Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem belgischen Nationalfonds für Scientific Forschung (FNRS), das Interuniversitäre Attraktion Polen Programm-belgischen Wissenschaftspolitik und die &quot;Communauté française de Belgique-Aktionen de Recherches Concertées&quot; zum FC, von der Israel Science Foundation Jerusalem (unterstützt ISF) zu MM (Grant # 1311-1312) und NM (Grant # 1312-1312).

1. Herstellung der Lösungen <ol><li> Vorbereitung isotonischen (600 mOsm) und hypotonische (500 mOsm)-Lösungen, enthaltend 10 mM KCl, 1 mM CaCl 2, und 8 M 2 (N-Morpholin) -ethanesulphonic (MES), pH 5,7, und stellen die Osmolarität mit den entsprechenden Mengen an D-Sorbit: 540 mm für die isotonische und 440 mm für die hypotonischen Lösung. Überprüfen Sie, ob die Osmolarität der Lösung (im Umkreis von 3% des Zielwertes) mit einem Osmometer. </li><li> Bereiten Sie ein trockenes Lager der &quot;enzymatischen Mix&quot;, die die folgenden Enzyme: 0,55 g Cellulase, 0,1 g Pectolyase, 0,33 g Polyvinylpyrrolidon K 30, 0,33 g BSA (siehe Tabelle 1 unten), mischen Sie die trockenen Pulver durch Wirbel, machen 5,7 mg Aliquots und Lagerung bei -20 ° C. </li></ol> 2. Isolierung von Arabidopsis Mesophyll-Protoplasten <ol><li> Bereiten Sie eine Petrischale (10 cm) mit etwa 6 Tropfen (ca.. Jeweils 30 ul) isotonischer Lösung. </li><li> Schälen Sie die abaxial (unteren) Arabidopsis Blattoberhaut, cut die geschälte Blatt in Quadrate von etwa 4 x 4 mm 2, dann legen Sie die Quadrate auf der isotonischen Lösung fällt mit der freigelegten abaxial Seite nach unten, berühren Sie die Lösung. </li><li> Auflösen 5,7 mg des Enzym-Mix in 165 ul isotonische Lösung (3,3% w / w) in einem 1,5-ml-Röhrchen, vorsichtig mischen für eine Minute oder so, bis sie gelöst, und platzieren Sie mehrere ähnliche Tropfen der Enzymlösung in der gleichen Petri Gericht. </li><li> Übertragen Sie die Blattstücke auf die enzymatische Lösung Tropfen, schließen Sie das Gericht Abdichtung der Deckel mit einer Runde der Parafilm und Inkubation für 20 min, schwimmend das Gericht in einem Wasserbad auf 28 ° C eingestellt. </li><li> Fügen Sie noch einige Tropfen der isotonischen Lösung in die Schale (2 Tropfen pro jeder Enzymlösung Drop). Übertragen jedes Blattstück mit einem neuen isotonischen Lösung tropfen, dann sequentiell auf einen zweiten Tropfen (um die Enzymlösung abzuwaschen). Heben Sie das Stück am Rand mit einer Pinzette, schütteln Sie sie in der zweiten Tropfen (wie ein Teebeutel), um die Protoplasten freizugeben.Sammeln Sie die Tropfen mit der Protoplasten (unter Verwendung eines abgeschnitten aus 100 ul Pipettenspitze) in ein 1,5-ml-Tube. </li></ol> 3. Die Herausforderung Hypotone Assay: Arabidopsis Mesophyll Zellschwellung <ol><li> Vorbereitung Perfusionssystem (1A) durch Füllen einer Säule mit dem isotonischen Lösung und einer anderen Spalte mit der hypotonischen Lösung. Das Ventil zu öffnen, lassen einige Lösungsstrom (der ersten hypotonischen, wird die isotonische), um das Rohr ganz nach unten in die Einlassverteiler (1B) zu füllen. Sicherzustellen, dass keine Luftbläschen, und schließen Sie das Ventil. </li><li> Siegel ein Deckglas mit Silikonfett (Tabelle 1), um einen Boden für die Kammer innerhalb des Plexiglas Schiebe machen (Abbildung 1B, siehe auch die Schaltpläne der Kammer in 1C). Um den Kammerboden (die nach oben weisenden freigelegten Oberfläche des Deckglases in der Fettring) machen &quot;sticky&quot; für Protoplasten, beschichtenmit positiver Ladung tragenden Protaminsulfat (1% in Wasser; Tabelle 1) oder Poly-L-Lysin (0,1% in Wasser; Tabelle 1). Verbreiten Sie diesen &quot;Leim&quot; über das Deckglas mit einer Pipettenspitze, warten mit 1 - 2 min, spülen Sie 3 - 4 mal mit der isotonischen Lösung und schütteln sich die verbleibende Lösung. </li><li> Füllen Sie die Kammer mit der isotonischen Lösung. Dann fügen Sie einen Tropfen von Protoplasten haltige Lösung in die Kammer, mit einer Pipettenspitze abgeschnitten ist, und warten Sie 3 - 4 min für die Protoplasten zu begleichen. Decken Sie die Kammer mit einer transparenten Abdeckung (1D, 1E) Berühren der Oberfläche der Lösung (Vermeidung von Luftblasen unter). </li><li> Legen Sie den Schieber (vorsichtig!) Auf einem inversen Mikroskop Tisch, verbinden Sie es mit der Durchblutung System und die Pumpe (Schutz vor Luftblasen im Schlauch!) Und schalten Sie den isotonischen Lösung für konstante Durchflussdurchblutung bei 1 ml / min (schneller Raten kann verwendet werden, bis zu 4 ml / min). </li><li> Für die AufnahmeVolumenänderungen wird ein invertiertes Mikroskop, mit einem 20x-Objektiv und ein CCD-Videokamera mit einem PC-Computer verbunden ist. Verwenden Sie die &#39;CMU 1394 Camera Driver &quot;-Plugin des ImageJ-Software (siehe Tabelle mit den spezifischen Materialien für die Download-Adressen dieser beiden Software-Stücke), um einen 60 Sekunden-Video-Film von ausgewählten unbeweglich Protoplasten aufzeichnen (vermutlich jener, die mit dem Boden fest) bei einer Rate von 1 Bild / s (1 Hz). Start der Aufzeichnung mit einer 15 sec Waschen der isotonischen Lösung (dies bildet den Ausgangswert), um die hypotonischen Lösung für 45 sec Schalter (auf insgesamt 60 Sekunden vom Beginn der Perfusion zu vervollständigen). Speichern Sie den Film im TIF-Format. HINWEIS: Wählen Sie ein Feld mit Blick auf so viele Zellen wie möglich, die folgende Kriterien erfüllen: kugelförmig und mit einem gut fokussierten Zellkontur an ihren größten Umfang (Abbildung 2a). </li></ol> 4. Analyse der Zellvolumenänderung mit ImageJ Hinweis: Um die AnalyseSerie von Bildern von einem Quellzelle, verwenden Sie den &quot;Image Explorer&quot; und &quot;Protoplasten Analyzer &#39;plugins in der ImageJ-Software (von Xavier Draye geschrieben) 14. Ausgehend von den gewählten Protoplasten an ihrem ersten Zeitpunkt wird die &quot;Protoplasten Analyzer &#39;Plugin erkennt automatisch die Protoplasten Kanten (Konturen) und berechnen den Zeitverlauf ihrer Flächen während des Versuchs (die Plugins sind mit dem PfFit Analyseprogramm, unten) . <ol><li> Starten Sie ImageJ. Um den Film zu öffnen, klicken Sie auf &quot;Datei&quot; auf der ImageJ-Panel, dann nacheinander auf den Dropdown-Menüs, wie sie sich entfalten: &quot;Import&quot; und dann &quot;Image Explorer. Markieren Sie den ausgewählten Film, dann mit der rechten Maustaste darauf klicken, dann links klicken auf &quot;Protoplasten Analyzer&quot;. Stöbern Sie in den Film (mit einem Schieberegler an der Protoplasten Bild unten), um Protoplasten, die während des Experiments weitgehend unbeweglich bleiben identifizieren - diese werden analysiert werden. Zurück auf der ersten image, mit der Maus, ziehen Kreise (aus den ImageJ Zeichenwerkzeuge aufgenommen) um die ausgewählten Protoplasten (2B), dann klicken Sie in der Tabelle der &quot;Nachweis Parameter &#39;, die erschien&#39; OK &#39;. </li><li> Um die Protoplastenerkennungsalgorithmus zu starten, klicken Sie auf &#39;Local&#39; auf der Protoplasten Bild oben Panel, dann &quot;Prozess&quot; im Dropdown-Menü. Untersuchen Sie die grüne Kreise um die ausgewählten Protoplasten (Abbildung 2C) während des Films. Speichern Sie das &#39;Ergebnis&#39; in einer Excel-Datei. Beenden Sie ImageJ. HINWEIS: Im Falle erscheint ein roter Punkt (eine schlechte Passform Kontur zeigen - in der Regel aufgrund einer schlechten Bildkontrast), erneut mit anderen Parametern. </li><li> Um die zu jeder Zelle gehörenden Linien zu trennen (- wenn zwei oder mehr Zellen wurden gleichzeitig analysiert - was wird miteinander verflochten werden, da die Analyse Frame für Frame), in Excel, sortieren Sie die gespeicherten Daten von der Zellzahl-Säule (&quot;Objekt&quot; ). </li><li> Nach Determine die Pixel-zu-um-Umrechnungsfaktor für den Erhalt der Realwert der P f, Snap ein Bild von einem Mikrometer Herrscher über die gleiche 20X Mikroskop-Objektiv. Ziehen Sie eine Linie (aus den Zeichenwerkzeugen ImageJ abgeholt) entlang der Bild Lineal und lesen Sie die Pixelzahl entspricht der Herrscher Länge an der Unterseite des ImageJ Hauptfeld. Konvertieren Sie die beliebige Pixelbereich Werte in der Excel-Datei in um 2. Speichern Sie die Bereiche Zeitverlauf (für jede Zelle separat) als Textdatei (zwei Spalten mit Zahlen). ANMERKUNG: Dies wird als Eingang zu dem Volumen schlüssige &#39;PfFit &quot;Programm sein. </li></ol> 5. Modellierung der Währungs Osmolarität Wechsel in der Versuchskammer mit ImageJ und der MATLAB-Programm P f Fit <ol><li> Add 2 mg Xylencyanol (Tabelle 1, unten), um 100 ml der isotonischen Lösung (die &quot;Indikatorfarbstoff &#39;zu erzeugen). </li><li> Bereiten Sie die Perfusion System (wie in 3.1) mit der Indikatorfarbstoff und der nicht gefärbt hypotonic Lösung. </li><li> Siegel ein Deckglas mit Silikonfett auf den Boden der Kammer Plexiglas, dann vorsichtig die Kammer mit der Indikatorfarbstoff zu füllen, bedecken Sie es mit einem Deckglas (wie bei den Protoplasten vor) und legen Sie es auf den Mikroskoptisch. </li><li> Schließen Sie die Kammer mit dem Perfusionssystem und der Pumpe, und schalten Sie den Indikatorfarbstoff Fluss für eine konstante Durchblutung bei l ml / min. </li><li> Nehmen Sie einen 60 Sekunden-Film mit einer Rate von 1 Hz. Starten Sie die Aufnahme mit 15 Sekunden der Indikatorfarbstoff, wechseln Sie in die hypotone Lösung für 45 Sekunden. Dreharbeiten zu stoppen. Bündig mit der Indikatorfarbstoff (mindestens 30 Sekunden), und starten Sie einen neuen Film. Wiederholen etwa 5 - 6 mal, und speichern Sie alle Filme </li><li> Verwenden Sie die ImageJ-Software, um die Videobilder von der Indikatorfarbstoff Lässigkeit zu analysieren, um einen gemittelten Zeitverlauf der Veränderung Lässigkeit zu erhalten. <ol><li> Starten Sie ImageJ, klicken Sie auf &quot;Datei&quot;, dann auf &quot;Öffnen&quot;, und suchen Sie nach dem Film. Für jeden Film, ziehe eine 10 Pixel breite vertikaleRechteck überall auf dem 1. Bild des Films. Klicken Sie auf &quot;Bild&quot; auf der ImageJ Hauptfeld, und klicken Sie auf &#39;Crop&#39; im Dropdown-Menü. </li><li> Um die 60 Bilder (von der 60 Sekunden-Film) in einer Reihe ausgerichtet, klicken Sie erneut auf &#39;Bild&#39;, dann klicken Sie nacheinander in den Dropdown-Menüs, wie sie sich entfalten: &quot;Stacks&quot; und &quot;Make Montage&quot; (Spalten 60, Reihe 1). Zeichnen Sie ein 1 Pixel hohe horizontale Rechteck überall entlang der ganzen Reihe von Bildern und klicken Sie auf &quot;Analysieren&quot; in der ImageJ Hauptfeld, dann klicken Sie auf &quot;Grundstück Profil&quot; im Dropdown-Menü. HINWEIS: Ein &#39;Plot der Montage &quot;-Fenster erscheint (nicht gezeigt), und eine Liste der Transmissionsdaten von seinem Menü geöffnet werden. Jedes Bild des Films wird in dieser Liste von 10 Transmissionswerte mit Ursprung in seinem 10 Pixel breiten Rechteck und damit die &quot;Zeitbasis&quot; vertreten (das Bild fortlaufende Nummer) ist 10-mal länger. </li><li> Kopieren Sie die Listen der Durchlässigkeit datein (eine Liste pro Film) in eine Excel-Datei. Der Mittelwert der Transmissionszeitkurse von den mehreren Filmen des Indikatorfarbstoffs Wallungen erhalten. Generieren Sie eine Echtzeit-Basis durch Multiplikation der Bild laufende Nummer 0.1. Speichern Sie die gemittelten Zeitverlauf (zwei Spalten) in eine Textdatei. HINWEIS: Vor dem Mittelwertbildung, wenn gewünscht, zu plotten die einzelnen Zeitkurse, um Unregelmäßigkeiten zu verwerfen. Stellen Sie sicher, dass der Film mindestens 5 sec Finale der Steady-State-Durchlässigkeit des Indikatorfarbstoffs. </li></ol></li><li> Starten Sie das Programm Matlab pass P f Fit (Panel &quot;Anzeiger Fit &#39;, Bild 3), um die verschiedenen Parameter der Osmolarität Zeitverlauf zu berechnen. HINWEIS: basierend auf den bekannten anfänglichen und endgültigen Konzentrationen der Lösung in dem Bad wird der zeitliche Verlauf der Veränderung des osmotischen Konzentration der Lösung von den Konzentrationsverlauf berechnet (berechnet, die wiederum von der Indikatorfarbstoff Lässigkeit), vorausgesetzt, es folgt die gleiche Dynamik wie dieFarbstoffkonzentration. P f Fit ist ein Programm zur kostenlosen Nutzung zur Verfügung. Die &quot;PfFit_Installer_web.exe&quot; kann heruntergeladen werden von: P f Fit Benutzerhandbuch &quot;mit ausführlichen Erklärungen und Definitionen ist über Zeus als zusätzliche Datei, die den Benutzer mit der P f Fit-Programm vertraut zu machen hilft zugänglich. </li><li> In dem Panel &quot;-Anzeige Fit&quot;, importieren Sie die Daten der mittleren Zeitverlauf der Indikatorfarbstoff Lässigkeit (&quot;Indikator-Datendatei&quot;, 3A) und legen Sie manuell die aktuellen Experimentparameter und die anfänglichen Vermutungen der Parameter &#39;Breite&#39; und &#39; t_half &#39;den Zeitverlauf der Konzentration der Indikatorfarbstoff (3B beschreibt. Klicken Sie auf &quot;Ausführen&quot;, um die Grundstücke der Zeitverläufe der Konzentration der Indikatorfarbstoff (Echtdaten und fit, 4A) und von der modellierten (berechnet) Bad Osmolarität (4B). HINWEIS: agOOD Anpassung an die Daten ist von wesentlicher Bedeutung (eine Empfehlung: Beginnen Sie mit den in Abbildung 3 dargestellten Werte). </li></ol> 6. Die Bestimmung der P f mit der Matlab Fitting-Programm P f Fit HINWEIS: Zusätzlich zu den grundlegenden Annahmen in Bezug auf das Verhalten von einem Protoplasten als eine wahre und vollkommene Osmometers 11, die Bestimmung der P f beruht auf der Annahme, dass P f sich mit der Zeit ändern, dass diese Dynamik der P f liegt unter der Zeit Verlauf der Zellvolumenänderung und dass drei Parameter aus, um es zu beschreiben: P fi (den Anfangswert des P f), Slope Pf (die Geschwindigkeit der Längenänderung von P f) und Delay (die Zeit vom Beginn des Bades Osmolarität Änderung bis zum Beginn der Zellvolumenänderung). Verschiedene Modelle können getestet werden, darunter verschiedene Kombinationen dieser Parameter und deren Werte, einschließlich Nullwerte 11. P <sub&gt; f Fit nach dem besten Kombination dieser Parameter zu ergeben - durch Berechnung - die originalgetreue Reproduktion des Versuchszeitverlauf der Zellvolumenänderung 11, berechnet, die wiederum aus der importierten Reihe von Zell-Konturbereiche (siehe auch die Zusatz &#39;P f Fit Benutzerhandbuch). <ol><li> Wechseln Sie auf die &quot;Volume Fit&quot;-Panel (Abbildung 5). Wählen Sie für den Import die Bereiche Datendatei (die Textdatei mit dem zeitlichen Verlauf der &quot;Gebiete&quot; der untersuchten Protoplasten, 5A). Wählen Sie &quot;Letzte Anzeigefitting &#39;als Parameter Quelle (5B, siehe&#39; P f Fit Benutzerhandbuch&quot; für Alternativen). ANMERKUNG: Diese Parameter (5D) werden dann dem Osmotikum Veränderung des Bades für die Datenträger Anpassungsvorgang zu regenerieren. </li><li> In der &quot;Volume Fit&quot;-Panel (5C), zu initialisieren (füllen Sie die Anfangsschätzungen für) die P-f-Parameter: P f, Pf und Slope Delay (eine Empfehlung: Beginnen Sie mit 1, 1, bzw. 30), wählte das Modell &#39;Klasse&#39; (Empfehlung: Beginnen Sie mit II und Mark &quot;Kontrolle&quot; für alle drei Parameter eingebaut werden). Klicken Sie auf &quot;Ausführen&quot;, dann Augapfel den Zwischenwert (5E) und stellen Sie die Delay-Parameter und die Länge des Datensatzes, wenn nötig. </li><li> Untersuchen Sie die Ergebnisse Grafik (Abbildung 6), um die Passform zu bewerten Qualität und notieren Sie die Passform Fehler. Ändern Sie die Initialisierung Parameter ein paar falten jedem, und wieder&#39;Run &#39;. HINWEIS: Seien Sie nicht entmutigt werden, wenn das Programm stecken bleibt - das Programm neu starten gerade! </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang mehrmals, beginnend mit verschiedenen Kombinationen von Initialisierung Parameter, mit dem Ziel für den niedrigsten Wert des Passfehler. </li><li> Kopieren Sie die Liste der Passform ergibt sich direkt aus dem Bildschirm, oder finden sie in ter PfFit generierte &#39;_FIT_Vol_Results.txt&#39; Datei. </li></ol>

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We have nothing to disclose.

Beschrieben wird hier ein einfaches und sehr effizientes Verfahren zur Messung der P f der isolierten pflanzlichen Protoplasten, grundsätzlich auch auf andere sphärische Zellen, zB., Froschoozyten 11. Diese Methode basiert auf der Messung der P f in Reaktion auf eine osmotische Herausforderung an die Zelle. Im Gegensatz zu anderen Methoden, die auf diesem Ansatz ist jedoch die Änderung von Lösungen, dh der Osmolarität, nicht plötzlich, sondern allmählich, währen...

Wasseraufnahme und Fluss durch Zellmembranen ist eine wesentliche Voraussetzung für die Pflanzen Existenz sowohl auf zellulärer und die ganze Pflanze Ebenen. Auf zellulärer Ebene, Aquaporine (AQPs) spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulierung des osmotischen Wasserdurchlässigkeitskoeffizient (P f) der Zellmembran 1-3. Bisher wurden mehrere Verfahren zur Messung der endogenen P f Protoplasten aus verschiedenen Pflanzenorganen verwendet worden (dh Wurzeln, Mesophyll endodermis usw. Durch Chaumont et al. 4 Bewertung). Einer der Ansätze zur P f zu messen, um die Protoplasten zu einer osmotischen Herausforderung freizulegen und um die anfängliche Rate der Volumenänderung zu überwachen (dh., Die Steigung der linearen Phasen Anfang der Volumenänderung). Zwei verschiedene Verfahren wurden bisher für die dieser Ansatz beschrieben, die beide auf einer momentanen Austausch von Lösungen. Die erste besteht aus immobilizing Protoplasten mit einem Sog Mikropipette und Umschalten der Lösungsstrom 5 und dem zweiten der Übertragung der Protoplasten von einer Lösung zur anderen mit einer Mikropipette 6. Diese Mikropipette Saug-und Mikropipette Übertragung Methoden, die Bildaufnahme ganz am Anfang der schnellen Lösung Austausch zu ermöglichen (die frühe Phase der linearen Volumenänderung zu erfassen), wahrscheinlich beinhalten eine körperliche Belastung zu Protoplasten und erfordern spezielle Ausrüstung und Experten der Mikromanipulation. Das hier beschriebene Verfahren minimiert die Störung der Zellen, schließt keine Mikromanipulation und ermöglicht die Ableitung von P f, wenn die Badperfusion nicht augenblicklich. Nach der enzymatischen Verdauung, die Protoplasten in einer isotonischen Lösung eingetaucht ist, sind auf dem Deckglas Boden einer Plexiglas (aka Lucite oder Plexiglas) Kammer, die durch Ladungs-Wechselwirkung immobilisiert. Dann wird während einer konstanten Badperfusion,die isotonische Lösung entfernt von einer hypotonischen Lösung Erzeugung eines hypoosmotischen Herausforderung für die Protoplasten gespült. Die Quellung des Protoplasten ist Video aufgezeichnet und dann durch Kombinieren der Informationen über den Zeitverlauf der Badperfusion und der Zeitverlauf der Zellschwellung, die P f wird durch die Bildverarbeitung und Kurvenanpassungsverfahren bestimmt. Die Vorteile dieses Verfahrens sind, dass das Experiment ist sehr effizient, das heißt es ist möglich, einige Zellen gleichzeitig in einem einzigen Assay zu überwachen, und dass es keine spezielle Ausrüstung oder insbesondere Mikromanipulationsfähigkeiten erfordern. Mehrere Anwendungen für diese Methode sind möglich. B. Bestimmung der nativen P f eine Vielzahl von Zellen aus verschiedenen Geweben und Pflanzen, wie Mesophyll und Bündelscheidenzellen aus Arabidopsis Blatt 7, Maisblatt Mesophyllzellen oder Wurzelcortexzellen 8-10 oder Suspensionskulturzellen 11,12. In Additiauf, ist es möglich, P f des sphärischen Tierzellen wie Eizellen Zellen 11 zu bestimmen. Ein weiteres Beispiel ist der Prüfung AQP-Aktivität durch transiente Expression ihrer Gens in den Protoplasten (oder andere Gene, die sie beeinflussen können, zB Gene von Kinasen) und Bestimmung von deren Beitrag zur P f; beispielsweise die Expression von Tomaten AQP SlTIP2, 2 in Arabidopsis Mesophyll-Protoplasten durch PEG-Transformation und die Entschlossenheit der SlTIP2, 2 bezogenen P f 13. Schließlich Prüfung der Wirkung auf P f verschiedener Moleküle / Substanzen (Medikamente, Hormone, etc.) zugegeben, um die Lösungen können ebenfalls untersucht werden, zum Beispiel der AQP Blocker HgCl 2 7. Das folgende Protokoll beschreibt die Isolierung von Protoplasten von Arabidopsis Mesophyllzellen und die Bestimmung ihrer P f.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:288px;">KCl</td>
			<td style="width:140px;">Chem-Impex International</td>
			<td style="width:159px;">01247-1</td>
			<td style="width:516px;"><a href="http://www.chemimpex.com/">http://www.chemimpex.com</a> 
			Any source, anal. grade</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:288px;">CaCl2</td>
			<td style="width:140px;">Merck</td>
			<td style="width:159px;">11718006</td>
			<td><a href="http://www.merck.com/">http://www.merck.com</a> 
			Any source, anal. grade</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:288px;">2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">15152002</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com 
			Any source, anal. grade</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:288px;">D-Sorbitol</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">18032003</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com 
			Any source, anal. grade</td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:288px;">Cellulase</td>
			<td style="width:140px;">Worthington, Lakewood, NJ, USA</td>
			<td style="width:159px;">LS002603</td>
			<td><a href="http://www.worthingtonbiochem.com/">http://www.worthingtonbiochem.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:288px;">Pectolyase</td>
			<td style="width:140px;">Karlan,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Phonix, AZ, USA</td>
			<td style="width:159px;">8006</td>
			<td><a href="http://www.karlan.com/">http://www.karlan.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:288px;">Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">81420</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:288px;"><a href="https://my.labguru.com/catalog/materials/216">Bovine Serum Albumin (BSA)</a></td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">A9418-5G</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:288px;">Protamine sulphate</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P4380</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:288px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P8920</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:288px;">Xylene cyanol</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">X4126</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:288px;">Silicone vacuum grease heavy</td>
			<td style="width:140px;">Merck</td>
			<td style="width:159px;">107921</td>
			<td><a href="https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&amp;SEO_ErrorPageOccurred=true&amp;attachments=CoA">https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&#38;SEO_ErrorPageOccurred=true&#38;attachments=CoA</a></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Inverted microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100/TS100F</td>
			<td><a href="http://www.nikoninstruments.com/">http://www.nikoninstruments.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Peristaltic pump</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td style="width:159px;">EP-1 Econo&#160;Pump</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">Grayscale digital camera</td>
			<td>Scion Corporation</td>
			<td style="width:159px;">CFW-1308M</td>
			<td><a href="http://www.scioncorp.com/">http://www.scioncorp.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">CMU 1394 Camera Driver&#8217; plugin for ImageJ</td>
			<td style="width:140px;">Carnegie Mellon</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html">http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html</a> 
			Free software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ</td>
			<td style="width:140px;">NIH</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> 
			Free software</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Econo Gradient Pump Fittings Kit</td>
			<td style="width:140px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:159px;">731-9006</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Connectors, manifold</td>
			<td style="width:140px;">DirectMed</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S">http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S</a></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Burette infusion sets (columns)</td>
			<td style="width:140px;">Welford</td>
			<td style="width:159px;">IF-BR-001</td>
			<td>http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tubing</td>
			<td style="width:140px;">TYGON</td>
			<td style="width:159px;">R-3603</td>
			<td><a href="http://www.usplastic.com/">http://www.usplastic.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Plexiglass slide etc.</td>
			<td style="width:140px;">Perspectiv</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.perspectiv.co.il/index-en.html">http://www.perspectiv.co.il/index-en.html</a> 
			Our slide was custom-made, it does not appear on the web site but a copy can be remade to order as &#39;a copy of the slide already made for M. Moshelion&#39;.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">3M packaging Scotch tape 1&#39;&#39;, clear</td>
			<td style="width:140px;">Viking Industrial, UK</td>
			<td style="width:159px;">VKMONO25</td>
			<td><a href="http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8">http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8</a> 
			any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the osmotic water permeability coefficient (pf) of spherical cells: isolated plant protoplasts as an example

Studium AQP Regulationsmechanismen ist entscheidend für das Verständnis der Wasser Beziehungen sowohl auf der zellulären und der gesamten Anlage Ebenen. Dargestellt ist hier die einfache und sehr effiziente Methode zur Bestimmung des osmotischen Wasserdurchlässigkeitskoeffizienten (P f) in Pflanzenprotoplasten, grundsätzlich auch auf andere sphärische Zellen wie Frosch-Oozyten. Der erste Schritt des Assays ist die Isolierung von Protoplasten aus dem Pflanzengewebe von Interesse durch enzymatischen Verdau in eine Kammer mit einer geeigneten isotonischen Lösung. Der zweite Schritt besteht aus einem osmotischen Herausforderung Assay: Protoplasten am Boden der Kammer immobilisiert sind, um eine konstante Ausgangs Perfusion durch einen hypotonischen Lösung vorlegt, mit einer isotonischen Lösung und gefolgt. Die Zellschwellung ist Video aufgezeichnet. Im dritten Schritt werden die Bilder offline verarbeitet, um Volumenänderungen zu erhalten, und der Zeitverlauf der Volumenänderungen mit dem Zeitverlauf der Änderung in osmola korreliertheit der Kammer Perfusionsmedium mit einem Kurvenanpassungsverfahren in Matlab (die &#39;PfFit&#39;) geschrieben, um P f ergeben.

Um die P f die Aktivität verschiedener AQPs bestimmen und zu vergleichen, werden Mesophyll-Protoplasten aus Arabidopsis Blatt verwendet. Diese Protoplasten wurden gefunden, um niedrigen Grund (Hintergrund) P f Stufen 7 und kann als Funktions-Expressionssystem dienen, um reproduzierbare Messungen P f zu ermöglichen. Protoplasten aus einer reifen Blatt von einem 6 Wochen alten Arabidopsis-Pflanze wurden isoliert und drei Gen-Konstrukte mit AQP Gene...

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Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Messung des osmotischen Wasserdurchlässigkeit Koeffizienten (P f) der Zellen können helfen zu verstehen, die Regulationsmechanismen der Aquaporine (AQPs). P f die Bestimmung der sphärischen Pflanzenzellprotoplasten Protoplasten umfasst hier dargestellten Isolierung und numerische Analyse der anfänglichen Rate der Volumenänderung als Folge eines osmotischen Herausforderung bei konstanter Badperfusion.

Messung des osmotischen Wasserdurchlässigkeit Koeffizient (P<sub&gt; F</sub&gt;) Von sphärischen Zellen: Isolierte Pflanzenprotoplasten als Beispiel

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

15.9K Aufrufe.  The Hebrew University of Jerusalem.  Messung des osmotischen Wasserdurchlässigkeit Koeffizienten (P f) der Zellen können helfen zu verstehen, die Regulationsmechanismen der Aquaporine (AQPs). P f die Bestimmung der sphärischen Pflanzenzellprotoplasten Protoplasten umfasst hier dargestellten Isolierung und numerische Analyse der anfänglichen Rate der Volumenänderung als Folge eines osmotischen Herausforderung bei konstanter Badperfusion. 

Serie: Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Osmotic Avoidance in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function of Two Genes, Orthologues of Human NRXN1 and NLGN1, as Candidates for Autism

Neurexins and neuroligins are cell adhesion molecules present in excitatory and inhibitory synapses, and they are required for correct neuron network function1. These proteins are found at the presynaptic and postsynaptic membranes 2. Studies in mice indicate that neurexins and neurologins have an essential role in synaptic transmission 1. Recent reports have shown that altered neuronal connections during the development of the human nervous system could constitute the basis of the etiology of numerous cases of autism spectrum disorders 3.
Caenorhabditis elegans could be used as an experimental tool to facilitate the study of the functioning of synaptic components, because of its simplicity for laboratory experimentation, and given that its nervous system and synaptic wiring has been fully characterized. In C. elegans nrx-1 and nlg-1 genes are orthologous to human NRXN1 and NLGN1 genes which encode alpha-neurexin-1 and neuroligin-1 proteins, respectively. In humans and nematodes, the organization of neurexins and neuroligins is similar in respect to functional domains.
The head of the nematode contains the amphid, a sensory organ of the nematode, which mediates responses to different stimuli, including osmotic strength. The amphid is made of 12 sensory bipolar neurons with ciliated dendrites and one presynaptic terminal axon 4. Two of these neurons, named ASHR and ASHL are particularly important in osmotic sensory function, detecting water-soluble repellents with high osmotic strength 5. The dendrites of these two neurons lengthen to the tip of the mouth and the axons extend to the nerve ring, where they make synaptic connections with other neurons determining the behavioral response 6.
To evaluate the implications of neurexin and neuroligin in high osmotic strength avoidance, we show the different response of C. elegans mutants defective in nrx-1 and nlg-1 genes, using a method based on a 4M fructose ring 7. The behavioral phenotypes were confirmed using specific RNAi clones 8. In C. elegans, the dsRNA required to trigger RNAi can be administered by feeding 9. The delivery of dsRNA through food induces the RNAi interference of the gene of interest thus allowing the identification of genetic components and network pathways.

Osmotic Avoidance in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function of Two Genes, Orthologues of Human NRXN1 and NLGN1, as Candidates for Autism

Neurexins and neuroligins are membrane-neuron adhesion proteins which perform essential roles in synaptic differentiation and transmission. Neuroligin deficient mutants of C. elegans are defective in detecting osmotic strength, but when they also contain a mutation in the gene coding neurexin, they recover the wild type phenotype.

Osmotische Vermeidung in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function von zwei Genen, Orthologe der Menschenrechte NRXN1 Und NLGN1, Die als Kandidaten für Autismus

Neurexins and neuroligins are cell adhesion molecules present in excitatory and inhibitory synapses, and they are required for correct neuron network ...

Forschung

Biologie

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Fluorescence Activated Cell Sorting von Pflanzenprotoplasten

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic three-dimensional spring made of light that is formed when a high-intensity laser beam is focused to a very small spot by a microscope's objective lens. To bend a cell, we first bind live bacteria to a chemically-treated coverslip. As these cells grow, the middle of the cells remains bound to the coverslip but the growing ends are free of this restraint. By inducing filamentous growth with the drug cephalexin, we are able to identify cells in which one end of the cell was stuck to the surface while the other end remained unattached and susceptible to bending forces. A bending force is then applied with an optical trap by binding a polylysine-coated bead to the tip of a growing cell. Both the force and the displacement of the bead are recorded and the bending stiffness of the cell is the slope of this relationship.

We present a protocol for bending filamentous bacterial cells attached to a cover-slip surface with an optical trap to measure the cellular bending stiffness.

Die Messung der Biegesteifigkeit von Bakterienzellen mit einer optischen Falle

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

Die Messung der Kinetik der mRNA Transkription in einzelnen lebenden Zellen

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is avoided when the herbivore is able to select other plants2. Antibiosis is the degree to which the plant affects the fitness of the herbivore feeding on it1.Tolerance is the degree to which the plant can withstand or repair damage caused by the herbivore, without compromising the herbivore's growth and reproduction1. The durability of herbivore resistance in an agricultural setting depends to a great extent on the resistance mechanism favored during crop breeding efforts3.
We demonstrate a no-choice experiment designed to estimate the relative contributions of antibiosis and tolerance to spittlebug resistance in Brachiaria spp. Several species of African grasses of the genus Brachiaria are valuable forage and pasture plants in the Neotropics, but they can be severely challenged by several native species of spittlebugs (Hemiptera: Cercopidae)4.To assess their resistance to spittlebugs, plants are vegetatively-propagated by stem cuttings and allowed to grow for approximately one month, allowing the growth of superficial roots on which spittlebugs can feed. At that point, each test plant is individually challenged with six spittlebug eggs near hatching. Infestations are allowed to progress for one month before evaluating plant damage and insect survival. Scoring plant damage provides an estimate of tolerance while scoring insect survival provides an estimate of antibiosis. This protocol has facilitated our plant breeding objective to enhance spittlebug resistance in commercial brachiariagrases5.

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

This video explains mechanisms of host plant resistance to herbivory and demonstrates a no-choice test that estimates the relative contributions of antibiosis and tolerance to spittlebug resistance in Brachiaria spp.

Charakterisierung Herbivore Resistenzmechanismen: Spittlebugs auf Brachiaria Spp. als Beispiel

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Multi-Parameter-Messung der Durchlässigkeit Transition Pore Opening in isolierten Maus-Mitochondrien

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Quantifizierung der Mikrogefäßdurchlässigkeit im Einzel isolierten Blutdurchbluteten Lungen Rat Vorbereitung

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic compartment of plant leaves is the site of several important biological processes, including cell wall formation, cellular nutrient and water uptake and export, plant-endophyte interactions and defence responses to pathogens. The infiltration-centrifugation method is well established as a robust technique for the analysis of the soluble apoplast composition of various plant species. The fluid obtained by this method is commonly known as apoplast washing fluid (AWF). The following protocol describes an optimized vacuum infiltration and centrifugation method for AWF extraction from Phaseolus vulgaris (French bean) cv. Tendergreen leaves. The limitations of this method and the optimization of the protocol for other plant species are discussed. Recovered AWF can be used in a wide range of downstream experiments that seek to characterize the composition of the apoplast and how it varies in response to plant species and genotype, plant development and environmental conditions, or to determine how microorganisms grow in apoplast fluid and respond to changes in its composition.

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

Die Infiltration-Zentrifugation Technik zur Gewinnung von apoplastischen Flüssigkeit aus Pflanzenblättern verwenden<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt; Als Beispiel

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

The circadian clock regulates about a third of the Arabidopsis transcriptome, but the percentage of genes that feed back into timekeeping remains unknown. Here we visualize a method to rapidly assess circadian phenotypes in any mutant line of Arabidopsis using luminescent imaging of a circadian reporter transiently expressed in protoplasts.

Schnelle Analyse von Circadian Phänotypen in Arabidopsis Protoplasten Transfizierte mit einem lumineszenten Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants

Chloroplasts are organelles with many vital roles in plants, which include not only photosynthesis but numerous other metabolic and signaling functions. Furthermore, chloroplasts are critical for plant responses to various abiotic stresses, such as salinity and osmotic stresses. A chloroplast may contain up to ~3,000 different proteins, some of which are encoded by its own genome. However, the majority of chloroplast proteins are encoded in the nucleus and synthesized in the cytosol, and these proteins need to be imported into the chloroplast through translocons at the chloroplast envelope membranes. Recent studies have shown that the chloroplast protein import can be actively regulated by stress. To biochemically investigate such regulation of protein import under stress conditions, we developed the method described here as a quick and straightforward procedure that can easily be achieved in any laboratory. In this method, plants are grown under normal conditions and then exposed to stress conditions in liquid culture. Plant material is collected, and chloroplasts are then released by homogenization. The crude homogenate is separated by density gradient centrifugation, enabling isolation of the intact chloroplasts. Chloroplast yield is assessed by counting, and chloroplast intactness is checked under a microscope. For the protein import assays, purified chloroplasts are incubated with 35S radiolabeled in vitro translated precursor proteins, and time-course experiments are conducted to enable comparisons of import rates between genotypes under stress conditions. We present data generated using this method which show that the rate of protein import into chloroplasts from a regulatory mutant is specifically altered under osmotic stress conditions.

Here we describe a new method to study protein import into isolated chloroplasts under stress. The method is rapid and straightforward, and can be applied to study the consequences of different stress conditions for chloroplast protein import, and the corresponding regulatory mechanisms.

Analyse von Protein-Import in Chloroplasten von gestressten Pflanzen isoliert

Chloroplasts are organelles with many vital roles in plants, which include not only photosynthesis but numerous other metabolic and signaling functions. ...