Hello.Today zeigen wir Ihnen ein Protokoll, das Millionen von Mais-Mesophyllzellen protoplastet und sie mit hoher Effizienz umwandelt. Die Hauptschritte des Protokolls bestehen darin, zunächst die pflanzliche Zellwand zu verdauen und zu entfernen, die Protoplasten freizusetzen und dann den Protoplasten mit PEG zu transformieren. Der große Unterschied zwischen diesem Protokoll und anderen ist das Ausmaß der Transformation.
Die meisten Protokolle enden mit zwischen 1.000 und 10.000 transformierten Protoplasten. Unser Protokoll liefert jedoch Millionen von transformierten Maisprotoplasten. Hier haben wir Maissetzlinge, die neun bis 11 Tage nach der Keimung im Dunkeln gezüchtet werden.
Schneiden Sie die Sämlinge knapp über dem Boden ab und legen Sie sie ins Wasser. Bewahren Sie die Pflanzen im Dunkeln auf, wenn sie nicht verwendet werden. Wählen Sie das zweite und dritte Blatt jedes Sämlings aus und achten Sie darauf, Blätter mit braunen oder beschädigten Bereichen auszuschließen.
Wählen Sie 12 bis 16 Blätter aus und schneiden Sie einen Zentimeter von den Spitzen ab. Schneiden Sie dann von jedem Blatt einen 10 Zentimeter langen Abschnitt ab. Stapeln Sie die Blattabschnitte mit den basalen Enden übereinander.
Klemmen Sie das Bündel am basalen Ende mit einer Binderklammer zusammen. Legen Sie das Bündel Blätter auf ein weißes Blatt Papier. Schneiden Sie 0,5 bis einen Millimeter breite Blattscheiben ab.
Es ist wichtig, dünne, gleichmäßige Scheiben zu schneiden. Nachdem Sie einen Teil des Blattbündels abgeschnitten haben, geben Sie die Scheiben in die Enzymlösung. Lassen Sie das Material nicht austrocknen.
Schwenken Sie die Enzymlösung vorsichtig, um das Material zu benetzen. Legen Sie die Folie über das Becherglas, um das Licht abzuschirmen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis das gesamte Bündel in der Nähe der Bindeklammer zerschnitten ist.
Nach dem Schneiden sollte die Lösung so aussehen. Füllen Sie das Becherglas mit der Enzymlösung in eine Glasglocke. Infiltrieren Sie drei Minuten lang bei Raumtemperatur.
Auf einem Tischschüttler bei 40 U/min bei Raumtemperatur zweieinhalb Stunden inkubieren. Nach der Inkubation schwenken Sie die Lösung. Es sollte milchig aussehen, was auf eine erfolgreiche Verdauung hinweist.
Auf dem Tischschüttler bei 80 U/min bei Raumtemperatur weitere 10 Minuten inkubieren. Stellen Sie das Becherglas mit der Enzymlösung auf Eis. Stoppen Sie die Verdauung, indem Sie ein Volumen eiskaltes MMG hinzufügen.
Filtern Sie durch ein 40-Mikron-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Teilen Sie die Lösung in Aliquots von jeweils nicht mehr als 10 Millilitern auf. In gekühlte Glasröhrchen mit rundem Boden füllen.
Zentrifugieren Sie die Röhrchen vier Minuten lang bei 100 G. Entfernen Sie den Überstand und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören. Resuspendieren und dann Proben für nachfolgende Wäschen sammeln.
Protoplasten zweimal mit fünf Millilitern MMG waschen. Drehen Sie jedes Mal drei Minuten lang bei 100 G herunter. Das Pellet sollte eine schöne, leuchtend gelbgrüne Farbe haben.
Sie können das Pellet resuspendieren, indem Sie das Röhrchen vorsichtig schwenken. Resuspendieren Sie in einem Milliliter MMG und verdünnen Sie ein kleines Aliquot 10 bis 20x zum Zählen. Es ist wichtig, sich vor dem Aliqouting gut zu resuspendieren, da sich die Protoplasten schnell einpendeln.
Laden Sie die verdünnten Protoplasten in das Hämozytometer. Zählen Sie die Protoplasten unter einem Lichtmikroskop. Bei einer guten Vorbereitung schwimmt nach dem Waschen nicht viel überschüssiger Schmutz herum.
Gute Protoplasten sind kreisförmig mit sichtbaren Plastiden. Verwenden Sie die Zellenanzahl, um die Gesamtzahl zu berechnen. Diese Vorbereitung führte zu etwas mehr als 10 Millionen Protoplasten.
Wir empfehlen, die Viabilität mit dem Farbstoff Fluoresceindiacetat zu überprüfen. Erfolgreiche Protoplastenisolierungen ergeben eine Viabilität zwischen 70 und 90%Mischen Sie die Protoplasten mit dem gewünschten Plasmid. In diesem Beispiel werden 1 Million Protoplasten und 15 Mikrogramm DNA verwendet.
30 Minuten auf Eis inkubieren. Resuspendieren Sie, indem Sie auf die Seite des Röhrchens klopfen. Fügen Sie PEG-Lösung hinzu, um eine Endkonzentration von 12 % PEG zu erreichen.
Vorsichtig mischen, indem Sie mehrmals umdrehen. Protoplasten und PEG-Lösung sind zerbrechlich, schütteln Sie den Schlauch also nicht. Im Dunkeln bei Raumtemperatur 10 Minuten inkubieren.
Mit fünf Volumina Inkubationslösung verdünnen und vorsichtig durch Umkehrung mischen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen vier Minuten lang bei 100 G. Einmal mit einem Milliliter Inkubationspuffer waschen.
Achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören. Drei Minuten lang bei 100 G herunterdrehen. Im Inkubationspuffer auf eine Konzentration von 500 bis 1000 Zellen pro Mikroliter resuspendieren.
Über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Am nächsten Tag vier Minuten lang bei 100 G herunterdrehen. Zweimal mit gekühlter Inkubationslösung waschen.
Jedes Mal drei Minuten bei 100 g bei Raumtemperatur herunterschleudern. Resuspendieren, dann ein kleines Aliquot für die abschließende Kontrolle auf das Hämozytometer laden. Zählen Sie zunächst die Gesamtzahl der Protoplasten unter Hellfeld.
Beobachten Sie nun den Anteil der Protoplasten, die unter UV-Strahlung fluoreszieren, um die Transfektion zu überprüfen. Die Protoplasten drücken unseren GFP-Reporter aus. Sehen wir uns nun einige Metriken zur Transfektionseffizienz an.
In dieser Vorbereitung erhielten wir insgesamt 10 Millionen Protoplasten, von denen wir 1 Million transfizierten. Am nächsten Tag haben wir 335.000 geborgen. Davon hatten wir eine Transformationsrate von 30,3 %, so dass wir insgesamt etwa 100.000 Protoplasten haben, die GFP exprimieren.
Die Transfektionseffizienz kann variieren. Wie Sie in der Grafik sehen können, sehen wir routinemäßig Wirkungsgrade zwischen 20 und 50 % bei wiederholten Zubereitungen. Dieses Protokoll ermöglicht das Sammeln und Umwandeln von Millionen von Mais-Mesophyll-Protoplasten.
Einer der besten Teile des Protokolls ist seine Fähigkeit zur Skalierung. Durch die Skalierung des Volumens sowie der Anzahl der Protoplasten, die bei der Transformation verwendet werden, können Sie Ihre Transformation um mehr als eine Größenordnung gegenüber dem steigern, was wir heute gezeigt haben. Unser bisher größtes Einzelröhrchen-Experiment begann mit 20 Millionen Protoplasten und 200 Mikrogramm DNA und endete am nächsten Tag mit 3,1 Millionen transformierten Protoplasten.
Dieses Hochdurchsatzprotokoll ist besonders nützlich, wenn Sie viele verschiedene Plasmidkonstrukte testen müssen, aber Mitarbeiter haben dieses Protokoll für Zwecke verwendet, die keine Skalierung erfordern, wie z. B. das Entwerfen synthetischer Genschaltkreise und Mais. Vielen Dank, dass Sie sich unser Video angesehen haben. Wir hoffen, dass es geholfen hat.
