesem Fall lassen Sie das Tier auf der Spannvorrichtung für 15 Minuten und setzen Sie ihn wieder in seinem Käfig dann. Wiederholen Sie diesen Schritt am nächsten Tag und mit dem Protokoll. </li><li> Öffnen Sie die Aufnahmekammer und entfernen Sie das Silikon-Gel. Reinigen Sie die Kraniotomie mit feinen Pinzette, wenn Gewebe in der Kraniotomie erneut gewachsen. </li><li> Befestigen Sie die Pipette auf die motorisierten Mikromanipulator, und stecken Sie den heads Vorverstärker. HINWEIS: In der vorliegenden Demonstration wird eine kleine Relaisschaltung auf der heads verwendet, um zwischen den Verstärkerleitungsdrähten und einer externen Stromquelle mit hoher Compliance (6A-C) zu wechseln. Beachten Sie, dass einige Verstärker eine entsprechende integrierte Hoch Einhaltung Quelle haben(Siehe Diskussion und Materialien Abschnitte). </li><li> Verwenden Sie den motorisierten Mikromanipulator, um die Spitze der Pipette auf die stereotaktisch identifiziert Zeichen in der Aufnahmekammer zu bewegen. Beachten Sie die Koordinaten des Standortes. Achten Sie darauf, die Spitze der Pipette auf den Schädel zu brechen. </li><li> Bewegen Sie die Pipette auf die gewünschte Aufzeichnungsstelle in der anterior-posterioren und medio-lateralen Achsen. Dann voran die Pipette ventral durch die Dura, bis es etwa 500 &amp; mgr; m Rücken zu der vorgesehenen Aufzeichnungs Lage. </li><li> Langsam voran die Pipette beim Hören zum Aufstocken Ereignisse auf einer Audio-Monitor der verstärkten Spannung zwischen der Pipettenspitze und der Referenzdraht erfasst. Sobald Spick Ereignisse festgestellt werden, weiterhin die Pipette 0-100 &amp; mgr; m bis positive Spannung Biegungen von mehr als etwa 500 &amp; mgr; V eingehalten werden zu bewegen. HINWEIS: Die Elektrodenwiderstand um einen Faktor von etwa 1,5-10 wh erhöhenen dies geschieht. </li><li> Beginnen Sie die Aufnahme, sobald ein Gerät wie gemäß Schritt 3.11, zusammen mit allen anderen Verhaltens- und physiologische Messungen von Interesse isoliert. In der vorliegenden Demonstration werden selbst erzeugte vibrissa Bewegungen mit hoher Geschwindigkeit Videografie überwacht (siehe Materialien Abschnitt). </li><li> Um die Aufnahme vor Ort zu kennzeichnen, schalten Sie die Elektrode führt zu einer mit der Stromquelle verbinden. Es gibt mehrere Möglichkeiten, dies zu tun, entweder mit einer Relaisschaltung (6A - C), eine eingebaute Stromquelle des Verstärkers, oder manuell (6D, siehe Schritt 3.8 und Diskussion). Geben -4 uA mit 2 sec Impulse bei 50% Einschaltdauer für 4 Minuten iontophoretisch injizieren Chicago Sky Blue durch die Pipette. </li><li> Töte und versorgen die Tier nach mehreren Markierungsverfahren nach den üblichen Richtlinien. Abschnitt des Gehirns und Gegenfärbemittel wie nötig, um zu identifizieren die anatomische Lage des Aufzeichnungs sitzene. Gegenfärbung des Gewebes für Cytochromoxidase Reaktivität nach 14. Alternativ identifizieren die Chicago Sky Blue Ablagerungen mittels Fluoreszenzmikroskopie. HINWEIS: Um zwischen verschiedenen markierten Einheiten genau zu unterscheiden, ist es wichtig, dass alle Etiketten werden mit der gleichen Pipette am selben Tag gemacht, ohne Lösen der Pipette zwischen Etiketten. In diesem Fall können die Aufnahme-Websites durch ihre relativen Positionen in Post-hoc-Histologie mit der erwähnten Manipulator Koordinaten jeder Seite unterschieden werden (siehe Schritt 3.9). Zur eindeutigen Identifizierung, markieren die Etiketten mindestens 200 &amp; mgr; m voneinander entfernt, und nicht mehr als 3-5 Etiketten pro Hirnregion. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Der Bau des experimentellen jig Die Beschreibung der für die Versuchsvorrichtung (4) aufbauen mechanischen Teile von dem Protokoll weggelassen werden, da sie in einer Vielzahl von Arten aufgebaut werden. In dieser Demonstration Standard opto-mechanischen Teilen und Unterstützung Klammern werden verwendet, um die Kopfstütze Bar und die Körperhaltung Rohr (siehe Materialien Abschnitt) zu montieren. Ähnliche opto-mechanische ...

Überwachung der neuronalen Aktivität in einem Alert Tier aktiv an einer Verhaltensaufgabe engagiert ist entscheidend für das Verständnis der Funktion und Organisation des Nervensystems. Die extrazelluläre Aufnahme der elektrischen Aktivität von einzelnen neuronalen Einheiten ist seit langem ein Grundnahrungsmittel Werkzeug für Systemische Neurowissenschaften und ist immer noch weit verbreitet in Gebrauch heute. Eine Vielzahl von Elektrodentypen und Konfigurationen sind abhängig von den wissenschaftlichen und technischen Anforderungen einer bestimmten Experiment. Chronisch implantierten Microdrives oder Elektroden-Arrays werden häufig in sich frei bewegenden Tieren, darunter Vögel, Nagetiere und Primaten 1-4 verwendet. Alternativ werden akuten Durch mit Metall- oder Glasmikroelektroden über einen externen Mikromanipulator oft verwendet, um von narkotisierten oder Kopf-zurückhaltende Tiere aufnehmen. Glasmikroelektroden haben den Vorteil, dass sie in der juxtacellular oder verwendet werden &quot;Zelle angebracht&quot; Konfiguration eindeutig zu isolierenAktivität einzelner Nervenzellen, ohne die Komplikationen der Post-hoc-Spike-Sortier 5. Diese Elektroden weiter erlauben die Aufnahme von anatomisch-identifizierten Zellen oder Standorte, wie sie verwendet werden, um kleine Ablagerungen von Farbstoff oder neuroanatomische Tracer injizieren oder sogar zum Ausfüllen der einzelnen Zelle aufgezeichnet werden. Diese Konfiguration wurde erfolgreich bei Ratten, Mäusen und Vögeln 6-10 angelegt. Die hier beschriebene Technik konzentriert sich auf juxtacellular Überwachung und extrazelluläre Farbstoffablagerungen in Alarm, Kopf-zurückhaltende Ratten. Beachten Sie, dass im Gegensatz zu Einzelzell juxtacellular füllt diese Farbstoffablagerungen bieten keine Informationen über die Zellmorphologie oder axonalen Projektionen 11, aber sie exakte anatomische Lokalisation auf ca. 50 &amp; mgr; m zu ermöglichen und, entscheidend, eine deutlich höhere Ausbeute bei der Benachrichtigung Tiere. Informationen zur Einzelzell juxtacellular füllt wird dennoch als eine alternative Strategie für anatomische Kennzeichnung versehen. Kurz gesagt, dieProtokoll besteht aus drei Hauptphasen. In der ersten Phase wird die Ratte Körperhaltung in einem Tuch Socke (Figur 1) über einen Zeitraum von 6 Tagen akklimatisieren. In der zweiten Phase wird eine Kopfrückhaltevorrichtung (Abbildung 2) und Aufnahmekammer chirurgisch implantiert, so dass die Ratten in der stereotaktischen Flugzeug bei mehreren nachfolgenden Aufnahmen (Abbildung 3) gehalten werden; Dieses Verfahren ermöglicht es dem Experimentator insbesondere subkortikalen Regionen des Gehirns, die für elektrophysiologische Untersuchung Ziel basierend auf Standardreferenzkoordinaten 12. Die dritte Phase umfaßt das Anordnen der Ratte in einer entsprechenden Spannvorrichtung für die Durchführung der Verhaltens- und elektrophysiologischen Experimenten (Figur 4), die Konstruktion der Elektrode von einem Quarz Kapillarrohr (5), so dass juxtacellular neuronalen Aufnahmen, eindeutig einzelnen Betriebseinheiten 6-9 zu isolieren, und Markieren der anatomischen locatian der Aufzeichnungsstelle mit Chicago Sky Blue Farbstoff (6 und 7). Die Aufnahmen werden bei gleichzeitiger Verhaltensüberwachung durchgeführt; jedoch werden die technischen Einzelheiten des Verhaltens auf den wissenschaftlichen Ziele jedes Experiments abhängt und damit über den Umfang eines einzelnen Protokolls. Nach Beendigung der Versuchsdurchführung, die an mehreren Tagen wiederholt werden kann, wird das Tier getötet. Das Gehirn ist nach Norm neuroanatomische Methoden entweder mit Hellfeld-Fluoreszenzmikroskopie oder extrahiert und verarbeitet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="860">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Name of the Reagent</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:315px;">Comments&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Ketaset (Ketamine HCl)</td>
			<td style="width:179px;">Fort Dodge&#160;</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Anased (Xylazine solution)</td>
			<td style="width:179px;">Lloyd Laboratories</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Betadyne (Povidone-Iodine)</td>
			<td style="width:179px;">CVS Pharmacy</td>
			<td align="right" style="width:175px;">269281</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Loctite 495</td>
			<td style="width:179px;">Grainger Industrial Supply</td>
			<td style="width:175px;">4KL86</td>
			<td style="width:315px;">20-40 cp cyanoacrylate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Vetbond</td>
			<td style="width:179px;">3M</td>
			<td style="width:175px;">1469SB</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Grip cement powder</td>
			<td style="width:179px;">Dentsply Intl</td>
			<td align="right" style="width:175px;">675571</td>
			<td style="width:315px;">For the base of the recording chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Grip cement liquid</td>
			<td style="width:179px;">Dentsply Intl</td>
			<td align="right" style="width:175px;">675572</td>
			<td style="width:315px;">For the base of the recording chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Silicone Gel</td>
			<td style="width:179px;">Dow Corning</td>
			<td align="right" style="width:175px;">Mar-80</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Jet denture repair acrylic powder</td>
			<td style="width:179px;">Lang Dental Manufacturing Co.</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">For securing the head restraint apparatus to the cranium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Ortho-Jet Fast curing orthodontic acrylic resin liquid</td>
			<td style="width:179px;">Lang Dental Manufacturing Co.</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">For securing the head restraint apparatus to the cranium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Chicago sky blue</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:175px;">C8679</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:175px;">158127</td>
			<td style="width:315px;">For perfusion and tissue fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:175px;">P3813</td>
			<td style="width:315px;">For perfusion and tissue fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Cytochrome C</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:175px;">C2506</td>
			<td style="width:315px;">For cytochrome-oxidase staining (Figure 7)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Diaminobenzidine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:175px;">D5905</td>
			<td style="width:315px;">For cytochrome-oxidase staining (Figure 7)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Material Name</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:315px;">Comments&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Rat sock</td>
			<td style="width:179px;">Sew Elegant (San Diego, CA)</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">Custom made, Figures 1, 4</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">PVC tube 2 &#189;&#8221;</td>
			<td style="width:179px;">U.S. Plastic Co.</td>
			<td align="right" style="width:175px;">34108</td>
			<td style="width:315px;">Figure 4</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Subminiature D pins &#38; sockets</td>
			<td style="width:179px;">TE Connectivity</td>
			<td style="width:175px;">205089-1</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Stainless steel music wire 0.010&#8221; diameter</td>
			<td style="width:179px;">Precision Brand Products, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:175px;">21010</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Stereotaxic holding frame</td>
			<td style="width:179px;">Kopf Instruments</td>
			<td style="width:175px;">Model 900</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Stereotaxic ear bars</td>
			<td style="width:179px;">Kopf Instruments</td>
			<td style="width:175px;">Model 957</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Stereotaxic manipulator</td>
			<td style="width:179px;">Kopf Instruments</td>
			<td style="width:175px;">Model 960</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">&#189; mm drill burr</td>
			<td style="width:179px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:175px;">100-3995</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Quiet-Air dental drill&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Midwest Dental</td>
			<td style="width:175px;">393-1600</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Stainless steel 0-80 1/8&#8221; screw</td>
			<td style="width:179px;">Fastener superstore</td>
			<td align="right" style="width:175px;">247438</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">0.2mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">05-407-8A</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Custom head-holding bar</td>
			<td style="width:179px;">UCSD SIO Machine Shop</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">Custom made, Figures 2, 3, 4</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:191px;">Custom head-holding plate</td>
			<td rowspan="2" style="width:179px;">UCSD SIO Machine Shop</td>
			<td rowspan="2" style="width:175px;">N/A</td>
			<td rowspan="2" style="width:315px;">Custom made, Figure 2, 3, 4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:191px;">Right angle post-clamp</td>
			<td style="width:179px;">Newport</td>
			<td style="width:175px;">MCA-1</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3,4; standard opto-mechanical parts for the experimental jig (Figure 4) are also from Newport Corp.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">8-32 3/4&#8221; screw</td>
			<td style="width:179px;">Fastener Superstore</td>
			<td align="right" style="width:175px;">240181</td>
			<td style="width:315px;">For head-restraint, Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">4-40 &#188;&#8221; screw</td>
			<td style="width:179px;">Fastener Superstore</td>
			<td align="right" style="width:175px;">239958</td>
			<td style="width:315px;">For head restraint, Figures 3, 4</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Quartz capillary tubing</td>
			<td style="width:179px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:175px;">QF-100-60-10</td>
			<td style="width:315px;">Figure 5</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Carbon dioxide laser puller</td>
			<td style="width:179px;">Sutter instruments</td>
			<td style="width:175px;">P-2000</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Motorized micromanipulator</td>
			<td style="width:179px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:175px;">MP-285</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Microelectrode amplifier</td>
			<td style="width:179px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:175px;">Multiclamp 700B</td>
			<td style="width:315px;">Alternate part: Molecular Devices Axoclamp 900A</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Microelectrode amplifier head stage</td>
			<td style="width:179px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:175px;">CV-7B</td>
			<td style="width:315px;">Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Isolated pulse stimulator</td>
			<td style="width:179px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:175px;">Model 2100</td>
			<td style="width:315px;">Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Audio monitor</td>
			<td style="width:179px;">Radio Shack</td>
			<td style="width:175px;">32-2040</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:191px;">Pipette holder</td>
			<td rowspan="2" style="width:179px;">Warner Instruments</td>
			<td rowspan="2" style="width:175px;">#MEW-F10T</td>
			<td style="width:315px;">Alternate parts: see Discussion</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">Figure 6A</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Electrode lead wire</td>
			<td style="width:179px;">Cooner wire</td>
			<td style="width:175px;">NEF34-1646</td>
			<td style="width:315px;">(optional), Figure 6D</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:191px;">Relay for amplifier head-stage</td>
			<td style="width:179px;">COTO Technology</td>
			<td style="width:175px;">#2342-05-000</td>
			<td style="width:315px;">(optional) Used with a custom-made printed circuit board (UCSD Physics Electronics Shop), Figure 6A-C</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Digital video camera</td>
			<td style="width:179px;">Basler</td>
			<td style="width:175px;">A602fm</td>
			<td style="width:315px;">(optional) For behavioral monitoring, Figure 7</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

juxtacellular monitoring and localization of single neurons within sub-cortical brain structures of alert, head-restrained rats

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures in behaving animals remains a technical challenge, especially if the structures must be targeted stereotaxically. This protocol describes convenient surgical and electrophysiological techniques that maintain the animal&#8217;s head in the stereotaxic plane and unambiguously isolate the spiking activity of single neurons. The protocol combines head restraint of alert rodents, juxtacellular monitoring with micropipette electrodes, and iontophoretic dye injection to identify the neuron location in post-hoc histology. While each of these techniques is in itself well-established, the protocol focuses on the specifics of their combined use in a single experiment. These neurophysiological and neuroanatomical techniques are combined with behavioral monitoring. In the present example, the combined techniques are used to determine how self-generated vibrissa movements are encoded in the activity of neurons within the somatosensory thalamus. More generally, it is straightforward to adapt this protocol to monitor neuronal activity in conjunction with a variety of behavioral tasks in rats, mice, and other animals. Critically, the combination of these methods allows the experimenter to directly relate anatomically-identified neurophysiological signals to behavior.

<html> Neuronal Einheiten in ventralen posterioren medialen (VPM) Thalamus codieren die Phase vibrissa Bewegung während selbsterzeugten wischend 15,16. 7A zeigt Probe Spikeaktivität eines VPM thalamic Einheit eine Ratte aktiv wischend. 7B zeigt ein Histogramm der Spike Zeiten zur Momentanphase vibrissa Bewegung 17 ausgerichtet ist. Es gibt mehr Spitzen während der Rückzugsphase der wischend. Nach der Aufzeichnung wurde die Position der Einheit mittels Iontophore...

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Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats

This protocol describes the design and surgical implantation of a head-restraining mechanism to monitor neuronal activity in sub-cortical brain structures in alert rats. It delineates procedures to isolate single neurons in the juxtacellular configuration and to efficiently identify their anatomical locations.

Juxtacellular Überwachung und Lokalisierung von einzelnen Neuronen im Sub-kortikalen Hirnstrukturen der Alarm, Head-zurückhaltende Ratten

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures ...

juxtacellular-monitoring-localization-single-neurons-within-sub

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.3K Aufrufe.  University of California, San Diego. This protocol describes the design and surgical implantation of a head-restraining mechanism to monitor neuronal activity in sub-cortical brain structures in alert rats. It delineates procedures to isolate single neurons in the juxtacellular configuration and to efficiently identify their anatomical locations.

Serie: Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and gene expression programs for extremely rare cell subsets has been a challenge using standard whole-tissue approaches. Gene expression profiling of individual cells allows for unprecedented access to cell types that comprise only a small percentage of the total tissue1-7. In addition, this technique can be used to examine the gene expression programs that are transiently expressed in small numbers of cells during dynamic developmental transitions8.
This issue of cellular diversity arises repeatedly in the central nervous system (CNS) where neuronal connections can occur between quite diverse cells9. The exact number of distinct cell types is not precisely known, but it has been estimated that there may be as many as 1000 different types in the cortex itself10. The function(s) of complex neural circuits may rely on some of the rare neuronal types and the genes they express. By identifying new markers and helping to molecularly classify different neurons, the single-cell approach is particularly useful in the analysis of cell types in the nervous system. It may also help to elucidate mechanisms of neural development by identifying differentially expressed genes and gene pathways during early stages of neuronal progenitor development.
As a simple, easily accessed tissue with considerable neuronal diversity, the vertebrate retina is an excellent model system for studying the processes of cellular development, neuronal differentiation and neuronal diversification. However, as in other parts of the CNS, this cellular diversity can present a problem for determining the genetic pathways that drive retinal progenitors to adopt a specific cell fate, especially given that rod photoreceptors make up the majority of the total retinal cell population11. Here we report a method for the identification of the transcripts expressed in single retinal cells (Figure 1). The single-cell profiling technique allows for the assessment of the amount of heterogeneity present within different cellular populations of the retina2,4,5,12. In addition, this method has revealed a host of new candidate genes that may play role(s) in the cell fate decision-making processes that occur in subsets of retinal progenitor cells8. With some simple adjustments to the protocol, this technique can be utilized for many different tissues and cell types.

A method for the isolation of single retinal cells and subsequent amplification of their cDNAs is described. Single-cell transcriptomics reveals the degree of cellular heterogeneity present in a tissue and uncovers new marker genes for rare cell populations. The accompanying protocol can be adjusted to suit many different cell types.

Einzel-Zell-Profiling der Entwicklung und Reife Netzhautneuronen

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Laser Capture Mikrodissektion von Angereichert Populationen von Neuronen oder Single Neurons zur Genexpressionsanalyse Nach Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within histological brain samples. While it is preferable from a practical perspective to prepare brain sections at the greatest thickness possible, in order to increase the probability of identifying stained neurons that are fully contained within single sections, this approach is limited from a technical perspective by the working distance of high-magnification microscope objectives. We report here a protocol to stain neurons using the Golgi-Cox method in mouse brain sections that are cut at 500 &#956;m thickness, and to visualize neurons throughout the depth of these sections using an upright microscope fitted with a high-resolution 30X 1.05 N.A. silicone oil-immersion objective that has an 800 &#956;m working distance. We also report two useful variants of this protocol that may be employed to counterstain the surface of mounted brain sections with the cresyl violet Nissl stain, or to freeze whole brains for long-term storage prior to sectioning and final processing. The main protocol and its two variants produce stained thick brain sections, throughout which full neuron dendritic&#160;trees and dendrite spines may be reliably visualized and quantified.

We present a protocol for using the Golgi-Cox staining method in thick brain sections, in order to visualize neurons with long dendritic&#160;trees contained within single tissue samples. Two variants of this protocol are also presented that involve cresyl violet counterstaining, and the freezing of unprocessed brains for long-term storage.

Imaging Neurone innerhalb Dickhirnschnitten Mit der Golgi-Cox-Methode

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to synaptic degeneration, inflammation, neuronal death, and learning deficits. Humans cannot regenerate lost neurons in the case of AD in part due to impaired proliferative capacity of the neural stem/progenitor cells (NSPCs) and reduced neurogenesis. Therefore, efficient regenerative therapies should also enhance the proliferation and neurogenic capacity of NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is a regenerative organism, and we can learn the basic molecular programs with which we could design therapeutic approaches to tackle AD. For this reason, the generation of an AD-like model in zebrafish was necessary. Using our methodology, we can introduce synthetic derivatives of A&#946;42 peptide with tissue penetrating capability into the adult zebrafish brain, and analyze the disease pathology and the regenerative response. The advantage over the existing methods or animal models is that zebrafish can teach us how a vertebrate brain can naturally regenerate, and thus help us to treat human neurodegenerative diseases better by targeting endogenous NSPCs. Therefore, the amyloid-toxicity model established in the adult zebrafish brain may open new avenues for research in the field of neuroscience and clinical medicine. Additionally, the simple execution of this method allows for cost-effective and efficient experimental assessment. This manuscript describes the synthesis and injection of A&#946;42 peptides into zebrafish brain.

Modeling Amyloid-&amp;#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

This protocol describes the synthesis, characterization, and injection of monomeric amyloid-&#946;42 peptides for generating amyloid toxicity in adult zebrafish to establish an Alzheimer&#39;s disease model, followed by histological analyses and detection of aggregations.

Modellierung von Amyloid-β42 Toxizität und Neurodegeneration bei Erwachsenen Zebrafisch-Gehirn

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Transcranial Electrical Brain Stimulation in Alert Rodents

Transcranial electrical brain stimulation can modulate cortical excitability and plasticity in humans and rodents. The most common form of stimulation in humans is transcranial direct current stimulation (tDCS). Less frequently, transcranial alternating current stimulation (tACS) or transcranial random noise stimulation (tRNS), a specific form of tACS using an electrical current applied randomly within a pre-defined frequency range, is used. The increase of noninvasive electrical brain stimulation research in humans, both for experimental and clinical purposes, has yielded an increased need for basic, mechanistic, safety studies in animals. This article describes a model for transcranial electrical brain stimulation (tES) through the intact skull targeting the motor system in alert rodents. The protocol provides step-by-step instructions for the surgical set-up of a permanent epicranial electrode socket combined with an implanted counter electrode on the chest. By placing a stimulation electrode into the epicranial socket, different electrical stimulation types, comparable to tDCS, tACS, and tRNS in humans, can be delivered. Moreover, the practical steps for tES in alert rodents are introduced. The applied current density, stimulation duration, and stimulation type may be chosen depending on the experimental needs. The caveats, advantages, and disadvantages of this set-up are discussed, as well as safety and tolerability aspects.

This protocol describes a surgical set-up for a permanent epicranial electrode socket and an implanted chest electrode in rodents. By placing a second electrode into the socket, different types of transcranial electrical brain stimulation can be delivered to the motor system in alert animals through the intact skull.

Transkranielle elektrische Hirnstimulation in Alert Nagetiere

Transcranial electrical brain stimulation can modulate cortical excitability and plasticity in humans and rodents. The most common form of stimulation in ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Isolation und RNA-Extraktion von Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Larven Zebrafisch Gehirne

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional abnormalities of LC impact several brain regions including cortex, hippocampus, and cerebellum and may contribute to depression, bipolar disorder, anxiety, as well as Parkinson disease and Alzheimer disease. These disorders are often associated with metal misbalance, but the role of metals in LC is only partially understood. Morphologic and functional studies of LC are needed to better understand the human pathologies and contribution of metals. Mice are a widely used experimental model, but the mouse LC is small (~0.3 mm diameter) and hard to identify for a non-expert. Here, we describe a step-by-step immunohistochemistry-based protocol to localize the LC in the mouse brain. Dopamine-&#946;-hydroxylase (DBH), and alternatively, tyrosine hydroxylase (TH), both enzymes highly expressed in the LC, are used as immunohistochemical markers in brain slices. Sections adjacent to LC-containing sections can be used for further analysis, including histology for morphological studies, metabolic testing, as well as metal imaging by X-ray fluorescence microscopy (XFM).

The locus coeruleus is a small cluster of neurons involved in a variety of physiological processes. Here, we describe a protocol to prepare mouse brain sections for studies of proteins and metals in this nucleus.

Lokalisierung von Locus Coeruleus im Gehirn Maus

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional ...

A Bedside, Single Burr Hole Approach to Multimodality Monitoring in Severe Brain Injury

Intracranial pressure (ICP) monitoring is a cornerstone of the intensive care management of patients with severe acute brain injuries, including traumatic brain injury. While elevations in ICP are common, data regarding the measurement and treatment of these ICP elevations are conflicting. There is increasing recognition that changes in the balance between supply and demand of brain tissue are critically important and therefore the measurement of multiple modalities is required. Approaches are not standard, and therefore this article provides a description of a bedside, single burr hole approach to multimodality monitoring that allows the passage of probes designed to measure not only ICP but brain tissue oxygen, blood flow, and intracranial electroencephalography. Patient selection criteria, operative procedures, and practical considerations for securing probes during critical care are described. This method is readily performed, safe, secure, and flexible for the adoption of a variety of multimodality monitoring approaches aimed at detecting or preventing secondary brain injuries.

A method of recording multimodality monitoring signals in patients with severe brain injuries using a bedside, single burr hole technique is described.

Ein Nachttisch, einzelne Burr Loch Ansatz zur Multimodalität Überwachung in schwere Hirnschädigung

Intracranial pressure (ICP) monitoring is a cornerstone of the intensive care management of patients with severe acute brain injuries, including traumatic ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. We have developed a software package for accurate and robust shape modeling and group-wise analysis. Here, we introduce an pipeline for the shape analysis, from individual 3D shape modeling to quantitative group shape analysis. We also describe the pre-processing and segmentation steps using open software packages. This practical guide would help researchers save time and effort in 3D shape analysis on brain structures.

We introduce a semi-automatic protocol for shape analysis on brain structures, including image segmentation using open software, and further group-wise shape analysis using an automated modeling package. Here, we demonstrate each step of the 3D shape analysis protocol with hippocampal segmentation from brain MR images.

Dreidimensionale Formmodellierung und Analyse von Gehirnstrukturen

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a combination of focused ultrasound (FUS) induced blood-brain barrier opening (FUS-BBBO), gene delivery with adeno-associated viral (AAV) vectors, and activation of cellular signaling with engineered, chemogenetic, protein receptors and their cognate ligands. With ATAC, it is possible to transduce both large and small brain regions with millimeter precision using a single noninvasive ultrasound application. This transduction can later allow for a long-term, noninvasive, device-free neuromodulation in freely moving animals using a drug. Since FUS-BBBO, AAVs, and chemogenetics have been used in multiple animals, ATAC should also be scalable for the use in other animal species. This paper expands upon a previously published protocol and outlines how to optimize the gene delivery with FUS-BBBO to small brain regions with MRI-guidance but without a need for a complicated MRI-compatible FUS device. The protocol, also, describes the design of mouse targeting and restraint components that can be 3D-printed by any lab and can be easily modified for different species or custom equipment. To aid reproducibility, the protocol describes in detail how the microbubbles, AAVs, and venipuncture were used in ATAC development. Finally, an example data is shown to guide the preliminary investigations of studies utilizing ATAC.

This protocol delineates steps necessary for the gene delivery through focused ultrasound blood brain barrier (BBB) opening, evaluation of the resulting gene expression, and measurement of neuromodulation activity of chemogenetic receptors through histological tests.

Fokussierte ultraschallinduzierte Öffnung der Blut-Hirn-Schranke zur gezielten Behandlung von Hirnstrukturen und zur Beurteilung der chemogenetischen Neuromodulation