Skidmore Fakultät Entwicklungszuschuss finanziert die Erstellung und Veröffentlichung des Manuskripts.

1. Montage Embryonen (nach Abschluss der gewählte Visualisierungstechnik, wie Immunzytochemie, in situ Hybridisierung, etc.) <ol><li> Platzieren Embryonen in einer 35 mm Petrischale mit Puffer der Wahl (1A) gefüllt. Die Wahl der Puffer in der Kennzeichnung Verfahren. Typischerweise PBS-basierten Puffer sind geeignet. </li><li> Unter einem Binokular und mit einer Pinzette, sichern Sie den Kopf mit einer Zange und ziehen Sie das Eigelb weg mit dem anderen Paar (Abbildung 1B). Alternativ können Sie auch ein Insektenstift in einer Insektenstifthalter vorsichtig wegziehen das Eigelb. </li><li> Mit dem Embryo Poker (Angelschnur (0,41 mm Durchmesser) geklebt, um entweder eine Kapillare oder eine Pasteur-Pipette) bewegen die Embryonen auf einen Teil der Petrischale, die nicht über eine Menge von Schutt Eigelb (1C-D). </li><li> Mit einem Glas Pasteur Pipette absaugen die Embryonen in so wenig Flüssigkeit wie möglich und gständig pipettieren sie auf einen Objektträger (1E). </li><li> Sanft Docht entfernt überschüssige Flüssigkeit mit einem Labortuch. Kontakt mit Embryonen vermeiden. </li><li> Einen Tropfen Eindeckmedium auf Embryonen. Für Fluoreszenzmarkierungen, verwenden Sie ein Antifade Reagenz der Wahl. Für kolorimetrische Signale kann 70% Glycerin als Befestigungsmedium verwendet werden. </li><li> Mit dem Embryo Poker, orientieren die Embryonen auf ihren Seiten in Reihen (1F). </li><li> In einem &quot;dab&quot; Vaseline oder Hochvakuumfett auf jeder Ecke einem Deckglas (1G). Dies verhindert eine Beschädigung des Embryos vor übermäßiger Kompression. </li><li> Deckglas (Vaseline Seite nach unten) auf der Oberseite der Embryonen (1H). </li><li> Klopfen Sie leicht das Deckglas an jeder Ecke, bis die Montage Medien (70% Glycerin oder anti-fade Montage Reagenz) wird das Deckglas (1H) zu berühren. </li><li> Falls erforderlich, mehr Montage Medien durch Pipettieren direkt neben dem coverslip, mit einer Pipette in einem Bereich von 20 bis 200 ml. Es wird unter Docht. </li><li> Mit einem Labortuch, ganz sauber auf der Deckglas. Seien Sie sicher, um Druck auf das Deckglas nicht zu, da diese Embryonen schädigen. Dieser Bereich muss trocken sein und haben keine Vaseline oder Montage Medien auf sie. </li><li> Verwenden Sie Nagellack um den Rand des Deckglases (1I) abzudichten. </li></ol>

<ol>
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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+brain+development+and+organogenesis+in+zebrafish+using+immobilized+embryonic+explants.">Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants.</a> Dev Dyn. 228 (3), 464-474 (2003).</li><li>Deschene, E. R., Barresi, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Targeted+Embryonic+Chimeras:+Zebrafish+Gastrula+Cell+Transplantation.">Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation.</a> J. Vis. Exp. (31), (2009).</li></ol>

Keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen entweder Autor.

Seitlicher Anbau von festen Zebrafischembryonen Hilfen Visualisierung von Rückenmark-Entwicklung. Durch die Entfernung des Dotterkugel, wird der für außergewöhnliche mikroskopische Bildgebung erforderlich Arbeitsabstand reduziert. Unsere repräsentative Ergebnisse wurden mit der 24 hpf Stufe begrenzt, jedoch kann diese Technik schon HPF 18 verwendet werden, obwohl früher Embryonen sind schwieriger aufgrund der Größe des Embryos und der Zerbrechlichkeit des Gewebes zu sezieren. Diese Technik ist auch anwendbar auf Embryonen, die älter als 24 HPF. Durch die optische Klarheit des embryonalen Zebrafisch, der Fähigkeit, zukunfts genetischen Screens durchführen, Reverse Genetik und transgene Ansätze unterstützt, kann mehrere Entwicklungsprozesse untersucht werden. Dies beinhaltet Mitoseindices der neuronalen Vorläuferzellen mit Markierungen wie BrdU-und Anti-Phospho-Histon-März 4-06 und Strukturierung durch Expression von neuronalen und glialen Vorläufer Marker in der pax, nkx, dbx, und olig families 1,4-6. Reagenzien, Gliazellen und neuronale Bestimmung (wie gliafibrilläres-Protein (GFAP) und HuC / D) berichten 1,4,5,10 verwendet werden können. Neuronale Differenzierung Subtyp kann durch Expression von Insel, VSX, engrailed und gata 1,4-6 Gene analysiert werden. Und schließlich ist die Analyse der Axon Führung durch Antikörper, wie anti-acetyliertes Tubulin, 3A10 und ZNP-1 2,11,12 möglich. Obwohl andere Wirbeltiermodellsysteme (Maus und Küken) werden verwendet, um das Rückenmark Entwicklung zu studieren, nur der Zebrafisch erlaubt den gleichzeitigen Empfang von allen Entwicklungs Achsen in der intakten Embryo. Die offensichtliche Einschränkung dieses Ansatzes ist, dass die Embryonen festgelegt sind, die die Live-Darstellung ausschließt. Tatsächlich Entfernen (oder Beschädigung) der Dotter führt zu einem schnellen Tod des Embryos, ist es somit nicht möglich, den Arbeitsabstand in lebenden Embryos unter Verwendung dieser Technik zu reduzieren. Allerdings hoher Vergrößerung Rücken Cord Bildgebung in lebenden Embryonen möglich ist. Um das Eigelb bei Live-Bildgebung zu erhalten, können Embryonen in Depression Dias, die einen größeren Abstand zwischen der Probe und dem Deckglas bieten platziert werden. Alternativ können mehrere 22 mm x 22 mm Deckgläsern auf beiden Schlitten in einer 3 x 1 in Objektträger geklebt werden. Die Deckgläser dienen als &quot;Brücke&quot; für die darüberliegenden Deckglas. Wenn Embryonen sind älter als 18 hpf ist Tricaine verwendet, um Embryonen zu betäuben, um die Bewegung zu verhindern. Während ein Arbeitsabstand von 0,288 mm für deyolked Embryonen bei 24 hpf erforderlich, wenn mit lebenden Embryonen in Agarose eingebettet, mit intakten Eidotter, eine Mikroskoplinse mit einem Arbeitsabstand von 3,3 mm ausreichend. Alternativ kann Explantatkulturen deyolked aus Embryonen gewonnen mittels eines Plasmagerinnsel Immobilisierungstechnik 13 visualisiert werden. Verschiedene Populationen von Zellen durch die Verwendung von genetisch kodierte fluoreszierende Proteine ​​wie GFP, mCherry oder der photo beachtenWandel Kaede Farbstoff (um nur einige zu nennen). Ferner kann fluoreszenzmarkierten Zellen in chimären Embryonen auch mit diesem Ansatz 14 gesehen werden. Eine konsequente Montagetechnik, die für Monate stabil ist, ist ein wichtiges Werkzeug für Zell-und Entwicklungsbiologen. Diese einfache Technik ist reproduzierbar, was eine einfache Vergleich zwischen verschiedenen experimentellen Studien. Ferner wird die Ausrichtung der Embryonen in Reihen leicht ermöglicht Identifizierung spezifischer Embryonen für eine spätere Analyse.

Visualisierung des Rückenmarks im Zebrafisch ist durch eine Anzahl von Faktoren gehemmt. Aufgrund der Dicke der darüberliegenden Somiten und der inneren Lage des Rückenmarks ist eine beträchtlich lange Arbeitsabstand für Hochzellauflösung erforderlich. Der Dotterkugel (die noch während der frühen Stadien der Neurogenese vorhanden ist) erhöht weiter die erforderlichen Arbeitsabstand und ist leicht durch Druck von einem Deckglas beschädigt. Außerdem Trümmer von beschädigten Eigelb verbietet klare Visualisierung von Geweben. Obwohl Querschnitte in den dorso-ventralen (DV) Achse möglich sind, sie nicht leicht eine gleichzeitige Visualisierung in der anterior-posterior (AP) Achse 1. Um diese Hindernisse zu überwinden, werden Embryonen präpariert und auf Objektträger aufgebracht. Dieses Verfahren bietet mehrere Vorteile. Erstens liegen Zebrafischembryonen leicht mit der lateralen Seite nach oben, die AP-Achse Visualisierung erleichtert. Zweitens die Entfernung des Eigelbs ball verringert die erforderlichen Arbeitsabstand und begrenzt Schutt. Drittens erlaubt sowohl für Fluoreszenz-und Hellfeldmikroskopie das Montageverfahren zu. Viertens sind montiert Embryonen Monate stabil bei 4 ° C, wodurch längere Probe Visualisierung. Schließlich, daß vorderen Segmente auftritt Fortschreiten der Entwicklung sind reifer als Zahnbereich. Um sicherzustellen, dass inszeniert abgestimmt Rücken hemisegments zwischen Embryonen verglichen wird, wird überlagert Somitengewebe als Richtlinie. Zum Beispiel liegt über der zehnte hintersten Somiten den zehnten Rücken hemisegment, die entwicklungs Äquivalent in der Stufe abgestimmt Embryonen ist. Dieses Montageverfahren von intakten Embryonen ermöglicht die einfache Identifizierung von Somiten. Wir verwenden Genetik und Gen-Knock-down-Technologien, um die Mechanismen der Axon-Führung in der Entwicklung des Rückenmarks zu studieren. Insbesondere haben wir festgestellt, dass robo2, robo3 und DCC für Commissural Primär Asce erforderlichNding (COPA) Axon-Wegfindung. Mit der hier beschriebenen Montageverfahren, waren wir in der Lage, ventralen Wachstum, Mittellinienüberfahrt, commissure Breite, Rücken-und Vorder Wachstum 2,3 zu untersuchen. Dieses Montageverfahren kann auch auf DV-oder AP-Musterbildung des Rückenmarks eingesetzt werden. Wir haben dieses Verfahren verwendet, um unterschiedlichen Rollen von Wnt nachgeschalteten Effektoren in DV Strukturierung des Rückenmarks zu bestimmen. Mit dieser Montage, waren wir in der Lage, DV-Auflösung von Markern auf Einzelzellebene zu erhalten, und zu bestimmen, Minute Musterverschiebungen als Folge der veränderten Wnt-Signalempfang 4,5. Dieses Montageverfahren ermöglicht auch mitotische Indexberechnung durch anti-phosphohistone 3 oder BrdU-Markierung (Vorläufer Proliferation) 5 Differenzierung.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Petri dishes 35mm X 10mm
			</td>
			<td style="width:115px;">
			VWR
			</td>
			<td style="width:116px;">
			25373-041
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Dumont Forceps #3
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:116px;">
			NC9839169
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Cover glass
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:116px;">
			12-541-B22X22-1.5
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Slides
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:116px;">
			12-550-343
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			SlowFade Gold
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:116px;">
			S36936
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			ProLong Gold
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Life Technologies
			</td>
			<td style="width:116px;">
			P36934
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Petroleum Jelly
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Any grocery store
			</td>
			<td style="width:116px;">
			 
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Loop Holders
			</td>
			<td style="width:115px;">
			VWR
			</td>
			<td style="width:116px;">
			80094-482
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Insect Pins
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fine Science Tools
			</td>
			<td style="width:116px;">
			26002-10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Nickel Plated Pin Holders
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fine Science Tools
			</td>
			<td style="width:116px;">
			26016-12
			 
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
 
 
 
 
 
 
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:118px;">
			Name of Equipment
			</td>
			<td style="width:118px;">
			Company
			</td>
			<td style="width:118px;">
			Catalog number
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:118px;">
			Olympus Stereo microscope
			</td>
			<td style="width:118px;">
			Olympus
			</td>
			<td style="width:118px;">
			SZ61
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and lateral mounting of zebrafish embryos: analysis of spinal cord development

Der Zebrafisch Rückenmark ist eine effektive Untersuchungsmodell für Systemforschung Nerven aus mehreren Gründen. Erstens kann genetische, transgene und Gen-Knockdown Ansätze genutzt werden, um die molekularen Mechanismen, die der Entwicklung des Nervensystems zu untersuchen. Zweitens großen Fängen der entwicklungs synchronisiert Embryonen bieten großen Versuchsprobengrößen. Drittens, die optische Klarheit des Zebrafischembryos erlaubt Forschern Vorläufer, glialen und neuronalen Populationen zu visualisieren. Obwohl Zebrafischembryonen transparent sind, können Probendicke wirksam mikroskopische Visualisierung behindern. Ein Grund dafür ist die Entwicklung von Tandem-Rückenmark und darüberliegenden Gewebe Somiten. Ein weiterer Grund ist die große Dotterkugel, die noch in Zeiten der frühen Neurogenese vorliegt. In diesem Artikel zeigen wir, Mikrodissektion und die Entfernung der Dotter in festen Embryonen, die mikroskopische Visualisierung ermöglicht es, während das umliegende Gewebe Somiten. Wir ALSo zeigen, semipermanente Befestigung von Zebrafischembryonen. Dies ermöglicht eine Beobachtung der Entwicklung des Nervensystems in den dorso-ventralen und anterior-posterioren Achsen, da sie die Dreidimensionalität des Gewebes bewahrt.

Bei der Aufklärung der Mechanismen, die verschiedenen Entwicklungsereignisse wie Zellmusterungs, Differenzierung und Axon Führung unterliegen, ist es wichtig, in der Lage, Zellen, die im Rahmen ihrer Gewebe zu visualisieren. Dorsoventraler Strukturierung Mängel in der Regel als eine ventrale oder dorsale Verschiebung der Expressionsdomäne von Transkriptionsfaktoren in der pax, nkx oder dbx Familien 4 vorhanden. Manchmal können Veränderungen subtil sein, das nur wenige Zelldurchmesser 4. Querschnittsanalyse ermöglicht diese Art der Analyse. Jedoch können Reagenzien mit schwächeren Signalen oder Querschnitte, die nicht senkrecht zu der Achse AP Interpretation beschränken. Ferner Querschnittsanalyse nicht ohne zu berücksichtigen, ob Änderungen bestehen in der AP-Achse, und ist auf die Verfügbarkeit eines Kryostaten. Diese Einschränkung wird durch Seitenansichten des Rückenmarks umgangen. Wie in 2B zu sehen ist, ist nkx6.1 mRNA detwa in der ventralen Hälfte des Rückenmarks bei 24 Stunden nach der Befruchtung (hpf) istributed, in der Vorläuferdomäne. Vorläuferzellen unterscheidbar von Post mitotischen Zellen aufgrund des Vorhandenseins der Bodenplatte, die im medialen Teil des Rückenmarks zu finden ist. Mit DIC Optik angesehen werden einzelne Zellen deutlich unterscheidbar, und eine definierte Grenzfläche zwischen exprimierenden und nicht exprimierenden Zellen, ist offensichtlich. Austrittsvorläuferzellzyklus wird durch Veränderungen in der Genexpression begleitet. Zum Beispiel werden alle post-mitotischen Neuronen auszudrücken HuC / D, die mit Immunzytochemie 1,5 nachweisbar ist. mRNA-Sonden für die Insel, gata und VSX Familien beschriften spezifische post-mitotischen Neuronen konsequente Position und Anzahl in jeder Rückenmark hemisegment 6. Zusätzlich werden Axon Führung Rezeptoren, wie sie in der Robo-Familie in begrenzten Populationen von postmitotischen Neuronen (2C) <sup&gt; 2,7,8. Seitlicher Anbau von Embryonen erlaubt eine genaue Zählungen der post-mitotischen Neuronen. Ebenso können Vorläuferzellen sich zu teilen, die weiterhin mit Anti-Phospho-Histon-3 Immunzytochemie sowie BrdU-Markierung quantifiziert werden. Weiterhin kann Zelltod mit TUNEL Kennzeichnung 4-6 bewertet. Bei 24 hpf können Axone der folgenden postmitotischen Neuronen mit verschiedenen Methoden sichtbar gemacht werden, und unterscheiden sich in der Einzelzellebene: Seitliche Rücken Aufsteigend (Dola), Commissural Primär Aufsteigend (COPA), Commissural Sekundär Aufsteigend (CoSA), ventrale Längs Absteigend (Steppe), Kolmer-Agdur (KA), Commissural gegabelten / Längs (CoB / L), Umlauf Aufsteigend (CiA), Umlauf absteigend (CID) und unipolar Commissural absteigend (UCoD), Rohon-Bart (RB), Motoneuronen ( M) 9. Axone verlaufen von dieser Neuronen im dorsalen, ventralen, vorderen und hinteren Richtungen. Sie Niederlassung, über die Mittellinie, und beenden Sie sowohl die Rückenund ventralen Rückenmark. In Verbindung mit der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie sind diese vielfältigen zellulären Verhaltensweisen deutlich in seitlich angebrachten Embryonen mit Hilfe der Immunzytochemie und genetisch kodierte Fluoreszenzproteine ​​wie GFP 2. In 2D wurde ZNP-1 Immunzytochemie verwendet werden, um die Entwicklung Motoneuronen zu beschriften. Motoneuronen verlassen das Rückenmark ventral um die umliegende Muskulatur innervieren entwickeln. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1.jpg" width="500px" /> Fig. 1 ist. Präparation und Montage seitlich von Zebrafischembryos. (A) Nach der Verarbeitung für Immunfluoreszenz in situ-Hybridisierung, etc., sind Embryonen in einer 35 mm Petrischale mit PBT gefüllten (PBS mit 0,5% Triton X-100) oder PTW (PBS mit platziert 0,1% Tween-20). Das EigelbBall (YB) ist offensichtlich. (B) Das Eigelb wird durch die Sicherung der Kopf des Embryos, gefolgt von sorgfältig seziert und entfernt. (C) Ein Embryo Poker (Angelschnur an einer Pasteur-Pipette aufgeklebt) auf separaten Embryonen und Eigelb Schutt (D) verwendet. Gereinigt Embryonen werden auf einen Mikroskop-Objektträger (E) pipettiert und ausgerichtet (F). (G) Vaselin an den Ecken des Deckglases aufgebracht. (H) Das Deckglas wird sanft auf der Embryonen in Montagemedium platziert. (I) Nagellack verwendet, um die Kanten des Deckglases zu versiegeln. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Figur 2" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2.jpg" width="500px" /> &lt;<html> strong&gt; Abbildung 2. Analyse von Genexpressionsmustern und Axon Pathfinding in seitlich angebrachten Zebrafischembryonen. (A) Zeichnung eines Zebrafischembryos bei 24 hpf. In BD, sind etwa vier hemisegments über dem Dottersack-Erweiterung visualisiert (boxed-Bereich). (B) nkx6.1 wird im ventralen Rückenmark, einschließlich der Bodenplatte (FP) ausgedrückt. (C) robo3 in postmitotischen Neuronen (PMN) ausgedrückt. Die Bodenplatte und Vorläuferzone ist nicht ersichtlich, in diesem mehr seitliche Brennebene. In B, C, das Rückenmark durch eine Klammer auf der linken Seite des Bildes begrenzt. (D) Die konfokale Mikroskopie wurde an Bild ZNP-1-Immunfluoreszenz, der Motor Axone verlassen das Rückenmark ventral-Etiketten eingesetzt. In allen Abbildungen ist anterior der linken und dorsalen liegt. A 40X großen Arbeitsabstand, Eintauchen in Wasser (NA 0,8) Objektiv verwendet wurde (3,3 mm).oad/50703/50703fig2highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

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Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

Entwicklungsprozesse wie Proliferation, Strukturieren, Differenzierung und Axon Führung leicht im Zebrafisch Rückenmark modelliert werden. In diesem Artikel beschreiben wir ein Verfahren zur Montage Zebrafisch-Embryonen, die Visualisierung dieser Ereignisse optimiert.

Dissection und seitlicher Anbau von Zebrafisch-Embryonen: Analyse der Rückenmarksentwicklung

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

dissection-lateral-mounting-zebrafish-embryos-analysis-spinal-cord

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K Aufrufe.  Skidmore College.  Entwicklungsprozesse wie Proliferation, Strukturieren, Differenzierung und Axon Führung leicht im Zebrafisch Rückenmark modelliert werden. In diesem Artikel beschreiben wir ein Verfahren zur Montage Zebrafisch-Embryonen, die Visualisierung dieser Ereignisse optimiert. 

Serie: Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Forschung

Neurowissenschaften

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and mortality. Based on the nature of primary injury following TBI, complex and heterogeneous secondary consequences result, which are followed by regenerative processes 1,2. Primary injury can be induced by a direct contusion to the brain from skull fracture or from shearing and stretching of tissue causing displacement of brain due to movement 3,4. The resulting hematomas and lacerations cause a vascular response 3,5, and the morphological and functional damage of the white matter leads to diffuse axonal injury 6-8. Additional secondary changes commonly seen in the brain are edema and increased intracranial pressure 9. Following TBI there are microscopic alterations in biochemical and physiological pathways involving the release of excitotoxic neurotransmitters, immune mediators and oxygen radicals 10-12, which ultimately result in long-term neurological disabilities 13,14. Thus choosing appropriate animal models of TBI that present similar cellular and molecular events in human and rodent TBI is critical for studying the mechanisms underlying injury and repair.
Various experimental models of TBI have been developed to reproduce aspects of TBI observed in humans, among them three specific models are widely adapted for rodents: fluid percussion, cortical impact and weight drop/impact acceleration 1. The fluid percussion device produces an injury through a craniectomy by applying a brief fluid pressure pulse on to the intact dura. The pulse is created by a pendulum striking the piston of a reservoir of fluid. The percussion produces brief displacement and deformation of neural tissue 1,15. Conversely, cortical impact injury delivers mechanical energy to the intact dura via a rigid impactor under pneumatic pressure 16,17. The weight drop/impact model is characterized by the fall of a rod with a specific mass on the closed skull 18. Among the TBI models, LFP is the most established and commonly used model to evaluate mixed focal and diffuse brain injury 19. It is reproducible and is standardized to allow for the manipulation of injury parameters. LFP recapitulates injuries observed in humans, thus rendering it clinically relevant, and allows for exploration of novel therapeutics for clinical translation 20.
We describe the detailed protocol to perform LFP procedure in mice. The injury inflicted is mild to moderate, with brain regions such as cortex, hippocampus and corpus callosum being most vulnerable. Hippocampal and motor learning tasks are explored following LFP.

Lateral fluid percussion (LFP), an established model of traumatic brain injury in mice, is demonstrated. LFP fulfills three major criteria for animal models: validity, reliability and clinical relevance. The procedure, consisting of surgical craniotomy, fixation of hub followed by induction of injury, resulting in focal and diffuse injuries, is described.

Lateral Fluid-Percussion: Modell Schädel-Hirn-Verletzungen in Mäuse

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation depends on a combination of axon guidance cues1 and survival factors2 located along the trajectory of growing axons and/or within their sensory organ targets. For example, functional interference with a classic axon guidance signaling pathway, semaphorin-neuropilin, generated misrouting of otic axons3. Also, several growth factors expressed in the sensory targets of the inner ear, including Neurotrophin-3 (NT-3) and Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), have been manipulated in transgenic animals, again leading to misrouting of SAG axons4. These same molecules promote both survival and neurite outgrowth of chick SAG neurons in vitro5,6.
Here, we describe and demonstrate the in vitro method we are currently using to test the responsiveness of chick SAG neurites to soluble proteins, including known morphogens such as the Wnts, as well as growth factors that are important for promoting SAG neurite outgrowth and neuron survival. Using this model system, we hope to draw conclusions about the effects that secreted ligands can exert on SAG neuron survival and neurite outgrowth. 
SAG explants are dissected on embryonic day 4 (E4) and cultured in three-dimensional collagen gels under serum-free conditions for 24 hours. First, neurite responsiveness is tested by culturing explants with protein-supplemented medium. Then, to ask whether point sources of secreted ligands can have directional effects on neurite outgrowth, explants are co-cultured with protein-coated beads and assayed for the ability of the bead to locally promote or inhibit outgrowth. We also include a demonstration of the dissection (modified protocol7) and culture of E6 spinal cord explants. We routinely use spinal cord explants to confirm bioactivity of the proteins and protein-soaked beads, and to verify species cross-reactivity with chick tissue, under the same culture conditions as SAG explants. These in vitro assays are convenient for quickly screening for molecules that exert trophic (survival) or tropic (directional) effects on SAG neurons, especially before performing studies in vivo. Moreover, this method permits the testing of individual molecules under serum-free conditions, with high neuron survival8.

We demonstrate how to dissect and culture chick E4 statoacoustic ganglion and E6 spinal cord explants. Explants are cultured under serum-free conditions in 3D collagen gels for 24 hours. Neurite responsiveness is tested with growth factor-supplemented medium and with protein-coated beads.

Dissection und Kultur von Chick Statoacoustic Ganglion und Rückenmark Explantate in Kollagengelen für Neuritenwachstum Assays

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Rückenmarksdurchtrennung in der Zebrafisch-Larven

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

Komplette Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protokoll für spätere Wholemount<em&gt; In-situ</em&gt; Hybridisierung in Larven Seeneunauge

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

RNA-Seq Analyse der differentiellen Genexpression in elektroporiertem Küken Embryonale Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

Zebrafisch<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Vorbereitung für elektrophysiologische Aufzeichnungen von Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Neuronalen Aktivität im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1Imaging-GCaMP6s transgene Mäuse

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

Isolierung von Erwachsenen Rückenmark Kerne für massiv parallele Single-Kern-RNA-Sequenzierung

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory stimuli that mechanically deflect apical protrusions called hair bundles. Deflection opens mechanotransduction (MET) channels in hair bundles, leading to an influx of cations, including calcium. This cation influx depolarizes the cell and opens voltage-gated calcium channels located basally at the hair-cell presynapse. In mammals, hair cells are encased in bone, and it is challenging to functionally assess these activities in vivo. In contrast, larval zebrafish are transparent and possess an externally located lateral-line organ that contains hair cells. These hair cells are functionally and structurally similar to mammalian hair cells and can be functionally assessed in vivo. This article outlines a technique that utilizes a genetically encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6s, to measure stimulus-evoked calcium signals in zebrafish lateral-line hair cells. GCaMP6s can be used, along with confocal imaging, to measure in vivo calcium signals at the apex and base of lateral-line hair cells. These signals provide a real-time, quantifiable readout of both mechanosensation- and presynapse-dependent calcium activities within these hair cells. These calcium signals also provide important functional information regarding how hair cells detect and transmit sensory stimuli. Overall, this technique generates useful data about relative changes in calcium activity in vivo. It is less well-suited for quantification of the absolute magnitude of calcium changes. This in vivo technique is sensitive to motion artifacts. A reasonable amount of practice and skill are required for proper positioning, immobilization, and stimulation of larvae. Ultimately, when properly executed, the protocol outlined in this article provides a powerful way to collect valuable information about the activity of hair-cells in their natural, fully integrated states within a live animal.

The zebrafish is a model system that has many valuable features including optical clarity, rapid external development, and, of particular importance to the field of hearing and balance, externally located sensory hair cells. This article outlines how transgenic zebrafish can be used to assay both hair-cell mechanosensation and presynaptic function in toto.

In Vivo Calcium Imaging der Seitenlinie Haarzellen im Larvenstadium Zebrafisch

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...