Wir sind auf die Universität von Utah Zebrafisch-Anlage für die Tierhaltung verschuldet. RID wurde von NIH R56NS053897 unterstützt und LKB war ein Promotions Auszubildenden durch die HHMI Med-In-Grad-Initiative unterstützt.

Zebrafisch wurden angehoben und nach Standardverfahren gezüchtet; Experimente wurden von der Universität von Utah Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. 1. Vorbereitung für Chirurgie Platten <ol><li> Machen Chirurgie Platten mit 60 mm Petrischalen und Sylgard 184 Silikonelastomer Kit nach Herstellerangaben. Füllen Gerichte nicht mehr als halb voll und lassen Sie polymerisieren. Shop abgedeckt bei Raumtemperatur. </li></ol> 2. Herstellung von Mikropipetten <ol><li> Fertigen Mikropipetten durch Erhitzen und Ziehen Dünnwand Borosilikat Kapillarrohr in einer Mikropipette Puller mit den gleichen Einstellungen für die Herstellung von Mikroinjektionsnadeln. </li><li> Unter einem Dissektionsmikroskop, snap off Spitze des Mikropipette auf ca. 200 um im Durchmesser mit einer Pinzette. </li><li> Kegel gebrochene Kante mit einem microgrinder zunächst auf 35 °, gefolgt von einer zweiten Abschrägung bei 25 °. Stellen Sie sicher, Spitze ist scharf und smooth. Laden beendet abgeschrägten Mikro in einer Petrischale auf einer kleinen Menge von Ton. </li></ol> 3. Vorbereitung der Zebrafisch-Larven <ol><li> 7 Tage vor der Operation, bis Gegen Tanks von männlichen und weiblichen Zebrafisch gesetzt. </li><li> Sammeln Embryonen am folgenden Morgen, 3 h nach die Lichter angehen, um maximalen Ertrag zu gewährleisten. Bei Verwendung eines transgenen Reporter Linie wie Tg (elevl3: eGFP) knu3, sortieren befruchteten Embryonen 100/100 mm-Platte in 25 ml E3 bei 28,5 ° C. Bei der Verwendung von Wildtyp, Art befruchteten Embryonen 25/100 mm-Platte in 25 ml E3 bei 28,5 ° C. </li><li> Wenn Sie einen Reporter Linie, Bildschirm Embryonen für Leuchtstofflampen Ausdruck bei 48 hpf. Ermöglichen identifiziert Embryonen bei einer Dichte von 25/100 mm Platte in 25 ml E3 bei 28,5 ° C reifen </li><li> Als Larven sind 5 dpf, bereiten Chirurgie Platte durch Abdecken mit Sylgard E2 + 10 mg / L Gentamycin Sulfat (GS) + Tricaine. <ol><li> Bereiten Erholung Gericht durch Zugabe von 25 ml E2 + GS in einen 100-mm-Petri dish. </li><li> Bereiten Skalpell durch Abkleben zusammen drei Tupfer. Dadurch wird eine dreieckige Werkzeug mit drei Nuten zu bilden. </li><li> Montieren Sie eine Mikropipette vorbereitet auf den Tupfer durch Abkleben es in eine der Rillen. </li></ol></li><li> Bei Wiederverwendung Mikropipetten, spülen, bis klar mit E2 + GS mit einer 1 ml-Spritze und einer 27 G-Nadel vor der Montage auf Tupfer. </li></ol> 4. Chirurgie <ol><li> Anesthetize 1 Platte von Larven in einer Zeit (25 Fische) mit Tricaine. Die Fische werden ausreichend betäubt, wenn sie Touch-Reaktion nicht mehr ausstellen. Es ist wichtig, dass die Fische vor der Operation vollständig betäubt, sonst werden sie zucken, wenn sie das Skalpell berührt. Die Operation wird unter einem Mikroskop Dissektion durchgeführt. </li><li> Übertragen Larven der Operation Platte. <ol><li> Bei maximaler Vergrößerung, drehen eine Larve in einer Zeit, so dass es auf seiner Seite liegt mit dem Rücken am nächsten an der Hand, die das Skalpell. </li><li> Zange Position, so dass sie auf der Sylgard ruhen,abgewinkelt über die Breite der Larve. </li><li> Verspannen des Glas Skalpell gegen einen der Arme der Zange, schneiden in den dorsalen Seitenfläche der Larve auf der Ebene der analen Poren, wird Sie sicher nicht über die ventralen Rand der Chorda geschnitten. Drehen Sie das Skalpell, um das Rückenmark zu durchtrennen. </li><li> Wiederholen Sie mit den restlichen Larven. Hinweis: Wenn eine Larve blutet, wird es nicht von der Operation zu erholen. Die Larve sofort entfernen von der Operation Platte und einschläfern es über Tricaine Überdosis. </li></ol></li><li> Nach der Operation an der Charge von Larven abgeschlossen ist, die Übertragung der Erholung Platte verletzte Tiere. Dies ist auf die Lichtung der Anästhesie unterstützen. <ol><li> Achtung: Bei der Erfassung verletzt Larven für den Transfer, sicherzustellen, dass sie Kopf oder Schwanz zunächst gesammelt: die Schadens Website nicht betonen, durch Biegen der Larven. Anmerkung: Alle für die Operation verwendeten Vorrichtungen wiederverwendet werden können, einschließlich der Mikropipetten. </li></ol></li></ol> 5. Rettung <ol><li> Transfer verletzt Larven von der Erholung Platte auf 100-mm-Platten mit 25 ml E2 + GS bei einer Dichte von 25/plate gefüllt. Lassen Sie in einem 28,5 ° C Inkubator erholen. </li><li> Überprüfen Sie täglich Platten, Entfernen kranker und toter Tiere. Sie verändern die Medien erst Coleps (Süßwasser Protozoen) in den Medien zu sehen sind. Beim Wechsel der Medien, nicht die Fische auf eine neue Platte übertragen; statt, entfernen Sie so viel wie möglich und Medien überfluten die gleiche Platte mit neuen Medien. Bei Bedarf wiederholen, um Coleps Bevölkerung zu reduzieren. </li><li> Feed-täglich mit einer kleinen Menge von pulverförmigen Lebensmitteln braten. Hinweis: Lebendfutter (zB Pantoffeltierchen oder Rädertierchen) nicht zu verletzten, bis Larven, nachdem sie die Fortbewegung wiederzugeführt werden. Andernfalls wird das Lebendfutter die Verletzungsstelle besiedeln und töten die Larven. </li></ol>

<ol>
	<li>Houweling, D. A., B&#228;r, P. R., Gispen, W. H., Joosten, E. 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G., Sato, K., Corn, A., Karcavich, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+regeneration:+intrinsic+properties+and+emerging+mechanisms.">Spinal cord regeneration: intrinsic properties and emerging mechanisms.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 13 (5), 361-368 (2002).</li><li>Kuscha, V., Barreiro-Iglesias, A., Becker, C. G., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+tyrosine+hydroxylase+and+serotonergic+systems+in+the+regenerating+spinal+cord+of+adult+zebrafish.">Plasticity of tyrosine hydroxylase and serotonergic systems in the regenerating spinal cord of adult zebrafish.</a> The Journal of comparative neurology. 520 (5), 933-951 (2012).</li><li>Becker, C. G., Lieberoth, B. C., Morellini, F., Feldner, J., Becker, T., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L1.1+is+involved+in+spinal+cord+regeneration+in+adult+zebrafish.">L1.1 is involved in spinal cord regeneration in adult zebrafish.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24 (36), 7837-7842 (2004).</li><li>Hui, S. P., Dutta, A., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+response+after+crush+injury+in+adult+zebrafish+spinal+cord.">Cellular response after crush injury in adult zebrafish spinal cord.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 239 (11), 2962-2979 (2010).</li><li>Goldshmit, Y., Sztal, T. E., Jusuf, P. R., Hall, T. E., Nguyen-Chi, M., Currie, P. 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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wenn zunächst das Erlernen dieser Technik, empfehlen wir versuchen nicht mehr als 50-100 Querschnitten erhalten in einer einzigen Sitzung. Nach Beherrschung dieser Technik sind wir in der Lage, bis 300 Embryonen pro Stunde durchschneiden sich; aber dieses Niveau der Durchsatz erfordert ein paar Monaten der wöchentlichen Praxis. Wir empfehlen auch, gemeinsam mit einem Reporter-Linie und Überprüfung komplette Durchtrennung bis das Auftreten von unvollständiger Durchtrennung des Rückenmarks auf weniger als 1% reduzie...

Schweres Trauma an den menschlichen Rückenmarks oft zu bleibenden Lähmungen und Gefühlsverlust unterhalb der Ebene der Schädigung aufgrund der Unfähigkeit, die Axone wieder wachsen oder reinitiate Genese 1,2. Im Gegensatz zu Säugetieren, aber anamniotes einschließlich Salamander und Zebrafisch (Danio rerio) zeigen kräftige Erholung auch nach der kompletten Rückenmarksdurchtrennung 3,4. Die erwachsenen Zebrafisch ist ein gut etabliertes Modell für die Untersuchung der Wiederherstellungsprozess folgende Verletzungen des Rückenmarks 5-7. Nach der vollständigen Durchtrennung des Rückenmarks, ist Wiederherstellung der sensorischen und Lok-Funktion im erwachsenen Zebrafisch von 6 Wochen nach der Verletzung 8 beobachtet. Um den Regenerationsprozess in vivo zu untersuchen, wandten wir uns an der transparenten Larven Zebrafisch-9. Hier präsentieren wir eine Methode, um das Rückenmark zu durchtrennen eines 5 Tage nach der Befruchtung (DPF) Larvenzebrafisch using eine abgeschrägte Mikroinjektionspipette wie ein Skalpell, von Bhatt geändert, et al. 10. Diese Methode unterstützt hohen Durchsatz, geringe Mortalität und Reproduzierbarkeit. Mit etwas Übung können 300 Larven / h durchtrennt werden, und über 6 Monate von Querschnitten erhalten, darunter mehr als 3.600 Tiere, 98,75% ± 0,72% überlebten bis 7 Tage nach der Verletzung (dpi). Unsere Daten zeigen eine schnelle Wiederherstellung der sensorischen und Fortbewegung als auch: bei 1 dpi, wird jede Bewegung, die der Geschädigte Fisch nur Brustflosse Fortbewegung angetrieben. Allerdings Larven beginnen zu reagieren, um die Nadel zu berühren Schwanztrennung Wolfram von 2 dpi, wiederherzustellen C-Bogen-Bewegung um 3 dpi und zeigen räuberische Schwimm von 5 11 dpi. Mit Antikörperfärbung gegen acetyliertes Tubulin haben wir bestätigt, dass Axone fehlen in der Verletzungsstelle bei 1 dpi, haben aber die Verletzungsstelle um 5 dpi gekreuzt. Wir glauben, dass dieses Protokoll eine wertvolle Technik für die Untersuchung von axonalen Nachwachsen und Neurogenese im Rückenmark nach einer Verletzung bereitzustellen. </p&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:733px;" width="733">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">60mm petri dish</td>
			<td style="width:179px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82050-544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">100mm petri dish</td>
			<td style="width:179px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89038-968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC9644388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">borosilicate capillary tubing: OD 1.00mm ID 0.78mm</td>
			<td style="width:179px;">Warner Instruments Inc.</td>
			<td style="width:119px;">64-0778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">forceps</td>
			<td style="width:179px;">Fine Scientific Tools Inc.</td>
			<td style="width:119px;">11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">disssection microscope</td>
			<td style="width:179px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ6454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">microgrinder</td>
			<td style="width:179px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">EG-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Gentamycin Sulfate</td>
			<td style="width:179px;">Amresco Inc.</td>
			<td style="width:119px;">0304-5G</td>
			<td>dissolve in water 10mg/ml, store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Tricaine</td>
			<td style="width:179px;">Acros Organics</td>
			<td align="right" style="width:119px;">118000100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">cotton tipped applicator, wood, 6-inch</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">1ml syringe</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">309625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">27 ga. needle</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fry food</td>
			<td style="width:179px;">Argent Labs</td>
			<td style="width:119px;">F-ARGE-PTL-CN</td>
			<td>store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">micropipette puller</td>
			<td style="width:179px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:119px;">Model P-97</td>
			<td>Box Filament FB330B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">20x E2 (1L)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">17.5g NaCl</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S671-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">0.75g KCl</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:269px;">2.90g CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td style="width:179px;">Sigma&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;">C7902-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:269px;">4.90g MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">MX0070-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:269px;">0.41g KH2PO4</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:269px;">0.12g Na2HPO4</td>
			<td style="width:179px;">Sigma&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S0876-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:269px;">500x NaCO3 (10ml)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>make fresh, discard extra</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:269px;">0.35g NaCO3</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">1x E2 (1L)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">50ml 20x E2</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:269px;">2ml fresh 500x NaCO3</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spinal cord transection in the larval zebrafish

Säugetiere nicht in sensorischen und motorischen Erholung nach einer Rückenmarksverletzung aufgrund des Fehlens von axonalen Nachwachsen unter dem Niveau von Verletzungen sowie die Unfähigkeit, Rückenneurogenese wieder aufzunehmen. Doch einige anamniotes einschließlich der Zebrafisch Danio rerio Ausstellung auch nach der kompletten Durchtrennung des Rückenmarks sowohl sensorische und funktionelle Wiederherstellung. Die erwachsenen Zebrafisch ist ein Modellorganismus für das Studium Regeneration nach Rückenmarksverletzungen, mit sensorischen und motorischen Erholung von 6 Wochen nach der Verletzung. Um die Vorteile der in vivo Analyse der Regenerationsprozess in der transparenten Larven Zebrafisch als auch genetische Werkzeuge nicht in der Erwachsenen zugänglich zu machen, verwenden wir die Zebrafisch-Larven, um die Regeneration nach Rückenmarksdurchtrennung zu studieren. Hier zeigen wir ein Verfahren zur reproduzierbar und nachweisbar Trennung des Larvenrückenmark. Nach Durchtrennung, zeigt unsere Daten sensorischen Erholung Anfang mit 2 Tagen nach der Verletzung (dpi), Witzh ist der C-Bogen-Bewegung um 3 dpi und die Wiederaufnahme des freien Schwimmen von 5 dpi nachweisbar. So schlagen wir die Zebrafisch-Larven als Begleiter Werkzeug an die erwachsenen Zebrafisch für das Studium der Regeneration nach Rückenmarksverletzungen.

Um die Schwere der Gewebeschädigung die Verletzungsstelle umgebenden reduzieren, ist die richtige Abschrägung der Mikropipette kritisch. 1A zeigt eine korrekt abgeschrägte Spitze. Mit einem Tipp, der zu breit ist (Abbildung 1B) neigt dazu, in höheren Todesopfer führen durch die erhöhte Wahrscheinlichkeit von nicking die dorsale Aorta, während ein Tipp, der zu schmal ist (Abbildung 1C) neigt dazu, Blick von der Haut statt Schneiden von Gewebe. <p class="jove_c...

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Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Nach Durchtrennung des Rücken, erwachsenen Zebrafisch haben die funktionelle Erholung von 6 Wochen nach der Verletzung. Um die Vorteile der Larven Transparenz und schnellere Erholung zu nehmen, stellen wir ein Verfahren zur Durchtrennung des Rückenmarks Larven. Nach Durchtrennung beobachten wir sensorischen Erholung ab 2 Tage nach der Verletzung, und C-Bogen-Bewegung um 3 Tage nach der Verletzung.

Rückenmarksdurchtrennung in der Zebrafisch-Larven

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

spinal-cord-transection-in-the-larval-zebrafish

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.8K Aufrufe.  University of Utah.  Nach Durchtrennung des Rücken, erwachsenen Zebrafisch haben die funktionelle Erholung von 6 Wochen nach der Verletzung. Um die Vorteile der Larven Transparenz und schnellere Erholung zu nehmen, stellen wir ein Verfahren zur Durchtrennung des Rückenmarks Larven. Nach Durchtrennung beobachten wir sensorischen Erholung ab 2 Tage nach der Verletzung, und C-Bogen-Bewegung um 3 Tage nach der Verletzung. 

Serie: Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Forschung

Neurowissenschaften

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

Spinal Cord Elektrophysiologie II: Extrazelluläre Saugelektrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked seizures, epilepsy can be acquired as a result of an insult to the brain or a genetic mutation. Efforts to model seizures in animals have primarily utilized acquired insults (convulsant drugs, stimulation or brain injury) and genetic manipulations (antisense knockdown, homologous recombination or transgenesis) in rodents. Zebrafish are a vertebrate model system1-3 that could provide a valuable alternative to rodent-based epilepsy research. Zebrafish are used extensively in the study of vertebrate genetics or development, exhibit a high degree of genetic similarity to mammals and express homologs for ~85% of known human single-gene epilepsy mutations. Because of their small size (4-6 mm in length), zebrafish larvae can be maintained in fluid volumes as low as 100 &mu;l during early development and arrayed in multi-well plates. Reagents can be added directly to the solution in which embryos develop, simplifying drug administration and enabling rapid in vivo screening of test compounds4. Synthetic oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, zinc finger nuclease and transgenic approaches can be used to rapidly generate gene knockdown or mutation in zebrafish5-7. These properties afford zebrafish studies an unprecedented statistical power analysis advantage over rodents in the study of neurological disorders such as epilepsy. Because the "gold standard" for epilepsy research is to monitor and analyze the abnormal electrical discharges that originate in a central brain structure (i.e., seizures), a method to efficiently record brain activity in larval zebrafish is described here. This method is an adaptation of conventional extracellular recording techniques and allows for stable long-term monitoring of brain activity in intact zebrafish larvae. Sample recordings are shown for acute seizures induced by bath application of convulsant drugs and spontaneous seizures recorded in a genetically modified fish.

A simple method to record extracellular field potentials in the larval zebrafish forebrain is described. The method provides a robust in vivo read-out of seizure-like activity. This technique can be used with genetically modified zebrafish larvae carrying epilepsy-related genes or seizures evoked by administration of convulsant drugs.

Vorderhirn Elektrophysiologische Aufzeichnung im Larven Zebrafisch

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

Dissection und seitlicher Anbau von Zebrafisch-Embryonen: Analyse der Rückenmarksentwicklung

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

Komplette Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protokoll für spätere Wholemount<em&gt; In-situ</em&gt; Hybridisierung in Larven Seeneunauge

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Diffusion Imaging in the Rat Cervical Spinal Cord

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a diagnostic and prognostic tool in cases of disease or injury. Diffusion weighted imaging (DWI), is sensitive to the thermal motion of water molecules and allows for inferences of tissue microstructure. This report describes a protocol to acquire and analyze DWI of the rat cervical spinal cord on a small-bore animal system. It demonstrates an imaging setup for the live anesthetized animal and recommends a DWI acquisition protocol for high-quality imaging, which includes stabilization of the cord and control of respiratory motion. Measurements with diffusion weighting along different directions and magnitudes (b-values) are used. Finally, several mathematical models of the resulting signal are used to derive maps of the diffusion processes within the spinal cord tissue that provide insight into the normal cord and can be used to monitor injury or disease processes noninvasively.

The goal of this protocol is to obtain high-quality diffusion weighted magnetic resonance imaging (DWI) of the rat spinal cord for noninvasive characterization of tissue microstructure. This protocol describes optimizations of the MRI sequence, radiofrequency coil, and analysis methods to enable DWI images free from artifacts.

Diffusionsbildgebung in der Ratte Halsmark

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

Zebrafisch<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Vorbereitung für elektrophysiologische Aufzeichnungen von Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Neuronalen Aktivität im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1Imaging-GCaMP6s transgene Mäuse

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

Laminektomie und Rückenmarksfenster-Implantation in der Maus

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Intra-arterielle Lieferung von neuronalen Stammzellen an das Ratten- und Maushirn: Anwendung auf zerebrale Ischämie

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...