Wir danken Dr. Martin Rosenberg, Dr. Gary Tarpley, und Dr. Keith Wood für die Unterstützung dieser Arbeit und Dr. James Cali für das kritische Lesen des Manuskripts. DLD, JM, HB, NM, AN, JC, und MU sind Mitarbeiter von Promega Corporation. MF, RJ, RA, und DA sind Mitarbeiter von MS Bioworks, LLC.

Hinweis: Das folgende Protokoll kann mit jedem HaloTag Fusion und in jeder Zelllinie der Wahl stabil oder transient transfizierten verwendet werden. Für diese Beispiele, geben wir Protokolle für die transiente Transfektion von HaloTag Fusionen in HEK293T-oder HeLa-Zellen. Für alle Versuche, empfehlen wir die Verwendung des Proteins nur Kontrolle. 1. Fusion Protein Expression-Test <ol><li> Erhalten Fusionsprotein-Konstrukt: <ol><li> Erhalten vorgefertigten HaloTag Fusionsvektor oder den Bau der vorhandenen Vektoren. Für weitere Informationen über die verfügbaren Konstrukte finden Sie Tabelle der spezifischen Reagenzien. </li><li> Wenn sie eine Klon, ist es empfehlenswert, die DNA-Sequenz zu überprüfen. </li></ol></li><li> Testen Expression von Fusionsprotein und Kontrolle: <ol><li> Für jede Probe vorbereiten 250 ul 1X SDS Loading Dye-Puffer (60 mM Tris-HCL pH 6,8, 0,75 mM Bromphenol blau, 12,5% Glycerin, 100 mM Dithiothreitol, 0,5% SDS). </li><li> Für jedes Fusionsproteinund Steuerung der Platte 0,5 ml HEK293T oder HeLa-Zellen in den entsprechenden Medien in einer Dichte von 2-4 x 10 5 Zellen / ml in einem Standard-24-Well-Platte. </li><li> Inkubation für 18-24 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2, dann zu transfizieren, wie empfohlen. </li><li> 24 Stunden nach der Transfektion mit 0,5 ul 5 mM Tetramethyl Rhodamin (TMR)-Liganden an die Medien aller Vertiefungen und vorsichtig mischen Platte. </li><li> Inkubieren transfizierte Zellen enthaltenden Liganden für 15 Minuten bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Absaugen Medien haltigen Liganden und waschen Sie jedes Well der Zellen vorsichtig mit 1 ml PBS RT. </li><li> Absaugen PBS und führen Sie einen zweiten Waschen mit 1 ml PBS RT. </li><li> PBS entfernen und mit 200 ul 1X SDS-Ladepuffer Farbstoff direkt zu den Zellen. </li><li> Pipette Lysat aus Platte in 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Sieden Lysat 5 min bei 95 ° C. </li><li> Entfernen von 5-10 ul der Reaktion und Last auf SDS-PAGE-Gel. </li><li> Verwenden Sie ein Fluoreszenzdetektion Scanner(TMR Anregung: 555 nm, Emission: 585 nm), um Bands zu erkennen. Verwenden fluoreszierenden Protein-Marker als Standards. </li><li> Wenn ein Fluoreszenzdetektions Scanner verfügbar ist, führen Western-Blots mit Antikörpern gegen entweder den Köder-Protein-oder Protein-Tag-Fusion, um die Expression des Fusionsproteins. </li></ol></li></ol> 2. Protein Pulldowns <ol><li> Vorbereitung von transient transfizierten Zellen: <ol><li> Für jede Fusion oder Steuer bereiten ein 15-cm-Schale mit 30 ml Zellen bei 3-4 x 10 5 Zellen / ml oder 1 bis 1,2 x 10 7 Zellen pro Gesamtkonstrukt. </li><li> Inkubation für 18-24 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2, dann transfizieren konstruieren, wie empfohlen. </li><li> Nach 24 bis 48 Stunden nach der Transfektion, entfernen Sie die Medien und vorsichtig waschen die Zellschicht mit 20-25 ml eiskaltem PBS. </li><li> PBS-Wasch entfernen, dann fügen Sie 25-30 ml 4 ° C gekühlt und vorsichtig abkratzen PBS-Zellen von der Platte. </li><li> Sammeln Sie Zellen in konische Röhrchen und ZentrifugenFuge für 5-10 min bei 2.000 × g und 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen und legen Zellpellet bei -80 ° C für mindestens 30 Minuten oder bis zu 6 Monate. </li></ol></li><li> Gleichgewichtseinstellung des Halolink Harz: <ol><li> Für jede Fusion oder Kontrollprobe, bereiten 12 ml Harz Equilibration / Wash-Puffer (100 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl und 0,005% IGEPAL CA-630). Hinweis: Es ist sehr wichtig, und verwenden Sie den Harz Äquilibrationspuffer innerhalb von 12 Stunden als verdünnt IGEPAL CA-630 nicht stabil ist oder wirksam über diesen Zeitrahmen. </li><li> Schütteln oder mischen Harz, um eine gleichmäßige Suspension zu erhalten. </li><li> Für jeden Pull-down-Experiment verzichten 200 ul Harz in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifugieren für 1 min bei 800 xg (z. B. 3000 Upm in einer Mikrozentrifuge), dann sorgfältig entfernen und den Überstand verwerfen (Ethanol) ohne Harz am Boden der Röhre zu stören. </li><li> In 800 ul von Harz Equilibration / Wash-Puffer und gründlich mischen durch Umdrehen des Röhrchens mehrmals. </li><li> Zentrifugieren für 2 min bei 800 g, dann vorsichtig entfernen und den Überstand verwerfen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.2.5 und 2.2.6 zwei weitere Male für insgesamt 3 Waschungen. </li><li> Den letzten Waschen oder Überstand, bis Sie sie unten beschrieben Zelllysaten (Schritt 2.3.8) hinzuzufügen, um das Harz vor dem Austrocknen nicht entfernen. </li></ol></li><li> Binding und Waschen der Fusionskomplexe: <ol><li> Für jede Probe vorzubereiten 500 ul Mammalian Lysepuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% Na-Desoxycholat) und 1 ml 1X TBS-Puffer (100 mM Tris-HCl pH 7,5 und 150 mM NaCl). </li><li> Tauen die Zellpellets und resuspendieren in 300 ul Säugetier Lysepuffer durch Auf-und Abpipettieren oder kurz vortexen. </li><li> In 6 ul 50X Protease Inhibitor Cocktail (800 ug / ml Benzamidin HCl, 500 ug / ml Phenanthrolin, 500 ug / ml Aprotinin, 500 ug / ml Leupeptin, 500 &amp; #. 181, g / ml Pepstatin A, 50 mM PMSF) Hinweis: Protease-Cocktails, die AEBSF umfassen kann nicht verwendet werden, da diese stören Protein-Fusion-Tag verbindlich. </li><li> In 3 ul RQ1 DNase und Invertzucker für 10 min bei RT. </li><li> DOUNCE mit Glas-Homogenisator 2,0 ml Größe; . 25-30 Schläge auf Eis, oder übergeben Zellen durch eine 25 oder 27 G-Nadel 5-10 mal, um die Lyse zu vervollständigen Hinweis: Die Ultraschallbehandlung wird nicht als Komplexe zerfallen und Überhitzung kann die Protein-Fusion-Tag-Aktivität beeinflussen empfohlen. </li><li> Zentrifuge bei 14.000 × g für 5 min bei 4 ° C, um das Lysat zu löschen. </li><li> Übertragen klare Lysat, ca. 300 ul Gesamtvolumen, neue Röhre und auf Eis. </li><li> In den Klarlysat zusätzliche 700 ul 1X TBS-Puffer und gut mischen durch Pipettieren von oben und unten. </li><li> Nehmen äquilibriertem Harzrohre in Schritt 2.2.8 hergestellt und entfernen letzten Wasch / Stand aus Harz ohne Harz am Boden der Röhre zu stören. </li><li> In den einzelnen tusein von Harz, die 1 ml verdünntem Lysat. </li><li> Inkubiere unter Mischen auf einem Schwenker (oder sanft Mischer) für 15 min bei 22 º C Anmerkung: Das Absetzen des Harzes während dieser Zeit reduziert Bindungseffizienz. Wenn Bindung bei 4 º C gewünscht ist, dies zu tun, indem man 1 Stunde lang. </li><li> Centrifuge Harzrohre für 2 min bei 800 xg und Überstand verwerfen. </li><li> 1 ml Resin Equilibration / Wash-Puffer bei Schritt 2.2.1 gemacht und mischen durch Invertieren des Harzschlauch von Hand mehrmals. </li><li> Centrifuge Harzrohre für 2 min bei 800 x g und entsorgen Sie die Wäsche. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte, gefolgt von 2.3.12 2.3.14 drei weitere Male. </li><li> 1 ml Harz Äquilibrierung / Waschpuffer und Inkubation bei 22 ° C für 5 min mit konstanter Drehzahl. </li><li> Centrifuge Harzrohre für 2 min bei 800 x g und entsorgen Sie die Wäsche. </li><li> Je nach Anwendungszweck (siehe Einleitung für weitere Erläuterungen), um entweder Abschnitt 2.4 oder 2.5 gehen. </li></ol></li><li> SDS Elution zur Denaturierung Gelen, Western Blots, oder Massenspektrometrie: <ol><li> Resuspendieren des Harzes aus jeder Probe in 50 ul SDS-Elutionspuffer (1% SDS und 50 mM Tris-HCl pH 7,5) </li><li> Schütteln Röhrchen bei RT für 30 min. </li><li> Zentrifuge für 2 min bei 800 xg und Transfer Eluate in frische Röhrchen für die Analyse. </li><li> Für Western-Blot-oder Silberfärbung Gel, Last 5-10 ul auf einem SDS Denaturierungsgel. </li><li> Für Massenspektrometrie, sparen Sie 40 ul jeder Probe bei -20 ° C </li></ol></li><li> TEV-Protease Elution für funktionelle Assays, Western Blots, oder Massenspektrometrie: <ol><li> Nach dem Entfernen der letzten Waschung Resuspendieren des Harzes in 50 ul ProTEV Spaltpuffer und 30 Einheiten Enzym TEV. </li><li> Inkubieren bei 25 ° C unter Schütteln für 1 Stunde. </li><li> Zentrifuge für 2 Minuten bei 800 x g. </li><li> Übertragen Eluat in frische Röhrchen. </li><li> Bewahren Sie die Probe bei 4 ° C für den sofortigen Einsatz in funktionellen Tests. </li></ol></li></ol> 3.Cellular Imaging von fluoreszenz markierter Fusionsproteine ​​Mit einem zytoplasmatische und nukleäre Permeable Ligand <ol><li> Transfektion, Bezeichnung und Bildzellen: <ol><li> In einem 8-Well-Kammerdeckgläser für jedes Fusionsprotein oder Steuerung, Platte 400 ul von HeLa-Zellen in den entsprechenden Medien in jede Vertiefung in einer Dichte von 1-2 x 10 5 Zellen / ml. </li><li> Inkubation für 18-24 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2, dann zu transfizieren, wie empfohlen. </li><li> 18-24 Stunden nach der Transfektion, verdünnte TMR Ligand 1:200 in geeigneten Zell Medien, dann werden 100 ul dieser Lösung in jede Vertiefung und vorsichtig mischen. </li><li> Inkubieren transfizierte Zellen enthaltenden Liganden für 15 Minuten bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Absaugen Medien-Liganden und ersetzen mit 500 ul geeigneten Medien fehlt Protein-Fusion-Tag-Liganden, die seit bis 37 ° C erwärmt worden enthält </li><li> Wiederholen zweimal für insgesamt drei Waschungen. </li><li> Setzen Zellen zurück in Inkubator (376, C und 5% CO 2) für 30 min. </li><li> Absaugen Medien und ersetzen mit 500 ul geeigneten Medien, das wurde auf 37 ° C erwärmt worden </li><li> Bild auf einem Mikroskop mit geeigneten Aufnahmeparameter (TMR Anregung: 555 nm, Emission: 585 nm). </li></ol></li></ol>

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Veröffentlichung Kosten für diesen Artikel werden von Promega Corporation gesponsert. Danette L. Daniels, Jacqui Méndez, Hélène Benink, Andrew Niles, Nancy Murphy und Marjeta Urh sind Mitarbeiter von Promega Corporation, Handels Inhaber durch Abtretung von Patenten des HaloTag Technologie und ihrer Anwendungen. Michael Ford, Richard Jones, Ravi Amunugama und David Allen sind Mitarbeiter von MSBioworks, die Masse in diesem Manuskript beschrieben Spektrometrie Dienstleistungen bietet.

Präsentiert werden hier zwei Fusionsproteine, Halo-Halo-BRD4 und HDAC1, in eukaryotischen Säugetierzellen für die Expression gekennzeichnet, Protein-Komplex Isolation und Aktivität und zelluläre Lokalisation. In Arbeits durch diese verschiedenen Protokolle gibt es mehrere wichtige Schritte für den Erfolg eines jeden Versuchs. Wie es der Fall bei jedem Fusionsprotein, Expressionsniveau und die Platzierung der Markierung selbst kann für die Aufrechterhaltung Physiologie. Daher ist es wichtig zu berücksichtigen, dass N-und / oder C-terminale Fusionen müssen entwickelt werden, wenn Vorkenntnisse oder arbeiten mit einem anderen Tag wurde nicht für das jeweilige Protein der Wahl gezeigt. In Bezug auf Ausdruck, wenn der Pegel zu hoch ist, Verdünnung der DNA während der Transfektion oder Verwendung von Vektoren mit schwächeren Promotoren durchgeführt werden, werden möglich, die Höhe, die angemessen ist zu erreichen. Frühere Arbeiten durchgeführt worden ist, die effiziente Isolierung von makromolekularen Komplexen bei endogenen levels Ausdrucks 8, wodurch Arbeit bei sehr niedrigen Expressionsniveaus. Wenn möglich, würde zelluläre Lokalisation Studien auch in der Lage, Einblick in die optimale Platzierung Tag-Position als auch relative Expressionsniveau für die richtige Physiologie benötigt bereitzustellen. Sobald die Fusionsproteine ​​sind bereit für Pulldown-Experimente, um den maximalen Erfolg mit dem Protokoll ist es sehr wichtig, die empfohlenen Zeitrahmen bei der Lyse folgen, Bindung und Wasch Abschnitte zu erhalten, als einer der größten Vorteile ist die Geschwindigkeit des Komplexes Isolation Prozess. Wenn einer dieser Schritte werden in der Zeit verlängert wird, wie für einen Antikörper-basierten Erfassungsverfahren erforderlich ist, besteht die Gefahr von komplexen Dissoziation oder erhöhte nicht-spezifische Bindung 8. Ebenso, wenn die Zeiten während der zellulären Lyse oder verbindlich sind verkürzt, können die Zellen nicht vollständig lysiert werden oder effizient bzw. gefangen genommen. Wenn die Anzahl der Waschungen ist decrerleichtert bzw. gute Durchmischung des Harzes nicht in der Bindung oder Wasch auftreten, dann Hintergrundwerte von nicht-spezifischen Proteinen erhöht. Außerdem ist das Mittel der Lyse sehr wichtig, da im Zusammenhang mit der Bindungsaffinität zu dem Harz. Versuche, um die Proben zu beschallen, entfernen Sie das empfohlene Reinigungsmittel, fügen SDS oder andere starke Reinigungsmittel und / oder die den Protease-Inhibitor AEBSF wird reduziert oder Verlust der Bindung von Fusionsproteinen und deren Komplexen zu dem Harz führen. Bestehende Verfahren für komplexe Isolierung aus Säugerzellen und humane Proteom-Analyse Kampf mit der Herausforderung der Reduzierung von Hintergrund in der Analyse durch Massenspektrometrie 16. Dies wurde so bedeutend, dass ein Repository von verunreinigenden Proteinen wurde von zahlreichen Gruppen-Massenspektrometrie 16 erstellt worden war. Hintergrund in der Massenspektrometrie Pulldown-Proben können als etwas, die die Identifizierung der verhindert, dass definiert werdenwahre Interaktoren der Köder-Protein. Als solches kann Hintergrund kontaminieren unspezifische Proteine ​​oder auch hohe Konzentrationen von Köderprotein oder Antikörper verwendet werden, um Proteine ​​auszufällen Köder entstehen. Bedeutende Arbeit wurde bei der Optimierung sowohl die Pulldown-Protokoll hier vorgestellten sowie das Harz, um das Niveau der nicht-spezifischen verunreinigende Proteine ​​im Pulldown-Verfahren minimieren getan. Dies ist in der Silberfärbung Gele und Massenspektrometrie-Analyse der Kontrolle (Fig. 2) deutlich. Um das hohe Niveau der Köderprotein oder Antikörper, die ebenso schaden wie Verunreinigungen und mit welchen anderen Methoden kämpfen kann anzugehen, wird das Pulldown-Elution mit SDS empfohlen (Protokoll Abschnitt 2.4). Aufgrund der kovalenten Bindung an das Harz wird dieser Prozess die Mehrheit der Ausgangsfusionsprotein kovalent an das Harz gebunden verlassen. Ein kleiner Prozentsatz der Köder in der Massenspektrometrie-Analyse, von der angenommen wird beobachtetdurch Hydrolyse auftreten, aber es ist kein Problem für den Nachweis von anderen schwächer oder transiente Interaktionen 8 vorhanden. Wie in der Einleitung erwähnt, wurden bedeutende Fortschritte in der Proteomik durch wesentliche Fortschritte in der Massenspektrometrie 1,7 aktiviert. Daher ist es wichtig, wichtige Parameter der Wahl der Massenspektrometrieanalyse zu markieren, um die Mischung von Proteinen in den pulldowns erhalten Dekonvolution. Instrumentierung muss robust und in der Lage regelmäßig und effizient Analyse von Proben, die eine kleine Menge an Protein, die oft weniger als &lt;1 ug. Nanoscale-Chromatographie mit 50-75 um Innendurchmesser HPLC-Säulen mit Durchflussraten in der 100-300 nl / min Bereich ist in der Regel für die Kompatibilität mit der kleinen Stichprobengrößen beschäftigt und um die Empfindlichkeit des Massenspektrometers zu maximieren. Um die in einer einzigen Analyse Zustand o gewonnenen Informationen zu maximierenf die Kunst Massenspektrometer zur Akquisition hochauflösende Massenspektren auf einer Zeitskala mit oben genannten nanoskaligen Trennungen kompatibel, ≥ 10 Hz, werden typischerweise verwendet. Diese Instrumente haben attomolaren Empfindlichkeitsstufen und kann routinemäßig Daten mit Sub-ppm-Vorläufer und Produkt-Ionen-Massen-Fehlertoleranzen zu erwerben. Diese Leistungseigenschaften dienen, um die Ausbeute von der Anzahl der identifizierten Proteine ​​und das Vertrauen mit diesen verbundenen Identifikationen zu erhöhen. Mit diesen Daten belegen wir physiologische zelluläre Lokalisation, richtige Protein-Protein-Wechselwirkungen mit Potenzial für die Entdeckung von neuen Interaktionen und Isolierung von aktiven Komplexen alle mit einem einzigen Konstrukt. Tatsächlich alternative Technologien für jede dieser verschiedenen Aspekte verwendet werden, aber wahrscheinlich nicht für alle 23,24. Mit der HaloTag Technologie kann eine multifunktionale Ansatz verwendet werden, die Förderung ProteomICs Studien und Erhalten eines besseren Verständnis der Funktion von Proteinen in Säugerzellen.

Verständnis der zellulären Funktion, die Reaktion auf Reize, und Veränderungen in der Entwicklung und / oder Krankheitszustände ist eng gebunden an de-Faltung des Proteoms in diesen unterschiedlichen dynamischen Zustände 1,2. Es wurde schon viel getan, um das Proteom von niederen Organismen zu verstehen, aber angesichts der Anzahl von Proteinen und alle möglichen Wechselwirkungen hat sich diese sehr herausfordernd bei der Bewältigung der menschlichen Proteoms 1,3-7. Fortschritte in der Massenspektrometrie wurden stark aktiviert die Möglichkeit, diese Untersuchungen durchzuführen, und hier präsentieren wir eine zusätzliche und bedeutende Fortschritte bei der Entwicklung von HaloTag Technologie sowohl für effiziente Erfassung von Proteinkomplexen und funktionelle Charakterisierung von humanen Proteinen aus Säugerzellen 8-10. Diese Technologie wurde kürzlich in mehreren Studien gezeigt worden, daß ein kritischer Faktor für die Entdeckung der wichtigen Wechselwirkungen, so dass für einen Einblick in neue Proteinfunktion und understanding der Erkrankung 11-13. Die HaloTag Protein-Fusion wurde zunächst auf mehrere Herausforderungen der traditionellen Affinität Tags und Antikörper als im Zusammenhang mit Protein-Capture, Reinigung und Kennzeichnung 10.8 Adresse entwickelt. In nahezu allen Verfahren zur Abtrennung und Reinigung Protein gibt es eine nicht-kovalente Wechselwirkung, die Schritt für die Anreicherung eines bestimmten Proteins 14 verwendet wird. Während dieses Schrittes kann das Protein und / oder komplexe infolge Diffusion trennen, insbesondere wenn das Verfahren erfordert Stunden anstelle von Minuten. Um dieses Problem anzugehen, wurde das Fusionsprotein speziell entwickelt, um schnell und irreversibel die Interaktion mit seinen Liganden, die entweder Teilchen, Flächen oder Fluorophore 9 sein kann. Daher, sobald es an seinen Liganden gebunden bleibt gebunden, was eine der Differenzierungsfaktor im Vergleich zu anderen Affinitätstags ist. Auch hier gezeigt, ist die Fähigkeit,zu unterschiedlichen biologischen Fragen mit einem einzigen Konstrukt, das durch abwechselnde Liganden 9 (Fig. 1) möglich ist, zu adressieren. Zum Beispiel, um Protein-Wechselwirkungen oder Funktion zu befragen, Oberflächenliganden für die Erfassung von Protein oder Komplexe (Fig. 1) verwendet. In einem separaten Experiment, kann das gleiche Fusionsprotein fluoreszenzmarkierten zelluläre Lokalisation, handeln, oder Protein-Turnover (Figur 1) zu untersuchen. Es ist jedoch wichtig zu erinnern, dass, wenn ein Ligand gebunden ist, ob es eine Oberfläche oder ein Fluorophor ist, irreversibel ist und daher andere Liganden kann dann anschließend im gleichen Experiment gebunden. Analyse bestehender Technologien zur Protein-Interaktionen Karte zeigen die Schwierigkeit, spezifische Wechselwirkungen, einschließlich derjenigen, die mehr transiente oder sind in Hülle und Fülle unteren 1,6,7,14,15 effizient isolieren. Auch neuere Arbeiten von zahlreichen Gruppens zeigt die Sorge, dass innerhalb der traditionellen Isolationsverfahren, insbesondere im Bereich der Menschen Proteomik, gibt es eine beträchtliche Anzahl von Proteinverunreinigungen, die Signale von wahren Interaktoren in der Massenspektrometrie-Analyse 16 maskieren kann. Die für die HaloTag Protein und seine Co-Harz entwickelt Adresse auch diese Bedenken Eigenschaften entwickelt. In 15 Minuten kann das Protokoll für komplexe pulldowns (Abbildung 1), die Bindung von Komplexen erreicht werden, sowohl die Förderung der komplexen Erfassung und Verringerung der Zahl von nicht-spezifischen Bindung 8. Zusätzlich irreversibel bindenden ermöglicht eine effiziente Erfassung von Proteinen mit geringer Häufigkeit und ermöglicht die Verwendung von viel weniger Zellen wieder reduziert Hintergrund 8. Nach Erfassung der Komplexe hergestellt ist, das Protokoll enthält milde Waschbedingungen zu komplexen Integrität zu erhalten. Elution der aufgenommenen Komplexe können durch zwei Verfahren, und die Entscheidung, welche Methode wird durch das Ziel des stromabwärtigen anal diktiert geführt werdenlyse. Wenn der Wunsch zu analysieren oder zu entdecken interagierenden Proteinen durch Western-Blot oder Massenspektrometrie, dann empfiehlt es sich, Komplexe mit Denaturierungsmitteln wie Harnstoff oder SDS (Fig. 1) eluiert. Dies ist für die Massenspektrometrie besonders vorteilhaft, da das Protein ursprünglich HaloTag fusioniert, bezeichnet das Köderprotein, hinter an das Harz gebunden bleiben und daher nicht die Population von Peptiden, die in der Massenspektrometrie nachgewiesen dominieren. Das bedeutet aber auch, dass der Köder-Protein wahrscheinlich nicht sichtbar in der Analyse durch Western-Blot, ein signifikanter Unterschied im Vergleich zu anderen nicht-kovalente Affinitätsreinigungen oder Co-Immunpräzipitationen sein. Wenn das Ziel ist, einen Komplex zu reinigen intakt für Funktionsstudien verwendet werden, können die Elution unter Verwendung von TEV (Tobacco Etch Virus)-Protease, die ihre zugehörigen Spaltsequenz zwischen dem Fusionsprotein und dem Köder-Protein (Fig. 1) codiert werden, erkennt. Tiese Proben könnten auch durch Massenspektrometrie analysiert werden, aber, wie später gezeigt wird, werden sie eine erhebliche Menge an Köderprotein, das den Nachweis von unteren Hülle und Fülle, spezifische Interaktoren verhindern kann, enthalten. Hier präsentieren wir Pulldown-und Imaging-Protokolle, um zwei wichtige therapeutische Proteine, die Protein Bromodomäne BRD4 und Histon-Deacetylase, HDAC1 17 angelegt. Wir haben mit diesen Beispielen, die Interaktion mit Partnern wie erwartet durch Massenspektrometrie, enzymatische Aktivität nach komplexen Isolation für HDAC1 und korrekte zelluläre Lokalisation für beide bestimmt gezeigt. Zusammen zeigen diese Ergebnisse die multifunktionale Art und Stärke der Technik zur Charakterisierung von eukaryontischen Protein-Wechselwirkungen und Funktion.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="924">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">HeLa Cells</td>
			<td style="width:204px;">ATCC</td>
			<td style="width:103px;">CCL-2</td>
			<td style="width:280px;">Adherent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEK293T Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td style="width:280px;">Adherent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cellular growth media</td>
			<td>Invitrogen/Gibco</td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS - tissue culture certified</td>
			<td>Invitrogen/Gibco</td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FuGENE HD Transfection Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag Control Vector</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6591</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag-BRD4</td>
			<td>Kazusa DNA Research Institute</td>
			<td>FHC11882</td>
			<td style="width:280px;">N-terminal HaloTag fusion</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag-HDAC1</td>
			<td>Kazusa DNA Research Institute</td>
			<td>FHC02563</td>
			<td style="width:280px;">N-terminal HaloTag fusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HaloTag Clones containing content</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Various</td>
			<td style="width:280px;">http://www.promega.com/FindMyGene/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HaloTag Flexi Vectors for cloning (N- or C-terminal)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Various</td>
			<td style="width:280px;">Choose based upon expression level and HaloTag orientation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag TMR Ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8251</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>18896</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag Mammalian Pull-Down and Labelling System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6500</td>
			<td style="width:280px;">Contains HaloTag TMR ligand</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag Mammalian Pull-Down System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6504</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protease Inhibitor Cocktail, 50X</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6521</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mammalian Lysis Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9381</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag Monoclonal Antibody</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9211</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ProTEV Plus</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V6101</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RQ1 Dnase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloLink Resin</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>G1912</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HDAC-Glo</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6420</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS + 0.1% Triton X-100</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;">For optional imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4% paraformaldehyde/0.2M sucrose/PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;">For optional imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue culture vessels and dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable cell lifter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-773-1</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Glass homogenizer such as Kontes Dounce Tissue Grinder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K885300-0002</td>
			<td style="width:280px;">25-to 27- gauge needle could also be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube rotator such as Labquake</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4002110Q</td>
			<td style="width:280px;">Ideal for binding and washing steps</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Shaking platform such as Eppendorf Thermomixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-400-200</td>
			<td style="width:280px;">Ideal for SDS elution and TEV cleavage steps</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chambered cover glass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>155409</td>
			<td style="width:280px;">For optional imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent Microscrope (555nm Ex/585nm Em)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;">For optional imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discovering protein interactions and characterizing protein function using halotag technology

Forschung in der Proteomik hat in den letzten Jahren Fortschritte in der Massenspektrometrie-Funktionen, die auf die Charakterisierung der zahlreichen Proteomen, auch aus Viren, Bakterien und Hefe führte explodiert. Im Vergleich, die Analyse des menschlichen Proteoms hinkt, teilweise aufgrund der schieren Anzahl von Proteinen, die untersucht werden müssen, sondern auch die Komplexität von Netzwerken und Interaktionen diese vorhanden. Um den Herausforderungen der das Verständnis des menschlichen Proteoms spezifisch anzugehen, haben wir HaloTag Technologie für Proteinisolierung entwickelt, besonders stark für die Isolierung von Multiproteinkomplexen und eine effizientere Erfassung von schwachen oder transiente Wechselwirkungen und / oder Proteine ​​in geringer Menge. HaloTag ist eine genetisch kodierte Protein-Fusion-Tag für die kovalente entworfen, spezifisch und schnelle Immobilisierung oder Markierung von Proteinen mit verschiedenen Liganden. Mit Hilfe dieser Eigenschaften wurden zahlreiche Anwendungen für Säugerzellen zum Charakter entwickeltize Proteinfunktion und hier präsentieren wir Methoden einschließlich: Protein-Pulldown-Menüs für die Entdeckung von neuen Wechselwirkungen oder funktionelle Assays verwendet, und zelluläre Lokalisation. Es ergeben sich signifikante Vorteile in der Geschwindigkeit, Genauigkeit und kovalente Erfassung von Fusionsproteinen zur Proteomanalyse Flächen im Vergleich zu anderen herkömmlichen, nicht-kovalente Ansätze. Wir zeigen diese und die breite Anwendbarkeit der Technologie mit zwei wichtige epigenetische Proteine ​​als Beispiele, das menschliche Protein Bromodomäne BRD4 und Histon-Deacetylase HDAC1. Diese Beispiele zeigen, die Macht dieser Technologie bei, dass die Entdeckung von neuen Interaktionen und Charakterisierung von zellulären Lokalisation in Eukaryoten, die wird, gemeinsam weitere Verständnis der menschlichen funktionelle Proteomik.

Beim Arbeiten mit jeder neuen Fusionsprotein, ist es wichtig, zuerst Test für die Expression des Proteins nach Transfektion und auch bestätigen, dass ein Protein der korrekten Molekulargewicht erzeugt wird. Als HaloTag Fusionsproteine ​​können fluoreszierend und kovalent mit durchlässigen oder je nach Lokalisation undurchlässig Liganden markiert werden, ist es möglich, schnell zu bestimmen, indem die Expression Zellysaten denaturierende Gelelektrophorese, gefolgt von einer Abtastung auf fluorimager. Unter Verwendung der in Abschnitt 1.2, Ausdruck der Halo-BRD4 (189 kD) und dem Steuer HaloTag allein (Strg) beobachtet (34 kD, 2A) beschriebenen Protokoll. Wie im Protokoll erwähnt, kann die Expression von Fusionsproteinen auch mit herkömmlichen Western-Blots mit Anti-HaloTag Antikörper nachgewiesen werden, oder wenn sie vorhanden sind, Antikörper zu dem Köderprotein. Wenn möglich, ist es empfehlenswert, den fluoreszierenden Liganden statt dessen, wie es präziser, schneller und einfacher than-Antikörper-Nachweis und auch quantitative 10. Nach dem Ausdruck der richtigen voller Länge Fusionsprotein verifiziert ist, können Protein pulldowns durchgeführt werden. In Abbildung 2B sind die Silber-gefärbten Gelen der biologischen Replikate von Halo-BRD4 und Strg pulldowns durch SDS (Protokoll Abschnitt 2.4) eluiert, die eine hohe Reproduzierbarkeit zu demonstrieren. Die Silberfärbung Gele zeigen eine signifikante Anzahl von Proteinen zu finden sind, mit der BRD4 Protein und sehr niedrigen Hintergrund in der Kontrolle (2B) interagieren. Wie in der Einleitung erwähnt, in diesem Prozess der Elution, die Halo-BRD4 nicht aus dem Harz eluiert werden, sie bleibt kovalent gebunden sind. Daher gibt es keine signifikante Bande bei diesem Molekulargewicht in der Silberfärbung (Fig. 2B) oder Western Blot (Daten nicht gezeigt) nachgewiesen. Zu bestimmen, ob diese Proteine ​​spezifisch BRD4 wurde Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) auf der C durchgeführtomplexe Mischung nach SDS-Elution erhalten. In Abbildung 2C sind spektrale zählt und normierte spektrale Fülle Faktorwerte (NSAF) für bekannte Interaktoren von BRD4 18-20 in der Halo-BRD4 Massenspektrometrie-Analyse gefunden. Die hohe Fülle von Komponenten aus pTEFb 18,20 und auch die BRD9 19 Protein bestätigen spezifische Erfassung von BRD4 Komplexen. Wie durch die Silberfärbung Gele (2B) vorhergesagt wurden zahlreiche andere Proteine ​​als potentielle Interaktionspartner von BRD4, die nicht in der Kontrolle (Daten nicht gezeigt) beobachtet wurden identifiziert. Da diese bisher unbekannte, müssen sie unabhängig von anderen Methoden überprüft werden, um zu bestätigen, ob das Protein eine wahre Interaktor, und wenn ja, ob sie direkt oder indirekt mit BRD4 verbunden. Isolierte Komplexe auch für die Aktivität untersucht werden; Es wird empfohlen, um Komplexe zu eluieren mit TEV-Protease (Protokoll Abschnitt 2.5), so dass sie Funktionalitäten zu erhaltenty. In Fig. 3A eine Silberfärbung des Gels Halo-HDAC1-Pulldown-Komplexe aus dem Harz unter Verwendung von TEV-Protease freigesetzt wird, gezeigt. Als TEV-Protease wird in einem Linkerbereich zwischen dem Fusionsprotein Tag und seinem Fusionspartner, signifikante Mengen des Köder-Proteins, in diesem Fall HDAC1, beobachtet (Fig. 3A) zu spalten. Um festzustellen, ob diese Fraktion HDAC1 Aktivität wurden eluiert TEV Proben in einem lumineszierenden HDAC-Assay HDAC-Glo 21 getestet. Wie in 3B gezeigt ist, zeigte HDAC1 Pulldown Proben hohe Aktivität HDAC1 (Spalte 1), die spezifisch mit einem bekannten HDAC-Inhibitor, SAHA 22 (Spalte 2) gehemmt wurde. Als Kontrollen weiter Spezifität zu demonstrieren, wurde keine HDAC-Inhibition mit einer verwandten Familie Sirtuin-Inhibitor, EX-527 22 (Spalte 3) und kein Signal wurde mit Puffer allein ohne die HDAC1 Pulldown-Probe gegeben (Spalte 4) erkannt beobachtet. Ein wesentlicher Bestandteil der Funktional Proteomik und Verständnis Komplexe, ist auch das Verständnis Proteinlokalisierung und / oder Menschenhandel. Da diese gleiche Fusionskonstrukte können fluoreszenz innerhalb der Zellen markiert werden, überwacht wir deren Lokalisierung mittels konfokaler Bildgebung. Nach dem Protokoll in Abschnitt 3 wurden HeLa-Zellen transient mit Halo-BRD4 (4A) und Halo-HDAC1 (4B) transfiziert fluoreszenz mit der TMR-Liganden markiert und abgebildet. Wie in den 4A und 4B gezeigt, sowohl in den Kern, wie erwartet 17 lokalisiert. Diese Daten zeigen, dass die Anwesenheit von Tag nicht physiologischen zellulären Lokalisierung der Fusionspartner zu ändern. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51553/51553fig1highres.jpg" width="600" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Protein-Pulldown und konfokalen Imaging-Anwendungen. Verwendung als<html> ingle konstruieren mehrere Anwendungen für das Verständnis der Proteinfunktion in Säugetierzellen sind möglich. Für alle, ein Halo-Fusionskonstrukt entweder stabil oder transient in adhärenten oder Suspension Säugerzellen exprimiert. Für Protein-Komplex pulldowns werden die Zellen lysiert, Komplexe kovalent an Harz eingefangen und entweder durch SDS-Elution (linke Bahn) oder TEV-Spaltung (rechte Weg) eluiert. SDS Elution wird für Sie fortfahren Massenspektrometrie-Analyse empfohlen, während TEV-Spaltung ist optimal für die Durchführung der Funktionsanalyse. Um die Expression, zelluläre Lokalisation, Menschenhandel Ereignisse oder Proteinumsatz zu charakterisieren, sind Live-Zellen, die Fusionsproteine ​​fluoreszenzmarkierten und weiter SDS-PAGE-Gele oder mittels konfokaler Bildgebung analysiert. Beide Zelllässig oder undurchlässig fluoreszierenden Liganden verfügbar sind, abhängig von der Lokalisierung oder Darstellung des Fusionsproteins in der Zelle. ild 2 &quot;fo: content-width =&quot; 6in &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51553/51553fig2highres.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; Abbildung 2. Halo-BRD4 Proteinexpression, Pull-Down-und Massenspektrometrie-Analyse. (A) Eine SDS-PAGE-Gelen, welche die Expression von Halo-BRD4 Fusionsprotein, 189 kD und Halo-Tag-Fusionsprotein allein, 34 kD, Steuerung (Strg) innerhalb eines HEK293T Zelllysat mit TMR Ligand (Protokoll Abschnitt 2.1) gekennzeichnet. Die Gele wurden mit fluorimager zur Erkennung gescannt und eine Leuchtstoffmolekulargewichtsmarker verwendet wurde. (B) Silberfärbung Gele von biologischen Wiederholungen für pulldowns von Halo-BRD4 und Strg Proben mit SDS eluiert. Molekulargewichtsgrößen für das Gel Spectral Zahlen (links) und der normierten spektralen Fülle Faktoren Werte (NSAF) (rechts), die für Protein-Molekulargewicht der Proteine ​​in der Massenspektrometrie-Analyse von biologischen Replikaten Halo identifizierten Konto angegeben. (C) BRD4 und Strg. Dargestellt sind Proteine ​​bekannt, w interagierenith BRD4, einschließlich Komponenten pTEFb (CDK9 und Cyclin T) 18,20 sowie BRD9 19. Keine Peptide aus dieser Proteine ​​wurden in der Strg identifiziert. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51553/51553fig3highres.jpg" width="600" /> Abbildung 3. Halo-HDAC1-Komplex Isolierung und Aktivitätsanalyse. (A) Silberfärbung Gele, die die Isolierung von Halo-HDAC1 Komplexe und Hintergrund aus der Ctrl nach TEV-Spaltung (Protokoll Abschnitt 2.5). Der prominente HDAC1 Band (55 kDa) und der TEV-Protease-Band markiert sind. Die kostenlose HDAC1 wird durch TEV-Spaltung innerhalb einer optimierten Linker zwischen dem HaloTag und HDAC1 Fusionssequenz nach der Aufnahme auf dem Harz (Abbildung 1). (B) Die Grafik zeigt die Aktivität von HDAC1-Komplex Isolierungen Proben in einem lumineszierenden Histon-Deacetylase-Assay HDAC-generierte Glo 21. Spalte 1 der Graph zeigt hohe lEvels von HDAC-Aktivität mit den Halo-HDAC1 Pulldown-Proben (HDAC1) enthalten ist. Spalte 2 zeigt, kann diese Aktivität spezifisch durch Zugabe der HDAC-Inhibitor, SAHA 22 verringert werden, um den Pull-Down-HDAC1 Proben. Als Kontrollen Spalte 3 zeigt eine Deacetylase-Inhibitor spezifisch für die Sirtuin-Familie, aber nicht HDACs, EX-527 22, nicht HDAC1-Aktivität und Spalte 4 keine Aktivität mit Puffer allein beobachtet hemmen. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51553/51553fig4highres.jpg" width="600" /> 4. Halo-BRD4 und Halo-HDAC1 konfokale Bildgebung. Lebendzell konfokale Bildgebung von HeLa-Zellen mit Halo-BRD4 (A) oder Halo-HDAC1 (B) mit TMR fluoreszierend markierten Liganden transfiziert. (A) Halo-BRD4 Expression eingeschränkt zum Kern und (B) Halo-HDAC1 Expressions überwiegend nucLear. Linke Seite des Panels fluoreszierend Kanal und rechts ist eine Überlagerung der Fluoreszenzkanal mit dem Kanal für jeden DIC. Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 37 ° C + CO 2 Klimakammer mit entsprechenden Filtersätzen ausgestattet erworben. Maßstabsbalken = 20 um.

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Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

HaloTag Technologie ist eine Technologie, die multifunktionale bedeutenden Erfolg in Isolation von kleinen und großen Proteinkomplexen aus Säugerzellen gezeigt hat. Hier beleuchten wir die Vorteile dieser Technologie im Vergleich zu bestehenden Alternativen und zeigen ihren Nutzen zu zahlreichen Aspekten der Proteinfunktion innerhalb eukaryotischen Zellen zu studieren.

Die Entdeckung und Charakterisierung von Protein-Wechselwirkungen Protein-Funktion Mit HaloTag Technologie

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

discovering-protein-interactions-characterizing-protein-function

Research

JoVE Journal

Biology

36.8K Aufrufe.  Promega Corporation.  HaloTag Technologie ist eine Technologie, die multifunktionale bedeutenden Erfolg in Isolation von kleinen und großen Proteinkomplexen aus Säugerzellen gezeigt hat. Hier beleuchten wir die Vorteile dieser Technologie im Vergleich zu bestehenden Alternativen und zeigen ihren Nutzen zu zahlreichen Aspekten der Proteinfunktion innerhalb eukaryotischen Zellen zu studieren. 

Serie: Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Forschung

Biologie

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Mit dem GELFREE 8100 Fraktionierung System für Molecular Weight-Based Fraktionierung mit Liquid Phase Wiederherstellung

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Imaging Protein-Protein-Wechselwirkungen In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

Die MultiBac Protein Complex Produktion Platform am EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Bäckerhefe Protein Extraktion und Reinigung für das Studium der Funktion, Wechselwirkungen, und post-translationale Modifikationen

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementation in Tabak-Protoplasten-und Blätter-Visualisierte

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen Mit Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most of these require access to specialist equipment, and often require a degree of expertise to effectively establish reliable experiments and analyze data. Differential scanning fluorimetry (DSF) is being increasingly used as a robust method for initial screening of proteins for interacting small molecules, either for identifying physiological partners or for hit discovery. This technique has the advantage that it requires only a PCR machine suitable for quantitative PCR, and so suitable instrumentation is available in most institutions; an excellent range of protocols are already available; and there are strong precedents in the literature for multiple uses of the method. Past work has proposed several means of calculating dissociation constants from DSF data, but these are mathematically demanding. Here, we demonstrate a method for estimating dissociation constants from a moderate amount of DSF experimental data. These data can typically be collected and analyzed within a single day. We demonstrate how different models can be used to fit data collected from simple binding events, and where cooperative binding or independent binding sites are present. Finally, we present an example of data analysis in a case where standard models do not apply. These methods are illustrated with data collected on commercially available control proteins, and two proteins from our research program. Overall, our method provides a straightforward way for researchers to rapidly gain further insight into protein-ligand interactions using DSF.

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Bestimmung der Protein-Ligand-Wechselwirkungen mit Differential Scanning Fluorimetrie

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Probing hoher Dichte Funktionale Protein-Microarrays, um Protein-Protein Wechselwirkungen erkennen

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...