Supported by NIH Grants NS14837, R01 NS38537, R24 HD050838 to Dr. Michael E. Selzer; Shriners Research Grant SHC-85220 to Dr. Michael E Selzer; and Shriners Research Grant SHC-85310 to Dr. Michael I. Shifman. Dr. Ant&#243;n Barreiro-Iglesias was supported by the Fundaci&#243;n Barri&#233; (Spain) and the Xunta de Galicia (Galicia, Spain).

Siehe Tabelle 1 für alle in diesem Protokoll verwendeten Materialien. Die Experimente wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Temple University zugelassen. 1. Tiere <ol><li> Erhalten Wildtyp-Larven Meerneunaugen (Petromyzon marinus L.), von 10 - 14 cm in der Länge (4 - 7 Jahre alt) aus Bächen Fütterung Lake Michigan, von Nebenflüssen auf dem Delaware River (Pennsylvania) oder Streams in Maine. </li><li> Im Labor halten Larven in Gruppen von 50 bis 100 Tiere in 50 Gallonen Frischwasserbehälter bei 16 ° C aufweist. Leitung die Tanks mit einem Zoll von Kies für die Larven zu graben, und das Wasser wird Kohle filtriert und mit Klimaanlage Steine ​​für mindestens 48 h zu Chlor und andere Verunreinigungen vor dem Einlegen in die Neunaugen zu entfernen. Es besteht keine Notwendigkeit, die Tiere, die ihre eigenen Schutt recyceln, bis zum Tag der Verwendung zuzuführen. </li></ol> 2. Vollständige SpinalKabel Trennung <ol><li> Vor dem Rückenmark Chirurgie bereiten ein Neunauge Ringer-Lösung mit folgender Zusammensetzung: 110 mM NaCl, 2,1 mM KCl, 2,6 mM CaCl 2, 1,8 mM MgCl 2 und 10 mM Tris-Puffer; pH-Wert 7,4. </li><li> Um die Rückenmarksdurchtrennung durchführen, legen die Larven in einem kleinen Behälter mit 1% Tricaine Methansulfonat- in eiskaltem Ringer-Lösung betäubt werden. </li><li> Sobald narkotisierten Ort die Tiere in einer Petrischale zur Hälfte mit Sylgard (Silikon) gefüllt und mit 4 Insektenstifte (0,15 mm Durchmesser), um die Tiere in der Position für die Operation zu halten (man ist an der Schnauze des Tieres am Heck platziert, eine und zwei auf der Höhe des 5. Gill). Füllen Sie die Petrischale fast bis an die Spitze mit Ringerlösung. Setzen Sie die Schale mit der Larve auf Eis, während der Durchführung der Operation unter dem Stereomikroskop. </li><li> Auf das Rückenmark durchtrennt eine dorsale durchzuführen, Mittellinie, einen Längsschnitt mit einem Skalpell (# 11) auf der Ebene des 5.Kiemen des Rückenmarks zu visualisieren. Zunächst ist die Haut, indem Sie die Spitze des Skalpellklinge nach oben und dann das Muskelgewebe sehr schonend geschnitten, bis das Rückenmark von oben gesehen werden geöffnet. Mode zwei Haken von den Insektenstifte und nutzen sie, um zu halten die Körperwände offen, während der Durchführung der Durchtrennung des Rückenmarks. </li><li> Komplett durchschneiden das Rückenmark auf Höhe des 5. Kiemen mit Hilfe einer Schere (Castroviejo # 8), legen Sie die Schere senkrecht zum Rückenmark. Das Rückenmark ist vollständig mit einem sauberen Schnitt durchtrennt werden. Visualisieren die Rückenmarksschnittenden unter dem Stereomikroskop, um zu bestätigen, dass das Rückenmark durchtrennt wurde komplett ist. Dann richten Sie die Schnittenden des Rückenmarks nach der Durchtrennung mit Hilfe einer Pinzette (# 5). </li><li> Nach der Durchführung der Durchtrennung des Rückenmarks die Wunde in der dorsalen Körperwand mit einer feinen Pinzette und setzen die Larven auf Eis für 1 Stunde, um die Wunde t erlaubeno trocknen. Setzen Sie ein Stück Filterpapier zwischen dem Eis und der Larven und genießen Sie es mit Neunauge Ringer-Lösung. Die niedrige Temperatur hält die Tiere am Leben in der gleichen Zeit, die es ermöglicht, die Wunde an der Luft trocknen und damit hilft, Infektionen zu verhindern. </li><li> Übertragen Sie anschließend die Larven zu kleinen Tanks (1 Larve pro Tank) mit eiskaltem Wasser für 24 Stunden. </li><li> Untersuchen Sie die lädierten Larven 1 Tag nach der Durchtrennung des Rücken zu verhaltens bestätigen, dass es keine Bewegung Schwanz an den Ort der Verletzung. Eine Rückenmarksdurchtrennung gilt als abgeschlossen, wenn die Larve kann nur den Kopf rostral der Stelle der Verletzung zu bewegen (auf der Ebene des 5. Kiemen). Wenn dies der Fall ist kann nun die Larven, Panzer (1 Larve pro Tank) mit Frischwasser bei Raumtemperatur (23 übertragen werden ° C), damit sie für den gewählten Zeitpunkten zu erholen. </li><li> Während der Erholungsphase das Wasser wechseln alle 2 bis 3 Tage. </li></ol> 3. Gehirn Dissection und Vorbereitung derdas Gehirn für in-situ-Hybridisierung <ol><li> Bei der gewünschten Zeitpunkten nach der Verletzung wieder zu betäuben die Larvenmeerneunaugen und Ort und hänge sie in der Petrischale mit Ringer-Lösung, um das Gehirn Dissektion wie oben durchzuführen. </li><li> Um das Gehirn zu sezieren, zuerst eine Querschnitt mit dem Skalpell zwischen dem Nasenloch und der Zirbeldrüse Orgel. Von hier aus beginnen, die rund um das Gehirngewebe, indem ein Paar von Castroviejo Schere, während es mit einer Pinzette halten geschnitten. </li><li> Sobald das Gehirn ausgesetzt ist, entfernen Sie die Adergeflecht mit Hilfe einer Pinzette und verwenden Sie die Haken, um den Kopf des Tieres zu verbreiten und setzen die Hirnnerven. Dann schneiden Sie das Rückenmark quer mit den Castroviejo Schere. Halten Sie das Rückenmark mit einer Pinzette, während mit einer anderen Pinzette, um die Hirnnerven geschnitten, um das Gehirn zu sezieren. </li><li> Nach der Sektion, legte das Gehirn auf einem kleinen Stück aus Silikon und halten sie in Position, indem Sie 2 insect Stifte im Riechkolben und 1 im Rückenmark. Dann schneiden Sie den hinteren und cerebrotectal Kommissuren des Gehirns entlang der dorsalen Mittellinie mit der Schere und lenken die Flügelplatte seitlich und stecken Sie sie flach auf den Silikon mit 4 Insektenstifte (Abbildung 2). </li><li> Übertragen des Stücks aus Silikon mit dem Gehirn in ein Röhrchen mit 4% Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7,4) bei Raum temparature 3 h auf einem Rotator befestigt werden. </li><li> Nach der Fixierung mit dem Gehirn für Wholemount in situ Hybridisierung, wie zuvor beschrieben (Swain et al., 1994). Gehirne von Kontrolle oder scheinoperierten Tiere sollten immer parallel mit den Gehirnen von verletzten Tieren ausgeführt werden. Die wholemounted Larven Gehirn durch in situ Hybridisierung wegen seiner flachen und dünnen Form und auch wegen der Abwesenheit von Myelin 10, die das Gehirn relativ scheinend macht sucht werden. </li></ol>

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	<li>Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lampreys+as+an+animal+model+in+regeneration+studies+after+spinal+cord+injury.">Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury.</a> Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).</li><li>Davis, G. R., McClellan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extent+and+time+course+of+restoration+of+descending+brainstem+projections+in+spinalcord-transected+lamprey.">Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey.</a> J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).</li><li>Jacobs, A. J., Swain, G. P., Snedeker, J. A., Pijak, D. S., Gladstone, L. J., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+neurofilament+expression+selectively+in+regenerating+reticulospinal+neurons.">Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons.</a> J Neurosci. 17, 5206-5220 (1997).</li><li>Shifman, M. I., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+netrin+receptor+UNC-5+in+lamprey+brain+modulation+by+spinal+cord+transection.">Expression of the netrin receptor UNC-5 in lamprey brain modulation by spinal cord transection.</a> Neurorehabil Neural Repair. 14, 49-58 (2000).</li><li>Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sea+lamprey+UNC5+receptors+cDNA+cloning,+phylogenetic+analysis+and+expression+in+reticulospinal+neurons+at+larval+and+adult+stages+of+development.">The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development.</a> J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).</li><li>Shifman, M. I., Yumu, l. R. E., Laramore, C., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+repulsive+guidance+molecule+RGM+and+its+receptor+neogenin+after+spinal+cord+injury+in+sea+lamprey.">Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey.</a> Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).</li><li>Busch, D. J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synuclein+accumulation+is+associated+with+cell-specific+neuronal+death+after+spinal+cord+injury.">Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury.</a> J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).</li><li>Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+death+of+identified+reticulospinal+neurons+after+spinal+cord+injury+in+lampreys.">Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys.</a> J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).</li><li>Swain, G. P., Jacobs, A. J., Frei, E., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+in+situ+hybridization+in+wholemounted+lamprey+brain+neurofilament+expression+in+larvae+and+adults.">A method for in situ hybridization in wholemounted lamprey brain neurofilament expression in larvae and adults.</a> Exp. Neurol. 126, 256-269 (1994).</li><li>Bullock, T. H., Moore, J. K., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+myelin+sheaths:+both+lamprey+and+hagfish+lack+myelin.">Evolution of myelin sheaths: both lamprey and hagfish lack myelin.</a> Neurosci Lett. 48, 145-148 (1984).</li><li>Cohen, A. H., Kiemel, T., Pate, V., Blinder, J., Guan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+can+alter+the+function+outcome+of+spinal+cord+regeneration+in+larval+lampreys.">Temperature can alter the function outcome of spinal cord regeneration in larval lampreys.</a> Neuroscience. 90, 957-965 (1999).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Hier präsentieren wir Ihnen ein ausführliches Protokoll, um eine komplette Durchtrennung des Rückenmarks und hinteren Hirn Dissektion in Larvenmeerneunaugen durchzuführen. Dieses Verfahren ermöglicht die Analyse Unterschiede in der Genexpression zwischen den identifizierbaren Rückenmark vorst Neuronen nach einer Rückenmarksverletzung durch eine ganze Montage Gehirn in situ Hybridisierung. Der kritische Schritt in dem Verfahren ist die korrekte Ausführung einer vollständigen Durchtrennung des Rückenmarks, die d...

Bei Säugetieren Rückenmarksverletzungen (SCI) ist eine verheerende Erkrankung, die zu dauerhaften Verlust der Funktion unterhalb der Verletzungsstelle führt, weil verletzt Axone nicht durch das Trauma Zone zu regenerieren und wieder in die entsprechenden Ziele. Im Gegensatz zu Säugetieren, Neunaugen erholen Fortbewegung nach einer kompletten Rückenmarksverletzungen. 1 Interessanterweise Neunaugen haben einen Satz von 36 Rückenmark hervorstehenden Neuronen, die in individuell identifizierbar sind ganze Gehirn-Mount-Präparate wegen ihrer großen Größe 2,3 (Abbildung 1) . Alle diese Rücken ragenden Neuronen werden von einer hochrangigen komplette Durchtrennung des Rückenmarks axotomisierten. Frühere Studien unserer Gruppe und andere haben gezeigt, dass auch in der Gegenwart die funktionelle Erholung nach einer Rückenmarks einige dieser Neuronen zeigen eine sehr geringe Regenerationsfähigkeit (sie werden als &quot;schlecht Regeneratoren&quot;), während andere in der Regel regenerieren ihre Axon durch den Ort der Verletzung (sie werden als &quot;gOOD Regeneratoren &quot;). 2,3 Diese Eigenschaft macht Neunaugen eine interessante Wirbeltiermodell, um die Unterschiede in der Genexpression zwischen guten und schlechten Regenerator Rücken ragenden Neuronen, die wiederum auf die Unterschiede in der intrinsischen Regenerationsfähigkeit von Neuronen, die versuchen Leitstudie regenerieren ihre Axone in der gleichen äußeren Umgebung. 1 Mit diesem Modell haben wir bereits gezeigt, dass Rücken ragenden Neuronen mit niedrigen Regenerationsfähigkeit zeigen Ausdruck der axonalen Führung Molekül Rezeptoren wie UNC5 4,5 und Neogenin, 6, die die hemmende Wirkung von Netrin und RGM bzw. zu vermitteln. Darüber hinaus kann durch diese Methode unserer Gruppe hat auch gezeigt, dass nur die guten Regeneratoren zeigen eine Erholung der Ausdruck von Neurofilamenten nach der Verletzung und während des Regenerationsprozesses. Kürzlich, Busch und Morgan 7 wurden durch Immunfluoreszenz gezeigt, dass die schlechten Regeneratoren zeigen eine zunehed Expression Synuclein nach der Verletzung, die von den Autoren der Tatsache, dass die &quot;schlechte Regenerator&quot; spinal ragenden Neuronen langsam nach einer vollständigen Durchtrennung des Rückenmarks 5,7,8 sterben bezogen wurde. So hat sich die Neunaugen Modell eines kompletten Rückenmarksverletzung als ein sehr nützliches Modell zu verstehen, was eine Rückenmark hervorstehenden Neuron eine &quot;schlechte Regenerator&quot; nach Axotomie entstanden. Unseren Untersuchungen führen wir führen eine komplette Durchtrennung des Rückenmarks-Chirurgie-Protokoll und eine hintere Gehirn Dissektion bei den gewünschten Zeitpunkten nach der Verletzung von wholemount in-situ-Hybridisierung durchzuführen. In der vorliegenden methodischen Artikel stellen wir ein ausführliches Protokoll für die ordnungsgemäße Durchführung eines kompletten Rückenmarksverletzungen Chirurgie in Larvenneunaugen, die anschließende Pflege der Tiere und die letzte Gehirn Präparation und Vorbereitung des Gehirns für eine wholemount in-situ-Hybridisierung. Ein detailliertes Protokoll perform die Wholemount in situ-Hybridisierung im Gehirn von Larven Neunaugen wurde bereits berichtet. 9 Darüber hinaus kann dieses Protokoll für die Verletzung des Rückenmarks und des Gehirns Präparation auch verwendet werden, um dann verarbeitet das Gehirn für die Immunhistochemie oder anderen histologischen Methoden werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="280">
	<tbody>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:83px;">Company</td>
			<td style="width:64px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:71px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:64px;">Tricaine methane sulfonate</td>
			<td style="width:83px;">Spectrum</td>
			<td style="width:64px;">TR108</td>
			<td style="width:71px;">Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Scalpel #3</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools (FST)</td>
			<td style="width:64px;">10003-12</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Blades for scalpel: #11</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:64px;">10011-00</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Castroviejo scissors #8</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:64px;">15002-08</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="190">
			<td height="190" style="height:190px;width:64px;">Forceps #4 &#38; #5</td>
			<td style="width:83px;">Dumont, Switzerland</td>
			<td style="width:64px;">Roboz RS4955</td>
			<td style="width:71px;">#4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Dissecting Microscope</td>
			<td style="width:83px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">SZ51</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="63" rowspan="2" style="height:63px;width:64px;">Sylgard</td>
			<td rowspan="2" style="width:83px;">Dow Corning Co.</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;">184</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="189" rowspan="2" style="height:189px;width:64px;">Insect pins 0.15, 0.20 mm</td>
			<td rowspan="2" style="width:83px;">Austerlitz</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;">No catalogue #</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:64px;">7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:64px;">03-337-1</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:64px;">Paraformaldehyde 16%</td>
			<td style="width:83px;">Electron Microscopy Science (EMS)</td>
			<td style="width:64px;">19210</td>
			<td style="width:71px;">Dilute to 4% in PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complete spinal cord injury and brain dissection protocol for subsequent wholemount in situ hybridization in larval sea lamprey

Nach einer kompletten Rückenmarksverletzungen, werden Meerneunaugen auf den ersten unter dem Niveau der Durchtrennung gelähmt. Bewegungs jedoch erholen sie nach mehreren Wochen, und dies wird durch kurzes Stück Regeneration (einige mm) von propriospinale Axonen und Rücken ragenden Axone aus dem Hirnstamm begleitet. Unter den 36 großen erkennbaren Rücken ragenden Neuronen, sind einige gute Regeneratoren und andere sind schlecht Regeneratoren. Diese Neuronen können am einfachsten in wholemount CNS Vorbereitungen identifiziert werden. Um die Neuron-intrinsische Mechanismen, begünstigen oder hemmen verstehen Axon Regeneration nach Verletzung im ZNS der Wirbeltiere, bestimmen wir Unterschiede in der Genexpression zwischen den guten und schlechten Regeneratoren und wie Expression durch Rückenmarksdurchtrennung beeinflusst. Dieses Papier zeigt die Techniken für die Larvengehäuse und vor kurzem umgewandelt Erwachsenen Seeneunaugen in Frischwassertanks, produziert komplette Rückenmarksquerschnitten erhalten unter mikroskopischer Sicht, und die Vorbereitung brAin und Rückenmark wholemounts für in situ-Hybridisierung. Kurz gesagt, werden die Tiere bei 16 gehalten &#160; ° C und in 1% Benzocain in Neunauge Ringer betäubt. Das Rückenmark ist mit Iridektomie Schere über einen dorsalen Zugang durchtrennt und das Tier darf in Frischwassertanks bei 23 ° C erholen. Für in-situ-Hybridisierung werden die Tiere reanästhesiert und die Gehirn und Rückenmark über einen dorsalen Zugang entfernt.

Als Beispiel für die Ergebnisse, die bei der Verwendung dieser Methode erhalten werden können, repräsentative Bilder von wholemounted Gehirn, die die Expression der Transkripte in Neogenin identifizierbaren Rückenmark-Nervenzellen des vorstehenden Steuer und 2 Wochen nach der Läsion Larvenmeerneunaugen sind in Abbildung 2 dargestellt. Die Leser werden auf einer früheren Studie 6 die Berichterstattung über die Beziehung zwischen der Expression von Neogenin nach einer kompletten Durchtre...

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Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Neunaugen erholen Fortbewegung nach einer kompletten Rückenmarksverletzungen. Jedoch einige Rücken ragenden Neuronen sind gut Regeneratoren sind und andere nicht. Dieses Papier zeigt die Techniken für den Wohnungsbau Meerneunauge Larven (und vor kurzem umgewandelt Erwachsene), Herstellung vollständiger Rückenmarksquerschnitten erhalten und Vorbereitung wholemount Gehirn und Rückenmark für die in situ-Hybridisierung.

Komplette Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protokoll für spätere Wholemount<em&gt; In-situ</em&gt; Hybridisierung in Larven Seeneunauge

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

9.8K Aufrufe.  University of Edinburgh.  Neunaugen erholen Fortbewegung nach einer kompletten Rückenmarksverletzungen. Jedoch einige Rücken ragenden Neuronen sind gut Regeneratoren sind und andere nicht. Dieses Papier zeigt die Techniken für den Wohnungsbau Meerneunauge Larven (und vor kurzem umgewandelt Erwachsene), Herstellung vollständiger Rückenmarksquerschnitten erhalten und Vorbereitung wholemount Gehirn und Rückenmark für die in situ-Hybridisierung. 

Serie: Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Forschung

Neurowissenschaften

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

Doppel-Fluoreszenz- In situ Hybridisierung in Fresh Hirnschnitten

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and mortality. Based on the nature of primary injury following TBI, complex and heterogeneous secondary consequences result, which are followed by regenerative processes 1,2. Primary injury can be induced by a direct contusion to the brain from skull fracture or from shearing and stretching of tissue causing displacement of brain due to movement 3,4. The resulting hematomas and lacerations cause a vascular response 3,5, and the morphological and functional damage of the white matter leads to diffuse axonal injury 6-8. Additional secondary changes commonly seen in the brain are edema and increased intracranial pressure 9. Following TBI there are microscopic alterations in biochemical and physiological pathways involving the release of excitotoxic neurotransmitters, immune mediators and oxygen radicals 10-12, which ultimately result in long-term neurological disabilities 13,14. Thus choosing appropriate animal models of TBI that present similar cellular and molecular events in human and rodent TBI is critical for studying the mechanisms underlying injury and repair.
Various experimental models of TBI have been developed to reproduce aspects of TBI observed in humans, among them three specific models are widely adapted for rodents: fluid percussion, cortical impact and weight drop/impact acceleration 1. The fluid percussion device produces an injury through a craniectomy by applying a brief fluid pressure pulse on to the intact dura. The pulse is created by a pendulum striking the piston of a reservoir of fluid. The percussion produces brief displacement and deformation of neural tissue 1,15. Conversely, cortical impact injury delivers mechanical energy to the intact dura via a rigid impactor under pneumatic pressure 16,17. The weight drop/impact model is characterized by the fall of a rod with a specific mass on the closed skull 18. Among the TBI models, LFP is the most established and commonly used model to evaluate mixed focal and diffuse brain injury 19. It is reproducible and is standardized to allow for the manipulation of injury parameters. LFP recapitulates injuries observed in humans, thus rendering it clinically relevant, and allows for exploration of novel therapeutics for clinical translation 20.
We describe the detailed protocol to perform LFP procedure in mice. The injury inflicted is mild to moderate, with brain regions such as cortex, hippocampus and corpus callosum being most vulnerable. Hippocampal and motor learning tasks are explored following LFP.

Lateral fluid percussion (LFP), an established model of traumatic brain injury in mice, is demonstrated. LFP fulfills three major criteria for animal models: validity, reliability and clinical relevance. The procedure, consisting of surgical craniotomy, fixation of hub followed by induction of injury, resulting in focal and diffuse injuries, is described.

Lateral Fluid-Percussion: Modell Schädel-Hirn-Verletzungen in Mäuse

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Rückenmarksdurchtrennung in der Zebrafisch-Larven

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Ein<em&gt; Ex vivo</em&gt; Laser-induzierte Rückenmarksverletzungen Modell zu Mechanismen der axonalen Degeneration Beurteilen Sie in Echtzeit

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

Zebrafisch<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Vorbereitung für elektrophysiologische Aufzeichnungen von Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Neuronalen Aktivität im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1Imaging-GCaMP6s transgene Mäuse

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

Eine In Vivo Duo-Farbe-Methode für Imaging-vaskuläre Dynamik nach Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Intra-arterielle Lieferung von neuronalen Stammzellen an das Ratten- und Maushirn: Anwendung auf zerebrale Ischämie

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, such as cell transplantation methods, are being researched to overcome the debilitating disabilities arising from SCI. Most pre-clinical animal trials are conducted in rodent models of SCI. While rat models of SCI have been widely used, mouse models have received less attention, even though mouse models can have significant advantages over rat models. The small size of mice equates to lower animal maintenance costs than for rats, and the availability of numerous transgenic mouse models is advantageous for many types of studies. Inducing repeatable and precise injury in the animals is the primary challenge for SCI research, which in small rodents requires high-precision surgery. The transection-type injury model has been a commonly used injury model over the last decade for transplantation-based therapeutic research, however a standardized method for inducing a complete transection-type injury in mice does not exist. We have developed a surgical protocol for inducing a complete transection type injury in C57BL/6 mice at thoracic vertebral level 10 (T10). The procedure uses a small tip drill instead of rongeurs to precisely remove the lamina, after which a thin blade with rounded cutting edge is used to induce the spinal cord transection. This method leads to reproducible transection-type injury in small rodents with minimal collateral muscle and bone damage and therefore minimizes confounding factors, specifically where behavioral functional outcomes are analyzed.

This protocol describes how to create a precise laminectomy for induction of stable transection-type spinal cord injury in the mouse model, with minimal collateral damage for spinal cord injury research.

Induktion von vollständiger Transektion-Typ Rückenmarksverletzung bei Mäusen

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...