Este trabajo fue apoyado por becas del Fondo Nacional Belga para Científicos c Investigación (FNRS), el Interuniversitario de atracción polacos Programa-belga Política de Ciencia y la &quot;Comunidad Francesa de Bélgica-Acciones de Recherches Concertées&quot; a FC, de la Fundación de Ciencias de Israel Jerusalén ( ISF) a MM (Grant # 1311-12), y para NM (Grant # 1312-12).

1 Preparación de Soluciones <ol><li> Preparar isotónico (600 mOsm) y hipotónica (500 mOsm) soluciones que contienen 10 mM de KCl, 1 mM CaCl 2, y 8 M 2 (N-morfolina) -ethanesulphonic ácido (MES), pH 5,7 y ajustar la osmolaridad con las cantidades apropiadas de D-sorbitol: 540 mM para la isotónica y 440 mM de la solución hipotónica. Verificar la osmolaridad de la solución (a menos de 3% del valor objetivo) usando un osmómetro. </li><li> Preparar una pasta seca de &quot;mezcla enzimática &#39;que contiene las siguientes enzimas: 0,55 g de celulasa, pectoliasa 0,1 g, 0,33 g de polivinilpirrolidona K 30, 0,33 g de BSA (véase la Tabla 1 a continuación), mezclar el polvo seco por vórtice, hacer alícuotas de 5,7 mg y almacenar a -20 ° C. </li></ol> 2 Aislamiento de protoplastos de Arabidopsis mesófilo <ol><li> Preparar una placa de Petri (10 cm) con aproximadamente 6 gotas (aprox. 30 l cada una) de solución isotónica. </li><li> Pelar las abaxial epidermis (inferior) de la hoja de Arabidopsis, cut la hoja pelada en cuadrados de unos 4 x 4 mm 2, a continuación, colocar los cuadrados de la solución isotónica cae con el lado abaxial expuesto abajo, tocando la solución. </li><li> Disolver 5,7 mg de la mezcla de enzimas en 165 l solución isotónica (3,3% w / w) en un tubo de 1.5 ml, mezclar suavemente con la pipeta por un minuto más o menos hasta que se disuelva, y colocar varias gotas similares de la solución enzimática en el mismo Petri plato. </li><li> Transfiera los trozos de hojas en la solución enzimática gotas, cierre el sellado de la tapa de la placa con una ronda de parafilm y se incuba durante 20 min, flotando el plato en un baño de agua a 28 ° C. </li><li> Añadir varias gotas más de la solución isotónica al plato (2 gotas por cada enzima gota solución). Transferencia de cada pieza de la hoja a una nueva gota solución isotónica, entonces, de forma secuencial, a una segunda gota (para lavar la solución enzimática de distancia). Levante la pieza por el borde con unas pinzas, agitar en la segunda caída (como una bolsa de té) para liberar los protoplastos.Recoger las gotas con los protoplastos (usando una punta de pipeta 100 l recortada) en un tubo de 1,5 ml. </li></ol> 3. La hipotónica Desafío Ensayo: Hinchazón Cell Arabidopsis mesófilo <ol><li> Preparar el sistema de perfusión (Figura 1A) rellenando una columna con la solución isotónica y otra columna con la solución hipotónica. Abrir la válvula, dejar que un flujo de solución (la primera hipotónica, entonces el isotónica) para llenar el tubo de todo el camino hasta el colector de entrada (Figura 1B). Asegúrese de que no haya burbujas de aire atrapadas, y luego cerrar la válvula. </li><li> Sellar un cubreobjetos, utilizando grasa de silicona (Tabla 1), para hacer un fondo para la cámara dentro de la diapositiva de plexiglás (Figura 1B; véase también los esquemas de la cámara en la Figura 1C). Para hacer que el fondo de la cámara (la que mira hacia arriba superficie expuesta de la cubreobjetos dentro del anillo de grasa) &quot;pegajosa&quot; para protoplastos, el escudocon sulfato de soporte de carga positiva-protamina (1% en agua, Tabla 1) o poli-L-lisina (0,1% en agua; Tabla 1). Extienda esta &#39;pegamento&#39; sobre el cubreobjetos usando una punta de pipeta, espere 1 - 2 min, enjuagar 3 - 4 veces con la solución isotónica y agitar lejos la solución restante. </li><li> Llene la cámara de arriba con la solución isotónica. A continuación, añadir una gota de solución de protoplastos que contienen a la cámara, usando una punta de pipeta recortado y espere 3 - 4 min durante los protoplastos se asienten. Cubra la cámara con una cubierta transparente (figuras 1D, 1E) tocar la superficie de la solución (evitar atrapar burbujas de aire por debajo). </li><li> Coloque la corredera (con cuidado!) En una mesa de microscopio invertido, conectarlo al sistema de perfusión y la bomba (para protegerlos contra las burbujas de aire en el tubo!) Y encienda el flujo de la solución isotónica para la perfusión constante a 1 ml / min (tasas más rápidas se puede utilizar, hasta 4 ml / min). </li><li> Para la grabaciónlos cambios de volumen, se utiliza un microscopio invertido, con un objetivo de 20X y con una cámara de vídeo CCD conectada a un ordenador PC. Utilice el plugin &#39;CMU 1394 Camera Driver&#39; del software ImageJ (ver la Tabla de materiales específicos para las direcciones de descarga de estas dos piezas de software) para grabar una película de vídeo de 60 segundos de protoplastos inmóviles seleccionados (presumiblemente, los atrapados en el fondo) a una velocidad de 1 image / seg (1 Hz). Inicie la grabación con un lavado de 15 segundos de la solución isotónica (esto constituye la línea de base), cambiar a la solución hipotónica durante 45 segundos (para completar un total de 60 segundos desde el inicio de la perfusión). Guardar la película en formato TIF. NOTA: Elija un campo de visión con tantas células como sea posible, el cumplimiento de los siguientes criterios: forma esférica y con un contorno celular bien enfocado en su mayor perímetro (Figura 2A). </li></ol> 4. Análisis de la variación del volumen celular de uso de ImageJ NOTA: Para analizar laserie de imágenes de una célula de la hinchazón, use el &#39;Explorador de imágenes&#39; y &#39;plugins Protoplasto Analyzer&#39; en el software ImageJ (escrito por Xavier Draye) 14. A partir de los protoplastos elegidos en su primer punto de tiempo, el plug-in &#39;de protoplastos Analizador&#39; detectará automáticamente los bordes protoplastos (contornos) y calcular la evolución temporal de sus áreas durante el experimento (los plugins están disponibles con el programa de análisis PfFit, a continuación) . <ol><li> Iniciar ImageJ. Para abrir la película, haga clic en &quot;Archivo&quot; en el panel de ImageJ, a continuación, de forma consecutiva en los menús desplegables medida que se desarrollan: &quot;Importar&quot; y luego &quot;Explorador de imágenes&quot;. Resalte la película elegida, a continuación, haga clic en él, a continuación, haga clic izquierdo sobre &#39;Protoplasto Analizador&#39;. Navegar a través de la película (mediante un control deslizante en la imagen inferior protoplasto) para identificar protoplastos que permanecen prácticamente inmóviles durante el experimento - éstos serán analizados. De vuelta en la primera image, con el ratón, dibuje círculos (recogidos de las herramientas de dibujo ImageJ) alrededor de los protoplastos seleccionados (Figura 2B), a continuación, haga clic en &quot;Aceptar&quot; en la tabla &quot;parámetros de detección&quot; que aparecían. </li><li> Para iniciar el algoritmo de detección de protoplastos, haga clic en &#39;local&#39; en el panel superior de la imagen de protoplastos, a continuación, &quot;Proceso&quot; en el menú desplegable. Examine los círculos verdes alrededor de los protoplastos seleccionados (Figura 2 C) a lo largo de la película. Guarde el &#39;resultado&#39; en un archivo de Excel. Salir ImageJ. NOTA: En caso de que aparezca un punto rojo (para indicar un mal ajuste de contorno - por lo general debido a un contraste de imagen pobre), vuelva a ejecutar con diferentes parámetros. </li><li> Para separar las líneas pertenecientes a cada celda (que - si se analizaron simultáneamente dos o más células - se entrelazan, porque el análisis se realiza fotograma a fotograma), en Excel, ordenar los datos guardados por la columna del número de células (&quot;objeto&quot; ). </li><li> Para determine el factor de conversión de píxel a m para obtener el valor real de P f, snap una imagen de un gobernante micrómetro mediante el mismo objetivo 20X microscopio. Arrastre una línea (extraído desde las herramientas de dibujo ImageJ) a lo largo de la imagen regla y leer el número de píxeles equivalente a la longitud de la regla en la parte inferior del panel principal ImageJ. Convertir los valores del área de píxeles arbitrarias en el archivo de Excel en m 2. Guarde el curso zonas de tiempo (para cada celda por separado) como un archivo de texto (dos columnas de números solamente). NOTA: Este será un insumo para el programa &#39;PfFit&#39; volumen ajustado. </li></ol> 5. Modelado de la Tasa de Cambio osmolaridad en la Sala Experimental Usando ImageJ y la f Fit Matlab Programa P <ol><li> Añadir 2 mg cianol xileno (Tabla 1, a continuación) a 100 ml de la solución isotónica (para producir el &quot;Indicador de tinte &#39;). </li><li> Prepare el sistema de perfusión (como en 3.1) con el indicador de Dye y la h no teñidossolución ypotonic. </li><li> Sellar una hoja de cubierta con grasa de silicona a la parte inferior de la cámara de plexiglás, a continuación, rellene suavemente la cámara con el Indicador de Dye, cúbralo con una hoja de cubierta (al igual que con los protoplastos antes) y colocarlo en la platina del microscopio. </li><li> Conecte la cámara al sistema de perfusión y la bomba, y encienda el flujo Indicador de tinte para una perfusión constante en l ml / min. </li><li> Grabar una película de 60 segundos a una velocidad de 1 Hz. Inicie la grabación con 15 segundos de Indicador Dye, cambiar a la solución hipotónica durante 45 segundos. Dejar de filmar. Lave con el Indicador de tinte (por lo menos durante 30 segundos), a continuación, iniciar una nueva película. Repetir unas 5 - 6 veces y guardar todas las películas </li><li> Utilice el software ImageJ para analizar las imágenes de vídeo de la transmitancia Indicador de tinte para obtener un transcurso de tiempo promedio de la transmitancia de cambio. <ol><li> Iniciar ImageJ, haga clic en &quot;Archivo&quot; y, a continuación, &#39;Open&#39;, y navegar por la película. Para cada película, dibujar un 10 píxeles de ancho vertical,rectángulo en cualquier parte de la imagen 1 st de la película. Haga clic en &quot;Imagen&quot; en el panel principal ImageJ, a continuación, haga clic en &quot;Recortar&quot; en el menú desplegable. </li><li> Para alinear los 60 cuadros (de la película 60 segundos) en una fila, haga clic de nuevo &#39;Imagen&#39;, a continuación, en forma consecutiva en los menús desplegables medida que se desarrollan: &quot;Pilas&quot; y &quot;Haz Montage &#39;(columnas 60, filas 1). Dibuje un 1 píxel alta rectángulo horizontal en cualquier lugar a lo largo de toda la fila de imágenes y haga clic en &quot;Analizar&quot; en el panel principal ImageJ, a continuación, haga clic en el perfil de parcela &#39;en el menú desplegable. NOTA: A &#39;Parcela de Montage &quot;ventana aparecerá (no se muestra), y una lista de datos de transmitancia se pueden abrir desde el menú. Cada imagen de la película está representado en esta lista por 10 valores de transmitancia originarios de su amplio rectángulo de 10 píxeles y en consecuencia la &quot;base de tiempos&quot; (el número secuencial de la imagen) es 10 veces más. </li><li> Copie las listas del dat transmitanciaa (una lista por película) a un archivo de Excel. La media de los cursos de tiempo de transmitancia obtenidos de las varias películas de los rubores Indicador Dye. Generar una base de tiempo real, multiplicando el número secuencial de la imagen en un 0,1. Guarde el curso del tiempo promedio (dos columnas) a un archivo de texto. NOTA: Antes de promedio, si se desea, trazar los cursos de tiempo individuales, de rechazar cualquier irregularidad. Asegúrese de que la película incluye al menos 5 final sec de la transmitancia en estado estacionario del indicador Dye. </li></ol></li><li> Inicie el programa de ajuste P f Fit Matlab (el panel &#39;Indicador Fit&#39;, Figura 3) para calcular los distintos parámetros de la evolución temporal de la osmolaridad. NOTA: en base a las concentraciones iniciales y finales conocidos de la solución en el baño, el curso temporal del cambio de concentración osmótica de la solución se calcula a partir de la evolución en el tiempo de concentración (calculado, a su vez, a partir de la transmitancia Indicador de tinte), suponiendo que sigue la misma dinámica que laconcentración de colorante. P f Fit es un programa disponible para su uso de forma gratuita. El &#39;PfFit_Installer_web.exe&#39; se puede descargar desde: P f Guía de compatibilidad usuario con explicaciones detalladas y definiciones es accesible a través de Jove como un archivo suplementario, lo que ayuda a familiarizar al usuario con el programa Fit P f. </li><li> En el panel &#39;Indicador Fit&#39;, importar los datos de la evolución en el tiempo promedio de la transmitancia Indicador Tinte (&#39;archivo de datos Indicador&#39;, Figura 3A) e introducir manualmente los parámetros del experimento actuales y las estimaciones iniciales de los parámetros &#39;width&#39; y &#39; t_half &#39;que describe la evolución temporal de la concentración del tinte indicador (Figura 3B. Haga clic en &quot;Ejecutar&quot; para ver las parcelas de la evolución temporal de la concentración del tinte indicador (datos reales y en forma, la figura 4A), y de la calculada baño de modelado () osmolaridad (Figura 4B). NOTA: agood ajuste a los datos es esencial (una recomendación: comenzar con los valores que se muestran en la Figura 3). </li></ol> 6. Determinación del P f utilizando el programa de ajuste de P f Fit Matlab NOTA: Además de los supuestos básicos en relación con el comportamiento de un protoplasto como un verdadero y perfecto osmómetro 11, la determinación de P f se basa en la presunción de que P f puede cambiar con el tiempo, que esta dinámica de P f subyace el tiempo curso del cambio de volumen de células y que tres parámetros son suficientes para describirlo: P fi (el valor inicial de P f), Pendiente Pf (la tasa del cambio lineal de P f) y de retardo (el periodo desde el inicio de la bañera cambio de la osmolaridad hasta el inicio del cambio de volumen celular). Diferentes modelos pueden ser probados, incluyendo diferentes combinaciones de estos parámetros y sus valores, incluyendo los valores nulos 11. P <sub&gt; f Fit busca la mejor combinación de estos parámetros para producir - mediante cálculo - la reproducción más fiel del transcurso de tiempo experimental del cambio de volumen de la celda 11, calculado, a su vez, de la serie importada de las áreas de células de contorno (véase También la &#39;P f Guía de compatibilidad usuario Suplementario). <ol><li> Cámbiese al panel &#39;Volumen Fit&#39; (Figura 5). Elija para importar el archivo de áreas de datos (el archivo de texto con el transcurso del tiempo de las &quot;áreas&quot; de los protoplastos analizados, la figura 5A). Elija &#39;Última Indicador de montaje&#39; como fuente de parámetro (Figura 5B; ver la &#39;P f Guía de ajuste del usuario de alternativas). NOTA: Estos parámetros (Figura 5D) sirven entonces para regenerar el cambio osmótico en el baño para los volúmenes procedimiento de ajuste. </li><li> En el panel de &#39;Volumen Fit&#39; (Figura 5C), inicializar (rellenar las conjeturas iniciales para los parámetros F) P: P f, Pendiente Pf y Delay (una recomendación: comenzar con 1, 1, y 30, respectivamente), eligió el modelo &#39;Clase&#39; (una recomendación: comenzar con la Segunda y la marca &#39;cheques&#39; para los tres parámetros que se instalen). Haga clic en &quot;Ejecutar&quot;, y luego calcular visualmente la cifra provisional (Figura 5E) y ajustar el parámetro de retardo y la longitud del registro, si es necesario. </li><li> Examine la gráfica resultados (Figura 6) para evaluar la calidad apta y registrar el error en forma. Cambie los parámetros de inicialización de algunas Dobla cada una, y re-&#39;Run &#39;. NOTA: No se desanime cuando el programa se atora - simplemente reinicie el programa! </li><li> Repita este procedimiento varias veces, a partir de diferentes combinaciones de parámetros de inicialización, el objetivo para el valor más bajo del error de ajuste. </li><li> Copiar la lista de los resultados de ajuste directamente desde la pantalla, o encontrarlos en tél PfFit-generó archivo &#39;_FIT_Vol_Results.txt&#39;. </li></ol>

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We have nothing to disclose.

Descrito aquí es un procedimiento sencillo y muy eficaz para medir la P f de protoplastos de plantas aisladas, aplicable en principio también a otras células esféricas, por ejemplo., Oocitos de rana 11. Este método se basa en la medición de la P f en respuesta a un desafío osmótica de la célula. En contraste con los otros métodos basados ​​en este enfoque, sin embargo, el cambio de soluciones, es decir, de la osmolaridad, no es instantánea, pero gradual, ...

La absorción de agua y el flujo a través de las membranas celulares es un requisito fundamental para la existencia de plantas, tanto en el celular y el conjunto de los niveles de la planta. A nivel celular, las acuaporinas (AQPs) juegan un papel clave en la regulación del coeficiente de permeabilidad al agua osmótica (P f) de la membrana celular 1-3. Hasta la fecha, varios métodos han sido empleados en la medición de la P f endógena de protoplastos de diferentes órganos de la planta (es decir, raíces, mesófilo, endodermis, etc., Revisado por Chaumont et al. 4). Uno de los enfoques para medir P f es exponer los protoplastos a un desafío osmótica y para monitorear la tasa inicial de su cambio de volumen (es decir., La pendiente de la fase lineal inicial de la variación de volumen). Dos métodos diferentes se han descrito anteriormente sobre la base de este enfoque, tanto basados ​​en un intercambio instantáneo de soluciones. La primera de ellas consiste en immobilizing la de protoplastos con una micropipeta de succión y cambiar el flujo de la solución 5 y el segundo de transferir la de protoplastos a partir de una solución a otra utilizando una micropipeta 6. Estos métodos de transferencia de aspiración micropipeta y micropipeta, que permiten la adquisición de imágenes en el comienzo mismo del intercambio solución rápida (para capturar la fase lineal inicial de cambio de volumen), probablemente involucre a un estrés físico de protoplastos y requieren equipo especializado y micromanipulación experto. El método aquí descrito minimiza la perturbación a las células, no implica ningún micromanipulación y permite la derivación de P f cuando el baño de perfusión no es instantánea. Después de la digestión enzimática, los protoplastos, sumergidas en una solución isotónica, se inmovilizan en la parte inferior cubreobjetos de vidrio de un plexiglás (también conocido como Lucite o plexiglás) por cámara de interacción de carga. Luego, durante un baño de perfusión constante,la solución isotónica es arrastrada por una solución hipotónica generar un desafío hipoosmótica a los protoplastos. La hinchazón de la protoplastos es de vídeo grabada y luego, mediante la combinación de la información sobre el curso temporal de la perfusión de baño y el curso temporal de la inflamación celular, la P f está determinada por el procesamiento de imágenes y los procedimientos de ajuste de curvas. Las ventajas de este método son que el experimento es muy eficiente, es decir, es posible supervisar unas pocas células simultáneamente en un único ensayo, y que no requiere equipos especiales o particulares habilidades de micromanipulación. Varias aplicaciones para este método son posibles. Por ejemplo, la determinación de la P f nativa de una variedad de células de diferentes tejidos y plantas, tales como mesófilo y el paquete células de la vaina de la hoja de Arabidopsis 7, el maíz mesófilo de la hoja o células de la corteza de la raíz 8-10 o suspensión células cultivadas 11,12. En additien adelante, es posible determinar P f de las células animales tales como células esféricas 11 ovocitos. Otro ejemplo involucra la evaluación de la actividad AQP por la expresión transitoria de su gen en los protoplastos (o cualesquiera otros genes que puedan afectarles; por ejemplo, genes de quinasas) y determinación de su contribución a P f; por ejemplo, la expresión de tomate AQP SlTIP2; 2 de Arabidopsis en protoplastos de mesófilo de transformación PEG y la determinación de la SlTIP2; P 2 relacionada con f 13. Finalmente, el examen del efecto sobre P f de diferentes moléculas / sustancias (fármacos, hormonas, etc) que se añade a las soluciones también se puede examinar, por ejemplo, del bloqueador de AQP HgCl 2 7. El siguiente protocolo describe el aislamiento de protoplastos de células y determinación de su P f Arabidopsis mesófilo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:288px;">KCl</td>
			<td style="width:140px;">Chem-Impex International</td>
			<td style="width:159px;">01247-1</td>
			<td style="width:516px;"><a href="http://www.chemimpex.com/">http://www.chemimpex.com</a> 
			Any source, anal. grade</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:288px;">CaCl2</td>
			<td style="width:140px;">Merck</td>
			<td style="width:159px;">11718006</td>
			<td><a href="http://www.merck.com/">http://www.merck.com</a> 
			Any source, anal. grade</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:288px;">2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">15152002</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com 
			Any source, anal. grade</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:288px;">D-Sorbitol</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">18032003</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com 
			Any source, anal. grade</td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:288px;">Cellulase</td>
			<td style="width:140px;">Worthington, Lakewood, NJ, USA</td>
			<td style="width:159px;">LS002603</td>
			<td><a href="http://www.worthingtonbiochem.com/">http://www.worthingtonbiochem.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:288px;">Pectolyase</td>
			<td style="width:140px;">Karlan,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Phonix, AZ, USA</td>
			<td style="width:159px;">8006</td>
			<td><a href="http://www.karlan.com/">http://www.karlan.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:288px;">Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">81420</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:288px;"><a href="https://my.labguru.com/catalog/materials/216">Bovine Serum Albumin (BSA)</a></td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">A9418-5G</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:288px;">Protamine sulphate</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P4380</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:288px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P8920</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:288px;">Xylene cyanol</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">X4126</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:288px;">Silicone vacuum grease heavy</td>
			<td style="width:140px;">Merck</td>
			<td style="width:159px;">107921</td>
			<td><a href="https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&amp;SEO_ErrorPageOccurred=true&amp;attachments=CoA">https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&#38;SEO_ErrorPageOccurred=true&#38;attachments=CoA</a></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Inverted microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100/TS100F</td>
			<td><a href="http://www.nikoninstruments.com/">http://www.nikoninstruments.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Peristaltic pump</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td style="width:159px;">EP-1 Econo&#160;Pump</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">Grayscale digital camera</td>
			<td>Scion Corporation</td>
			<td style="width:159px;">CFW-1308M</td>
			<td><a href="http://www.scioncorp.com/">http://www.scioncorp.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">CMU 1394 Camera Driver&#8217; plugin for ImageJ</td>
			<td style="width:140px;">Carnegie Mellon</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html">http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html</a> 
			Free software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ</td>
			<td style="width:140px;">NIH</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> 
			Free software</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Econo Gradient Pump Fittings Kit</td>
			<td style="width:140px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:159px;">731-9006</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Connectors, manifold</td>
			<td style="width:140px;">DirectMed</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S">http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S</a></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Burette infusion sets (columns)</td>
			<td style="width:140px;">Welford</td>
			<td style="width:159px;">IF-BR-001</td>
			<td>http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tubing</td>
			<td style="width:140px;">TYGON</td>
			<td style="width:159px;">R-3603</td>
			<td><a href="http://www.usplastic.com/">http://www.usplastic.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Plexiglass slide etc.</td>
			<td style="width:140px;">Perspectiv</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.perspectiv.co.il/index-en.html">http://www.perspectiv.co.il/index-en.html</a> 
			Our slide was custom-made, it does not appear on the web site but a copy can be remade to order as &#39;a copy of the slide already made for M. Moshelion&#39;.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">3M packaging Scotch tape 1&#39;&#39;, clear</td>
			<td style="width:140px;">Viking Industrial, UK</td>
			<td style="width:159px;">VKMONO25</td>
			<td><a href="http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8">http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8</a> 
			any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the osmotic water permeability coefficient (pf) of spherical cells: isolated plant protoplasts as an example

El estudio de los mecanismos de regulación AQP es crucial para la comprensión de las relaciones de agua, tanto en el celular y el conjunto de los niveles de la planta. Se presenta aquí un método sencillo y muy eficaz para la determinación del coeficiente de permeabilidad osmótica de agua (P f) en protoplastos de plantas, aplicable en principio también a otras células esféricas tales como oocitos de rana. El primer paso del ensayo es el aislamiento de protoplastos a partir del tejido vegetal de interés por digestión enzimática en una cámara con una solución isotónica adecuada. El segundo paso consiste en un ensayo de desafío osmótica: protoplastos inmovilizados en la parte inferior de la cámara están sometidos a una partida de perfusión constante con una solución isotónica y seguido por una solución hipotónica. La hinchazón celular es el vídeo grabado. En el tercer paso, las imágenes se procesan en línea para producir cambios de volumen, y el curso temporal de los cambios de volumen se correlaciona con la evolución en el tiempo del cambio en osmoladad del medio de perfusión cámara, usando un procedimiento de ajuste de curvas por escrito en Matlab (el &#39;PfFit&#39;), para producir P f.

Con el fin de determinar el P f y comparar la actividad de diferentes AQPs, se utilizan protoplastos de mesófilo de la hoja de Arabidopsis. Se encontró que estos protoplastos a tener bajos basal (fondo) los niveles de P f 7 y pueden servir como un sistema funcional-expresión para permitir mediciones P f reproducibles. Se aislaron protoplastos de una hoja madura de una planta Arabidopsis 6 semanas de edad y tres genes construye con genes de Arabi...

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Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Medición del coeficiente de permeabilidad al agua osmótica (P f) de las células puede ayudar a entender los mecanismos de regulación de las acuaporinas (AQPs). Determinación f P en protoplastos de células vegetales esféricas presentados aquí implica protoplastos aislamiento y análisis numérico de su tasa inicial de cambio de volumen como resultado de un desafío osmótica durante la perfusión baño constante.

Medición de la osmótica de agua Coeficiente de Permeabilidad (P<sub&gt; F</sub&gt;) De células esféricas: protoplastos de plantas aisladas como ejemplo

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

16.0K vistas.  The Hebrew University of Jerusalem.  Medición del coeficiente de permeabilidad al agua osmótica (P f) de las células puede ayudar a entender los mecanismos de regulación de las acuaporinas (AQPs). Determinación f P en protoplastos de células vegetales esféricas presentados aquí implica protoplastos aislamiento y análisis numérico de su tasa inicial de cambio de volumen como resultado de un desafío osmótica durante la perfusión baño constante. 

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Osmotic Avoidance in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function of Two Genes, Orthologues of Human NRXN1 and NLGN1, as Candidates for Autism

Neurexins and neuroligins are cell adhesion molecules present in excitatory and inhibitory synapses, and they are required for correct neuron network function1. These proteins are found at the presynaptic and postsynaptic membranes 2. Studies in mice indicate that neurexins and neurologins have an essential role in synaptic transmission 1. Recent reports have shown that altered neuronal connections during the development of the human nervous system could constitute the basis of the etiology of numerous cases of autism spectrum disorders 3.
Caenorhabditis elegans could be used as an experimental tool to facilitate the study of the functioning of synaptic components, because of its simplicity for laboratory experimentation, and given that its nervous system and synaptic wiring has been fully characterized. In C. elegans nrx-1 and nlg-1 genes are orthologous to human NRXN1 and NLGN1 genes which encode alpha-neurexin-1 and neuroligin-1 proteins, respectively. In humans and nematodes, the organization of neurexins and neuroligins is similar in respect to functional domains.
The head of the nematode contains the amphid, a sensory organ of the nematode, which mediates responses to different stimuli, including osmotic strength. The amphid is made of 12 sensory bipolar neurons with ciliated dendrites and one presynaptic terminal axon 4. Two of these neurons, named ASHR and ASHL are particularly important in osmotic sensory function, detecting water-soluble repellents with high osmotic strength 5. The dendrites of these two neurons lengthen to the tip of the mouth and the axons extend to the nerve ring, where they make synaptic connections with other neurons determining the behavioral response 6.
To evaluate the implications of neurexin and neuroligin in high osmotic strength avoidance, we show the different response of C. elegans mutants defective in nrx-1 and nlg-1 genes, using a method based on a 4M fructose ring 7. The behavioral phenotypes were confirmed using specific RNAi clones 8. In C. elegans, the dsRNA required to trigger RNAi can be administered by feeding 9. The delivery of dsRNA through food induces the RNAi interference of the gene of interest thus allowing the identification of genetic components and network pathways.

Osmotic Avoidance in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function of Two Genes, Orthologues of Human NRXN1 and NLGN1, as Candidates for Autism

Neurexins and neuroligins are membrane-neuron adhesion proteins which perform essential roles in synaptic differentiation and transmission. Neuroligin deficient mutants of C. elegans are defective in detecting osmotic strength, but when they also contain a mutation in the gene coding neurexin, they recover the wild type phenotype.

Evitar osmótica en Caenorhabditis elegans: La función sináptica de dos genes, Orthologues de los Derechos Humanos NRXN1 Y NLGN1, Como candidatos para el autismo

Neurexins and neuroligins are cell adhesion molecules present in excitatory and inhibitory synapses, and they are required for correct neuron network ...

Investigación

Biología

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Fluorescencia de células activadas por la clasificación de los protoplastos de la planta

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic three-dimensional spring made of light that is formed when a high-intensity laser beam is focused to a very small spot by a microscope's objective lens. To bend a cell, we first bind live bacteria to a chemically-treated coverslip. As these cells grow, the middle of the cells remains bound to the coverslip but the growing ends are free of this restraint. By inducing filamentous growth with the drug cephalexin, we are able to identify cells in which one end of the cell was stuck to the surface while the other end remained unattached and susceptible to bending forces. A bending force is then applied with an optical trap by binding a polylysine-coated bead to the tip of a growing cell. Both the force and the displacement of the bead are recorded and the bending stiffness of the cell is the slope of this relationship.

We present a protocol for bending filamentous bacterial cells attached to a cover-slip surface with an optical trap to measure the cellular bending stiffness.

La medición de la resistencia a la flexión de las células bacterianas usando una trampa óptica

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

La medición de la cinética de la transcripción de ARNm en las células vivas solo

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is avoided when the herbivore is able to select other plants2. Antibiosis is the degree to which the plant affects the fitness of the herbivore feeding on it1.Tolerance is the degree to which the plant can withstand or repair damage caused by the herbivore, without compromising the herbivore's growth and reproduction1. The durability of herbivore resistance in an agricultural setting depends to a great extent on the resistance mechanism favored during crop breeding efforts3.
We demonstrate a no-choice experiment designed to estimate the relative contributions of antibiosis and tolerance to spittlebug resistance in Brachiaria spp. Several species of African grasses of the genus Brachiaria are valuable forage and pasture plants in the Neotropics, but they can be severely challenged by several native species of spittlebugs (Hemiptera: Cercopidae)4.To assess their resistance to spittlebugs, plants are vegetatively-propagated by stem cuttings and allowed to grow for approximately one month, allowing the growth of superficial roots on which spittlebugs can feed. At that point, each test plant is individually challenged with six spittlebug eggs near hatching. Infestations are allowed to progress for one month before evaluating plant damage and insect survival. Scoring plant damage provides an estimate of tolerance while scoring insect survival provides an estimate of antibiosis. This protocol has facilitated our plant breeding objective to enhance spittlebug resistance in commercial brachiariagrases5.

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

This video explains mechanisms of host plant resistance to herbivory and demonstrates a no-choice test that estimates the relative contributions of antibiosis and tolerance to spittlebug resistance in Brachiaria spp.

Caracterización de los mecanismos de resistencia Herbívoro: salivazo en Brachiaria Spp. como ejemplo

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Multi-parámetro de medición de la apertura del poro de transición de permeabilidad en el corazón del ratón mitocondrias aisladas

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

La cuantificación individual Microvessel Permeabilidad en aislado de rata Blood-perfundido Preparación de pulmón

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic compartment of plant leaves is the site of several important biological processes, including cell wall formation, cellular nutrient and water uptake and export, plant-endophyte interactions and defence responses to pathogens. The infiltration-centrifugation method is well established as a robust technique for the analysis of the soluble apoplast composition of various plant species. The fluid obtained by this method is commonly known as apoplast washing fluid (AWF). The following protocol describes an optimized vacuum infiltration and centrifugation method for AWF extraction from Phaseolus vulgaris (French bean) cv. Tendergreen leaves. The limitations of this method and the optimization of the protocol for other plant species are discussed. Recovered AWF can be used in a wide range of downstream experiments that seek to characterize the composition of the apoplast and how it varies in response to plant species and genotype, plant development and environmental conditions, or to determine how microorganisms grow in apoplast fluid and respond to changes in its composition.

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

La técnica de infiltración-centrifugación para extracción de apoplástico fluido procedente de hojas de la planta Uso<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt; Como ejemplo

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

The circadian clock regulates about a third of the Arabidopsis transcriptome, but the percentage of genes that feed back into timekeeping remains unknown. Here we visualize a method to rapidly assess circadian phenotypes in any mutant line of Arabidopsis using luminescent imaging of a circadian reporter transiently expressed in protoplasts.

Análisis rápido de los fenotipos circadianos en Arabidopsis protoplastos transfectadas con un reloj luminiscentes Reportero

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants

Chloroplasts are organelles with many vital roles in plants, which include not only photosynthesis but numerous other metabolic and signaling functions. Furthermore, chloroplasts are critical for plant responses to various abiotic stresses, such as salinity and osmotic stresses. A chloroplast may contain up to ~3,000 different proteins, some of which are encoded by its own genome. However, the majority of chloroplast proteins are encoded in the nucleus and synthesized in the cytosol, and these proteins need to be imported into the chloroplast through translocons at the chloroplast envelope membranes. Recent studies have shown that the chloroplast protein import can be actively regulated by stress. To biochemically investigate such regulation of protein import under stress conditions, we developed the method described here as a quick and straightforward procedure that can easily be achieved in any laboratory. In this method, plants are grown under normal conditions and then exposed to stress conditions in liquid culture. Plant material is collected, and chloroplasts are then released by homogenization. The crude homogenate is separated by density gradient centrifugation, enabling isolation of the intact chloroplasts. Chloroplast yield is assessed by counting, and chloroplast intactness is checked under a microscope. For the protein import assays, purified chloroplasts are incubated with 35S radiolabeled in vitro translated precursor proteins, and time-course experiments are conducted to enable comparisons of import rates between genotypes under stress conditions. We present data generated using this method which show that the rate of protein import into chloroplasts from a regulatory mutant is specifically altered under osmotic stress conditions.

Here we describe a new method to study protein import into isolated chloroplasts under stress. The method is rapid and straightforward, and can be applied to study the consequences of different stress conditions for chloroplast protein import, and the corresponding regulatory mechanisms.

Análisis de la importación de proteínas en cloroplastos aislados de las plantas estresadas

Chloroplasts are organelles with many vital roles in plants, which include not only photosynthesis but numerous other metabolic and signaling functions. ...