Mit unserem Protokoll können wir die Dynamik von Signalendosomen und Mitochondrien in Axonen von motorischen und sensorischen Neuronen lebender betäubter Mäuse visualisieren und quantitativ bewerten. Diese Methode kann verwendet werden, um die Basalphysiologie von Axonen in vivo zu verstehen und einen wichtigen Pathomechanismus aufzudecken, der die periphere Neurodegeneration im Mausmodell der Krankheit antreibt. Unsere Technik kann verwendet werden, um die Wirkung potenzieller Behandlungen wie pharmakologischer Wirkstoffe und Gentherapien auf den axonalen Transport in lebenden motorischen und sensorischen Neuronen zu bewerten.
Diese Technik kann verwendet werden, um gleichzeitig verschiedene Organellen in einem bestimmten peripheren Nervenaxon abzubilden und das Studium von motorischen Krankheitsmodellen sowie das Altern weiterzugeben. Beginnen Sie die Vorbereitungen, indem Sie eine abgestufte Glasmikropipette für optimale intramuskuläre Injektionen in kleinere Muskeln ziehen. Sichern Sie für die Operation einen sterilen chirurgischen Vorhang auf einer auf 37 Grad Celsius eingestellten Wärmematte und positionieren und fokussieren Sie das Operationsmikroskop.
Packen Sie dann alle erforderlichen chirurgischen Werkzeuge und Instrumente aus, wie im Manuskript beschrieben. Wenn die Vorbereitungen abgeschlossen sind, übertragen Sie die betäubte Maus auf das Mundstück, das sich in einem separaten Bereich des Operationsraums befindet, und stellen Sie sicher, dass sowohl die Hornhaut- als auch die Pedalentzugsreflexe fehlen, bevor Sie das Fell vom Operationsbereich rasieren. Entfernen Sie dann das rasierte Fell von der Maus mit der klebrigen Seite des chirurgischen Klebebandes.
Als nächstes legen Sie die Maus auf die Waage, um das präoperative Gewicht aufzuzeichnen. Verwenden Sie dann ein Wattestäbchen, um Augengleitmittel aufzutragen und die Maus und das Mundstück in den Operationsbereich zu übertragen. Um den Taibialis anterior oder TA-Muskel zu injizieren, legen Sie die Maus auf den Rücken und strecken Sie die Hintergliedmaße um 10 Grad von der Mittellinie aus.
Wenn sich die Hintergliedmaße in der richtigen Position befindet, legen Sie ein chirurgisches Klebeband über den Fuß. Sterilisieren Sie den rasierten Bereich mit einem 70%igen Ethanol oder einer gleichwertigen Lösung. Ziehen Sie das arbeitende atoxische Fragment von Tetanus, Neurotoxin oder HcT-Lösung in eine gezogene Glasmikropipette.
Als nächstes machen Sie einen kleinen Einschnitt über den interessierenden Muskel in dem Bereich, der den motorischen und Plattenregionen entspricht. Dann. Durchbohren Sie die äußere Faszie am Muskel, um das HcT zu injizieren. Lassen Sie die Mikropipette fünf bis 10 Sekunden in Position, bevor Sie sich langsam zurückziehen.
Schließen Sie nach der Injektion die Einschnitte mit ein bis zwei Stichen. Anschließend bringen Sie die Maus 30 Minuten lang unter Beobachtung in einen isolierten Auffangkäfig. Bereiten Sie sich darauf vor, den Ischiasnerv freizulegen, indem Sie die chirurgischen Werkzeuge und Instrumente um den Operationsbereich herum anordnen.
Erstellen Sie einen Keil, indem Sie den Parafilm in ein schmales Rechteck von einem Zentimeter Breite mit einer abgewinkelten Spitze schneiden, um den Bildgebungsprozess zu unterstützen. Sobald die Vorbereitungen abgeschlossen sind, übertragen Sie die Maus auf das Mundstück im Operationsbereich und verwenden Sie chirurgisches Klebeband, um den Kopf am Mundstück zu befestigen. Verlängern und sichern Sie das anvisierte Hinterteil bei 45 Grad von der Mittellinie mit chirurgischem Klebeband.
Wenn Hornhaut- und Pedalentzugsreflexe fehlen, schneiden Sie die Haut über dem Ischiasnerv mit einer Schere ab. Entfernen Sie dann den darüber liegenden Bizeps-Femoris-Muskel und die Muskulatur oder das Bindegewebe, ohne den Ischiasnerv und die Blutgefäße zu schädigen. Wenn der intakte Ischiasnerv ausreichend exponiert ist, tragen Sie vorgewärmte sterile Kochsalzlösung auf den Bereich um den Ischiasnerv auf, um eine Austrocknung zu verhindern.
Verwenden Sie dann eine gekrümmte Pinzette, um das tief liegende Bindegewebe zu stören, und legen Sie den vorbereiteten Parafilmkeil unter den Nerv. Legen Sie salzhaltige Watte auf den exponierten Bereich, bevor Sie die Maus auf die Wärmematte in die mit Isofluran und Sauerstoff gefüllte Induktionskammer bewegen. Legen Sie für die Bildgebung ein 22 x 64 Millimeter großes Deckglas auf den kundenspezifischen Mikroskoptisch und sichern Sie die Position des Deckglases mit einem Klebeband.
Nachdem Sie Tauchöl auf das Objektiv aufgetragen haben, verbinden Sie den Mikroskoptisch mit dem inversen Mikroskop und heben Sie das öleingetauchte Objektiv langsam an, um das Deckglas zu berühren. Wenn das Setup fertig ist, befestigen Sie das Anästhesiemundstück mit Klebeband auf dem Mikroskoptisch. Entfernen Sie dann die Watte vom Ischiasnerv und übertragen Sie die Maus von der Induktionskammer zum Mundstück mit dem freiliegenden Nerv zum Deckglas.
Befestigen Sie den Kopf der Maus am Mundstück und heben Sie die Maus vorsichtig am Schwanz an, während Sie das niedrigste ausreichende Anästhesieniveau beibehalten, um sterile Kochsalzlösung zum Deckschlicker in der Nähe des freiliegenden Ischiasnervs hinzuzufügen. Lokalisieren Sie mit Hilfe des Okulars den Ischiasnerv, um den optimalen Brennpunkt zu bestimmen, und wählen Sie einen Interessenbereich aus, der bewegliche axonale Organellen enthält. Wechseln Sie anschließend zur Computersoftware, indem Sie auf die Schaltfläche Erfassung klicken und einen Interessenbereich auswählen.
Verwenden Sie den digitalen Zoom, um eine 80-fache Vergrößerung zu erhalten, und drehen Sie den ausgewählten Bereich, um die Axone horizontal zu visualisieren Klicken Sie auf das Feld Regionen und wählen Sie einen rechteckigen Bereich von Interesse aus. Legen Sie im Erfassungsmodus die Framegröße auf mindestens 1024 x 1024 Pixel fest und beginnen Sie mit der Zeitraffererfassung von 100 bis 1.000 Frames. Erfassen Sie mindestens 10 bewegliche Ladungen von den drei Axonen pro Maus.
In der Studie wurde eine in vivo motorische axonspezifische Markierung mit transgenen Mäusen erreicht. Das verstärkte grüne Fluoreszenzprotein oder eGFP-Expression in cholinergen motorischen Axonen wurde an einem lebenden, betäubten ChAT beobachtet. eGFP-Maus.
Mit der alternativen Methode, tdTomato Expression in einem frisch herausgeschnittenen Nerv von einem ChAT. tdTomatenmaus wurde ohne zusätzliche Gewebeverarbeitung erreicht. Zusätzlich wurden Axone identifiziert, indem Tracer oder Marker wie HcT oder Adenoviren, die eGFP kodieren, in die Skelettmuskulatur injiziert wurden.
Die repräsentative Analyse zeigt eine Zeitraffer-Bildserie, die den axonalen Transport von Signalendosomen in lebenden Motoneuronen eines HB9 in vivo darstellt. GFP-Maus. Das GFP hatte in HB9 ein detaillierteres Muster.
GFP-Axone. Die Zucht von Mito. CFP-Mäuse mit ChAT.
tdTomato-Mäuse ermöglichten die Visualisierung von Mitochondrien in den motorischen Axonen. Darüber hinaus konnte auch der Knoten von Ranvier identifiziert werden. Die HcT-Injektion in die Muskeln des Mito.
CFP-Mäuse ermöglichten die gleichzeitige Visualisierung von Signalendosomen und Mitochondrien innerhalb derselben Axone in vivo. Anterograde und retrograde sich bewegende Organellen sowie festgefahrene Organellen wurden beobachtet. Eine reduzierte Anästhesie während des bildgebenden Prozesses ist von Vorteil, da sie die Auswirkungen großer Atemartefakte begrenzen und so die Verfolgung und Analyse des axonalen Transports vereinfachen kann.
Ischiasnerven können für die RNA- und Proteinanalyse lehrreich sein, um die Organellendynamik mit Schlüsselkomponenten der axonalen Transportmaschinerie wie Motorproteinen und frachtspezifischen Adaptern zu korrelieren.
