Dieses Protokoll bietet einen neuen Ansatz zur Quantifizierung der Zweigdynamik der dendritischen Laube und zur Entwicklung von Neuronen mithilfe von Live-Zeitraffer-Bildgebung und einer 3D-Bildanmerkungssoftware. Diese Technik bildet und verfolgt die Zweigklemmen und bietet eine schnelle und effiziente Methode zur Messung des dynamischen Verhaltens der dendritischen Filopodia. Die Forschung mit dieser Methode gibt Einblicke in das Verständnis, wie Entwicklung und Aktivität die Dendritenmorphogenese regulieren.
Unsere Methoden sind sowohl in in vitro als auch in vivo auf dünn markierte Neuronen anwendbar. Denken Sie bei dieser Ausführung dieses Verfahrens daran, dass die bildgebenden Parameter sorgfältig angepasst werden müssen, um eine ausreichende zeitliche und räumliche Auflösung zu erreichen. Um Gehirne aus Larvendrosophila zu ernten, unter einem Sezieren Mikroskop verwenden Sie ein Paar von Nummer fünf Standard-SpitzensesektionSzange, um eine Larvenprobe an Ort und Stelle zu halten, während die andere verwendet, um sorgfältig das Gehirn zu sezieren, die Augenscheiben, Gehirnlappen, und ventrale Nervenschnur zu erhalten.
Entfernen Sie dann die angeschlossenen Muskeln, um jede Bewegung der Probe während der Bildgebung zu minimieren. Wenn alle Gehirne geerntet sind, verwenden Sie Vakuumfett, um eine quadratische Kammer auf eine Glasrutsche zu ziehen und 20 Mikroliter externe Saline-Lösung in die Kammer hinzuzufügen. Verwenden Sie die Zange, um die Gehirne in die Kammer zu übertragen und die Positionen der Gehirne unter dem Mikroskop mit den dorsalen Seiten nach oben anzupassen.
Bedecken Sie die Kammer mit einem Glasdeckel-Slip und drücken Sie vorsichtig auf den Deckelschlupf, um das Abdriften der Proben während des Bildgebungsverfahrens zu reduzieren. Um Hirnexplantationen zu identifizieren, die individuell markierte Neuronen enthalten, wählen Sie innerhalb von 30 Minuten nach der Sezierung ein 40-faches Wasser-Eintauchziel und eine Epifluoreszenzlichtquelle aus. Wählen Sie einen zwei Photonenlaser mit 920 Nanometern und einen Nicht-Dscan-Detektor aus, und legen Sie die Bildparameter fest, um die Bilder auf 512 x 512 Pixel pro Frame und eine Minute pro Z-Stack für 10 Minuten zu erfassen.
Passen Sie dann den optischen und digitalen Zoom an, um eine ausreichende X-, Y-, Z-Auflösung zu erzielen und gleichzeitig die Abdeckung der gesamten dendritischen Laube innerhalb einer Minute sicherzustellen. Die Einstellungen erzeugen Bilder mit einer typischen X-, Y-, Z-Auflösung von 0,11 x 0,11 mal 0,25 Mikrometern. Für die Driftkorrektur öffnen Sie die Interessendatei in einem geeigneten Driftkorrektur-Softwareprogramm und klicken Sie auf Mikroskopische Parameter bearbeiten und bearbeiten.
Stellen Sie den Mikroskoptyp für die beiden Photonenbilder auf "Breitfeld", wenn es eine Zwei-Photon-Option gibt, und folgen Sie dem von der Software definierten Workflow. Öffnen Sie zur Dekonvolution das driftkorrigierte Bild in der Dekonvolution-Software und folgen Sie dem Workflow. Speichern Sie dann das dekonvolvedbildte Bild in einem Dateityp, der von der nachfolgenden Bildanmerkungssoftware unterstützt wird, die 4D-Daten analysieren und die räumlichen Koordinaten definierter Flecken innerhalb des Bildes melden kann.
Öffnen Sie für Bildanmerkungen das dekonvolvedbildte Bild in der Bildanmerkungssoftware, und untersuchen und markieren Sie die Verzweigungsspitzen zu allen Zeitpunkten in 3D. Die Bildanmerkungssoftware meldet und speichert die räumlichen und zeitlichen Koordinaten der markierten Verzweigungsspitzen. Exportieren Sie die Koordinateninformationen als CSV-Datei für nachfolgende Berechnungen.
Klicken Sie im Spots-Modul auf Automatische Erstellung überspringen, manuell bearbeiten und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Automatische Verbindung mit ausgewähltem Punkt. Überprüfen Sie die Frames in der Zeitreihe, und wählen Sie einen Zweig für Anmerkungen aus. Wenn Sie die Umschalttaste gedrückt halten, klicken Sie auf die Zweigklemmenspitze, um einen Punkt hinzuzufügen.
Klicken Sie dann auf die Registerkarte Statistik, und wählen Sie Detaillierte Werte, Bestimmte Werte und Position aus. Die aufgezeichneten räumlichen und zeitlichen Koordinateninformationen werden angezeigt. Klicken Sie auf Speichern, um die Daten als CSV-Datei zu exportieren.
Um die Verzweigungsspitze in 3D zu berechnen, öffnen Sie die CSV-Datei als Kalkulationstabelle, und wählen Sie die Spalte Spur-ID aus. Klicken Sie auf Kleinstes Sortieren nach Größte, und akzeptieren Sie die Auswahl erweitern. Nach dem Sortieren identifiziert Track ID jeden eindeutigen dendritischen Zweig und die Spots aus derselben Zweigstelle haben dieselbe Spur-ID. Die Spalte Zeit speichert die Informationen aus verschiedenen Zeitrahmen.
Fügen Sie in der Kalkulationstabelle eine Spalte Entfernung hinzu, und verwenden Sie die Koordinaten, um die Entfernung von zwei zeitlich benachbarten Punkten zu berechnen. Um kleinere Bewegungen auf einer Voxelebene zu messen, setzen Sie alle Entfernungswerte kleiner als 0,3 Mikrometer zurück, um unkorrigierte Drift- oder unvollkommene Bildanmerkungen zu filtern. Erstellen Sie als Nächstes eine Spalte Verschiebung, und kopieren Sie die Werte aus der Spalte Entfernung in die Spalte Verschiebung.
Weisen Sie die Erweiterungs- und Rückzugsereignisse manuell für jede Zweigspitze zu. Wenn es sich um eine Erweiterung handelt, lassen Sie den positiven Verschiebungswert unverändert. Wenn es sich um einen Rückzug handelt, ändern Sie den entsprechenden Verschiebungswert in einen negativen Wert.
Summieren Sie dann in einer neuen Ereignisspalte die Verschiebungswerte für einzelne Erweiterungs- und Rückzugsereignisse. In diesem Video kann eine maximale Intensität projizierte Bildserie aus einem repräsentativen individuell beschrifteten ventralen Lateralneuron beobachtet werden. Einzelbildbilder ermöglichen die Auswertung der Rückzugs- und Erweiterungsereignisse.
Die halbautomatische 4D-Verfolgung der Zweigklemmen ermöglicht die Annotation der dynamischen Zweigklemmen von individuell beschrifteten ventralen Lateralneuronen, wie gezeigt. Die Berechnung der Richtung und des Abstands der Zweigbewegungen an jedem Zeitpunkt ermöglicht einen Vergleich der dendritischen Zweigdynamik für individuell beschriftete ventrale Lateralneuronen in verschiedenen Entwicklungsstadien. Der wichtigste Schritt ist die Erhaltung der Integrität des Hirngewebes und des Dendritmorpholos während der Zerlegung und Montage.
Die Qualität der Rohbildserie ist auch entscheidend für eine erfolgreiche Nachverfolgung und Quantifizierung. Mit dieser Technik gewannen wir die Fähigkeit, quantitative Analysen von Dendritenfilopodien bei der Entwicklung von drosophila zentralen Neuronen durchzuführen und die molekulare Maschinerie zu erforschen, die die Dendritreifung und Synaptogenese betrifft.
