AirID ist ein wertvolles Enzym für die Protein-Protein-Interaktion, und es erzeugt weniger Toxizität und weniger Fehleranfälligkeit in zeitaufwändigen Prozessen als andere Proximity-Markierungsenzyme. Es wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Durchführung des Proximity-Labeling-Experiments in Gurke oder Cucumis sativus am Beispiel AT4G18020 APRR2-AirID-Proteins vorgestellt. Ahmad Zada, Imran Khan, Yuting Cheng und Min Zhang aus meinem Labor werden das Verfahren demonstrieren.
Beginnen Sie damit, die Cucumis sativus- oder Gurkensamen in Wasser umzufüllen, sie 20 Minuten lang bei 50 Grad Celsius zu inkubieren und dann die Samen für 12 bis 16 Stunden auf das Filterpapier auf einer Petriplatte zu legen. Später setzen Sie die Samen in Töpfe mit Erde um und ziehen sie in einer Klimakammer bei 23 Grad Celsius in 16 Stunden Licht und 18 Stunden dunkler Photoperiode für drei bis vier Wochen. Übertragen Sie 2,5 Mikroliter des Plasmids EarleyGate 100 auf die kompetenten Zellen des Stamms Agrobacterium tumefaciens GV3101.
Inkubieren Sie das Röhrchen 30 Minuten lang auf Eis, bevor Sie es für drei Minuten in flüssigen Stickstoff überführen. Um den Hitzeschock zu verabreichen, wird das Röhrchen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius in den Inkubator gegeben. Legen Sie das Röhrchen dann für zwei Minuten auf Eis.
Geben Sie 1.000 Mikroliter Luria Bertani oder LB-Medium zu den hitzegeschockten Agrobakterienzellen. Nachdem die Zellen eine Stunde lang bei 30 Grad Celsius und 118 U/min inkubiert wurden, zentrifugieren Sie sie bei 3000 G für zwei Minuten bei vier Grad Celsius. Anschließend den 800 Mikroliter Überstand verwerfen und die restliche Lösung mischen.
Tragen Sie es auf das LB-Medium auf, das mit jeweils 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin und Gentamycin und 25 Mikrogramm pro Milliliter Rifampicin ergänzt wird. Die Platten 48 Stunden lang bei 30 Grad Celsius inkubieren. Nimm einige Bakterienkolonien von den Tellern auf.
Geben Sie sie in flüssige LB-Medien, die mit geeigneten Antibiotika ergänzt werden, und inkubieren Sie flüssiges LB bei 30 Grad Celsius und 218 U/min für 36 bis 48 Stunden. Nach zwei Minuten Zentrifugation bei 3.000 g bei vier Grad Celsius wird das Pellet in einem Agroinfiltrationspuffer resuspendiert, um die optische Dichte auf eine Wellenlänge von 600 Nanometern einzustellen. Infiltrieren Sie mit einer nadellosen Spritze von einem Milliliter die gesamte Epidermis der abaxialen Oberfläche mit 1,5 Millilitern des resuspendierten agrobakteriellen Inokulums.
Halten Sie die Pflanzen in der Klimakammer bei 23 Grad Celsius mit 75 Mikromol pro Quadratmeter pro Sekunde 16 Stunden lang unter dunklen Bedingungen acht Stunden lang beleuchten Nach 36 Stunden infiltrieren Sie einen Milliliter von fünf Mikrogramm Biotin in die bereits infiltrierten Blätter. Nach vier bis 12 Stunden Biotin-Infiltration schneidest Du die Blätter ab und überführst sie schnell in flüssigen Stickstoff, um einen Proteinabbau zu vermeiden. Mahlen Sie die Blätter mit einem Stößel und Mörser und fügen Sie schnell zwei Milliliter PBS BSA mit einem pH-Wert von 7,4 hinzu, gefolgt von einem langsamen Mahlen.
Die Probenmischung wird durch einen darauf platzierten Schnellfiltrationsfilter in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt und das Röhrchen auf Eis gelegt. Die Proben werden in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen überführt. Fügen Sie einen 1%igen Proteininhibitor-Cocktail hinzu und mischen Sie den Inhalt, indem Sie das Röhrchen sieben bis acht Mal auf und ab drehen, bevor Sie es zentrifugieren.
Wenn Sie fertig sind, geben Sie den Überstand in ein neues 2-Milliliter-Röhrchen um und fügen Sie 10 % Beta-D-Maltosid hinzu. Legen Sie das Röhrchen fünf Minuten lang auf Eis, bevor Sie es 10 Minuten lang bei 20.000 g bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Um die Entsalzungssäule auszugleichen, markieren Sie eine Seite der Säule und zentrifugieren Sie sie mit der markierten Seite nach außen.
Entfernen Sie die obere und untere Abdeckung der Säule und zentrifugieren Sie erneut bei 1.000 G für zwei Minuten bei vier Grad Celsius. Verwerfen Sie die flüssige Lösung aus dem Sammelröhrchen der Säule und waschen Sie das Röhrchen mit fünf Millilitern PBS-Puffer mit Zentrifugation, wie zuvor gezeigt, mindestens fünfmal. Geben Sie einen Milliliter PBS BSA zu 50 Mikrolitern Streptavidin-C1-konjugierten Magnetkügelchen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und mischen Sie es gründlich.
Legen Sie das Röhrchen drei Minuten lang auf einen magnetischen Ständer, um die Perlen auf einer Seite des Röhrchens zu absorbieren. Entsorgen Sie den Überstand von der anderen Seite und wiederholen Sie diese PBS-BSA-Wäsche dreimal. Um das biotinylierte Protein anzureichern, geben Sie zwei Milliliter der Proben in die Säule.
Nach Zentrifugation der Säule bei 1000 g für acht Minuten bei vier Grad Celsius wird ein Milliliter entsalzter Proteinextrakt zu 50 Mikrolitern Streptavidin-C1-konjugierten Magnetkügelchen gegeben. Mischen Sie die Lösung gründlich, indem Sie das Röhrchen mit den Magnetperlen 30 Minuten lang bei normaler Geschwindigkeit und Raumtemperatur auf den Rotator legen. Als nächstes legen Sie die Perlen für drei Minuten bei Raumtemperatur auf das magnetische Gestell oder bis sie sich auf einer Seite des Röhrchens sammeln.
Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und fügen Sie einen Milliliter Waschpuffer hinzu. Drehen Sie das Röhrchen zwei Minuten lang auf einem Rotator und wiederholen Sie den Schritt, der auf dem Magnetgestell ausgeführt wurde, um den Überstand zu entfernen. In ähnlicher Weise führen Sie die Wäschen mit einem Milliliter Waschpuffer zwei und drei durch, wie zuvor gezeigt.
Entfernen Sie dann das Waschmittel in den Waschpuffern, indem Sie 1,7 Milliliter 50 Millimolar Trishydrochlorid hinzufügen und den Schritt auf dem Magnetgestell wiederholen. Sechs Wäschen à zwei Minuten mit einem Milliliter 50 Millimolar Ammoniumbicarbonat-Puffer. Sobald dies erledigt ist, fügen Sie 50 Mikroliter des Proteinextrakts hinzu, der 50 Millimolar Trishydrochlorid, 12 % Saccharose, 2 % Lithiumlaurylsulfat und 1,5 % Dithiothreitol enthält, und stellen Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 100 Grad Celsius in den Inkubator, um einen Hitzeschock zu erzeugen.
Nachdem Sie den Schritt auf einem magnetischen Gestell wiederholt haben, lagern Sie den Überstand bei minus 80 Grad Celsius für die LCMS/MS-Analyse. Die Western-Blot-Analyse der extrahierten Proteine zeigte eine erfolgreiche Proteinexpression und Biotinylierung in den infiltrierten Gurkenblättern. Das höhere Expressionsniveau der markierten Proteine und Extrabanden im Vergleich zur Kontrolle bestätigte die erfolgreiche Markierung der Zielproteine des interessierenden Gens durch AirID.
Die Ergebnisse wurden mit Hilfe von Anti-Flag- und Anti-Mass-Antikörpern bestätigt, die die Zielbande mit einem Anti-Flag-Antikörper in allen transformierten Proben zeigten. Nach der Anreicherung biotinylierter Proteine mit Streptavidin-C1-konjugierten magnetischen Kügelchen wurden mehrere Proteine unterschiedlicher Größe beobachtet. Aus allen Ergebnissen wurde gefolgert, dass AirID ein neuartiges und ideales Enzym für die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen in Pflanzen ist.
Während des Proximity-Labeling-Experiments ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass fünf mikromolare Biotin- und HR-Dauer ideal sind. Das Protokoll beschreibt die schrittweise Einrichtung der AirID-basierten Proximity-Markierung in der Pflanze, einschließlich der Vorbereitung der Blattprobe, der Entfernung von Präbiotin, der Quantifizierung von Extraktprotein und der Anreicherung biotinylierter Proteine. Es wird erwartet, dass AirID die PPI-unabhängige Biotinylierungsgenauigkeit in Kombination verbessert.
Es wird geschlussfolgert, dass AirID ideal für die PPI-Analyse in Pflanzen ist.
