この作品は、イスラエル科学財団エルサレム（から、FCへの研究（FNRS）C科学的ベルギー国民基金、大学間アトラクション極プログラム - ベルギー科学政策と「RecherchesConcertéesデCommunautéフランセーズデベルギー·アクション」からの補助金によってサポートされていましたMM（助成番号1311から1312）にISF）、およびNM（助成番号1312から1312）へ。

溶液の調製<ol><li>準備等張（600ミリオスモル）及び低張の10mMのKCl、1mMのCaCl 2、およびを含む（500ミリオスモル）ソリューション8 M 2（N-モルホリン） -エタンスルホン酸（MES）、pHが5.7との適切な量の浸透圧を調整するD-ソルビトール：等張および低張液440 mMのための540 mMの。浸透圧計を使用して（目標値の3％以内）の溶液の浸透圧を確認してください。 </li><li>以下の酵素を含む「酵素ミックス」の乾燥原料の準備：0.55グラムセルラーゼ、0.1グラムのペクトリアーゼ、0.33グラムのポリビニルピロリドンK 30、0.33グラムのBSA（下記表1参照）、ボルテックスにより乾燥粉末を混ぜて、5.7 mgのアリコートを作成し、 -20℃で保存する。 </li></ol>シロイヌナズナ葉肉プロトプラストの単離2。 <ol><li>等張液の約6滴（約30μlの各）でペトリ皿（11センチ）を準備します。 </li><li>ピール背軸（下）シロイヌナズナの葉の表皮、C次いで溶液に触れ、下にさらさ背軸側に降下する等張液に正方形を配置し、約4×4 mm 2で正方形にむいた葉をUT。 </li><li> 、1.5ミリリットルチューブに165μlの等張液中の酵素ミックスの5.7ミリグラム（3.3％w / wで）に溶解し、溶解するまで分程度のためにピペッティングにより穏やかに混合し、同じペトリに酵素溶液を数滴を配置し、同様の一品。 </li><li>酵素溶液が下がる上に、葉片を移し、パラフィルムの1ラウンドでふたを密封皿を閉じ、20分間インキュベート、28℃に設定した水浴中で料理をフローティング。 </li><li>皿に等張液のより数滴（各酵素液滴当たり2滴）を追加します。番目のドロップ（酵素液を洗い流す）に、順次、その後、新たな等張液滴に各リーフピースを転送します。ピンセットを用いて、その縁による作品を持ち上げ、プロトプラストを解放する（ティーバッグのような）第二のドロップでそれを振る。1.5ミリリットルチューブにプロトプラスト（切り取ら100μlのピペットチップを使用して）で滴を収集します。 </li></ol> 3低張挑戦アッセイ：シロイヌナズナ葉肉細胞膨張<ol><li>低張液と等張液と別の列と1列を充填することによって灌流システム（ 図1A）を準備します。バルブを開き、すべての方法ダウンインレットマニホールド（ 図1B）にチューブを埋めるために、いくつかの溶液流（第一低張性、そして等張性）とする。トラップされた気泡が存在しないことを確認した後、バルブを閉じます。 </li><li> （; 図1Cに、チャンバの概略図を参照してください。図1B）プレキシガラススライド内チャンバのための底を作るために、シリコングリス（ 表1）を使用して、カバースリップを密封。プロトプラスト、コート用「スティッキー」（グリースリング内カバースリップの上に向けて露出面）をチャンバ底を作ってそれまたはポリ-L-リシン（水中0.1％、 表1）、正の電荷を担持する硫酸プロタミン（ 表1水中1％）を有する。ピペットチップを用いてカバースリップの上、この「糊」を広げ、1を待つ - 2分、3すすぎ - 等張液で4回、残りの溶液を離れて振る。 </li><li>等張液でチャンバーを埋める。その後、切り取らピペットチップを用いて、チャンバに溶液を含むプロトプラストのドロップを追加し、3待つ - 落ち着くまでプロトプラスト4分。 （下の気泡をトラップ避ける）ソリューション面に触れ透明カバー（ 図1D、1E）とチャンバーカバー。 </li><li> （！チューブ内の気泡に対する保護）灌流システムおよびポンプに接続し、倒立顕微鏡台に（静かに！）スライドを配置し、1ミリリットル/分（より速い速度で一定の灌流のための等張液の流れをオンにする4ml /分）まで、使用することができる。 </li><li>記録のために体積変化は、倒立顕微鏡は、20X対物レンズとし、PCコンピュータに接続されたCCDビデオカメラで使用されている。選択された不動のプロトプラストの60秒のビデオムービーを記録するためにImageJソフトウェアの「CMU 1394カメラのドライバ &#39;プラグイン（この二つのソフトウェア片のダウンロードアドレスについて特定の材料の表を参照）を使用してください（おそらく、一番下に貼り付けたもの） 1画像/秒（1Hz）での割合で。 （灌流の開始から合計60秒を完了するために）45秒低張液に切り替え、（これはベースラインを構成している）等張液の15秒洗浄で録音を開始します。 TIF形式のムービーを保存します。注：形状が球形とその最大周長（ 図2A）で十分に焦点を当てた細胞輪郭を持つ：以下の基準を満たす、できるだけ多くの細胞を用いて視野を選択してください。 </li></ol> ImageJのを用いた細胞体積変化4。分析注：分析するには腫れセルの一連の画像は、「画像エクスプローラ」と（ザビエルDrayeによって書かれた）ImageJソフトウェア14の「プロトプラストアナライザ」プラグインを使用しています。彼らの最初の時点で選択されたプロトプラストを皮切りに、「プロトプラストアナラ​​イザ」プラグインは自動的にプロトプラストのエッジ（輪郭）を検出し、実験中にその地域の時間経過を計算します（プラグインは以下のPfFit解析プログラムで使用可能です） 。 <ol><li> ImageJのを起動します。 「インポート」し、 &#39;画像エクスプローラ」：彼らが展開としてムービーを開くには、連続して、ドロップダウンメニューに、その後、ImageJのパネル上の「ファイル」をクリックします。選択したムービーを強調表示して、それを右クリックして、「プロトプラストアナラ​​イザー」を左クリックします。実験中に大部分が不動のままプロトプラストを識別するために（プロトプラスト画像下部にあるスライダを使用して）、ムービーをブラウズ - これらが分析されます。戻る最初のIMA上GEは、マウスを使用して、その後現れた「検出パラメータ」の表に「OK」をクリックして、選択したプロトプラスト（ 図2B）の周囲（ImageJの描画ツールから採取）の円を描く。 </li><li>プロトプラスト検出アルゴリズムを起動するには、ドロップダウンメニューで、その後、プロトプラスト画像トップパネルの「プロセス」「ローカル」をクリックします。ムービー全体を通して、選択したプロトプラスト（ 図2C）の周りに緑の円を調べます。 Excelファイルの「結果」を保存します。 ImageJのを終了します。注：場合は赤い点が（悪い輪郭フィット感を示すために - 通常不良による画像コントラストに）表示され、異なるパラメータで再実行してください。 </li><li>各セルに属する系統を分離するには、（ - 2つ以上のセルを同時に分析した場合には - 分析はフレーム毎に行われるため、絡み合っされます）、Excelで、セル番号欄（「オブジェクト」で保存されたデータを並べ替える）。 </li><li> DETEへP fの真の価値を得るためのピクセル対程度の変換係数をrmine、同じ20X顕微鏡対物レンズを経由してマイクロメートル定規のイメージをスナップ。定規イメージに沿って（ImageJの描画ツールから採取）のラインをドラッグして、ImageJのメインパネルの下部にある定規の長さに相当画素数をお読みください。 Excelファイル内の任意の画素領域の値は、以下2に変換します。テキストフ​​ァイル（数値のみの2列）として（セルごとに個別に）領域の時間経過を保存します。注：これは、ボリュームフィット」PfFit &#39;プログラムに入力されます。 </li></ol> 5。ImageJのとMatlabのプログラムP Fフィットを使用した実験室内での浸透圧の変化率をモデル化<ol><li>等張液（ &#39;インジケーター色素&#39;を生成するために）100mlに2mgのキシレンシアノール（ 表1、以下）を加える。 </li><li>インジケータ色素と非染めhの（3.1のように）灌流システムを準備しますypotonicソリューション。 </li><li>カバースリップ（前プロトプラストと同様に）でそれをカバーし、顕微鏡ステージ上に置き、ゆっくりインジケーター色素で室内を満たし、プレキシガラス室の底部にシリコングリスを使用してカバースリップを密封。 </li><li>灌流システムとポンプにチャンバーを接続し、リットルml /分で一定灌流のためのインジケーター色素の流れをオンにします。 </li><li> 1Hzの速度で、60秒の動画を記録します。 45秒間の低張液に切り替えて、インジケーター色素の15秒で録画を開始します。撮影を停止します。インジケータ色素（少なくとも30秒間）と面一に、新しいムービーを開始します。 6回、すべての映画を保存する - 約5を繰り返します</li><li>変化する透過率の平均化時間経過を得るために、インジケーター色素の透過率のビデオ画像を分析するためにImageJソフトウェアを使用する。 <ol><li> ImageJのを起動し、「ファイル」、そして、「開く」をクリックして、映画のために参照します。各映画のために、10ピクセル幅の縦型を描く映画の1 番目の画像上の任意の場所を矩形。 ImageJのメインパネル上の「イメージ」をクリックし、ドロップダウンメニューで「トリミング」をクリックします。 </li><li> 「スタック」と「メイクモンタージュ」（列60、行1）：彼らが展開として一列に（60秒ムービーの）60フレームの位置を調整するには、もう一度「イメージ」をクリックしてから、ドロップダウンメニューに連続してクリックします。どこでも画像の行全体に沿って1ピクセルの高水平の矩形を描画し、ImageJのメインパネルで「分析」をクリックし、ドロップダウン·メニューで「プロットプロファイル」をクリックします。注：ウィンドウのモンタージュのプロット &#39;（図示せず）が表示され、透過率データのリストは、そのメニューから開くことができます。映画の各画像は、その10ピクセル幅の四角形、結果的に「タイムベース」に由来する10透過率の値によって、このリストで表現されている（画像連番）が10倍長い。 </li><li>透過率のdatのリストをコピーしますExcelファイルへ（動画ごとに1つのリスト）。インジケーター色素のフラッシュのいくつかの映画から得た透過率の時間のコースを平均。 0.1画像連番を乗算して実時間ベースを生成する。テキストフ​​ァイルに平均化され、時間経過（2列）を保存します。注：平均化する前に、必要に応じて、いずれかの不規則性を拒否するように、個別の経時変化をプロットします。映画はインジケーター色素の定常状態の透過率の少なくとも5最後の秒が含まれていることを確認。 </li></ol></li><li>浸透圧の時間経過のさまざまなパラメータを計算するためのMatlabのフィッティングプログラムP Fフィット（「指標フィット」のパネル、 図3）を起動します。 NOTE：浴溶液中の既知の初期および最終濃度に基づいて、解の変化、浸透濃度の時間経過は（指標色素透過率から、今度は、計算された）濃度の経時変化から算出される、ことを仮定同じダイナミクスに従う色素濃度。 P Fフィットは無料で使用できるプログラムです。 「PfFit_Installer_web.exeは&#39;からダウンロードできます。詳細な説明と定義を持つフィットユーザガイド「F P P Fフィットプログラムをユーザに理解するのに役立つ補足ファイルとしてJoveのを介してアクセス可能である。 </li><li> 「インジケータフィット」パネルで、インジケーター色素の透過率（「指標データファイル」、 図3A）の平均時間経過のデータをインポートし、手動で現在の実験パラメータおよびパラメータ&#39;width&#39;と&#39;の初期推定を挿入「インジケーター色素濃度の経時変化を記述した（ 図3B。クリック」t_halfインジケーター色素濃度（実際のデータとフィット、 図4A）の経時変化のプロットを表示するには、ファイル名を指定して実行」、およびモデル化された（計算値）浴の浸透圧（ 図4B）注：AGOODデータにフィットする（推奨： 図3に示した値で始まる）が不可欠である。 </li></ol> 6。MatlabのフィッティングプログラムP fのフィットを使用して、P fを決定 注：真と完璧な浸透圧計11とプロトプラストの挙動に関する基本的な仮定に加えて、P fの決定は、P fが P fのこのダイナミクスは、時間の根底にあることを、時間とともに変化することがあることを前提にかかっている細胞体積変化の過程と、その3つのパラメータは、それを記述するために十分である：Pの第 （P fの初期値）、スロープPfを （P fの線形変化率）とディレイ（浴の開始までの期間を細胞体積の変化開始までのオスモル濃度変化）。異なるモデルは、null値11を含む異なるこれらのパラメータの組み合わせとその値、を含む、試験することができる。 P <sub&gt;を精製して、これらのパラメータの最適な組み合わせのための適合を検索するF -計算によって-計算された細胞の体積変化11の実験的な時間経過の最も忠実な再現を、今度は、セルの輪郭領域のインポートシリーズから（参照また補足「P fのフィットユーザガイド」）。 <ol><li> 「ボリュームフィット」パネル（ 図5）に切り替えます。インポート用のエリア·データ·ファイル（分析されたプロトプラスト、 図5Aの「地域」の時間経過したテキストファイル）を選択します。パラメータ·ソースとして「最後のインジケータフィッティング」を選択してください（ 図5B;代替案のための「P fのフィットユーザーガイド」を参照してください）。注：これらのパラメータ（ 図5D）は 、手順を適合ボリューム用浴中の浸透圧の変化を再生するために使用される。 </li><li> 「ボリュームフィット」パネル（ 図5（c））では、（初期化P fは 、スロープPfのディレイ（推奨：）P fのパラメータに対する初期推定を埋めるIIで開始し、マーク：それぞれ、1で始まる1、および30）、 &#39;クラス&#39;（推薦モデルを選んだ嵌合する3つのパラメータすべて）のための「チェックする」。 「ファイル名を指定して実行」をクリックし、暫定的な図形（ 図5E）を眼球、必要に応じて、Delayパラメータとレコードの長さを調整します。 </li><li>適合品質を評価し、フィット感のエラーを記録するために、結果のグラフ（ 図6）調べます。いくつかは、それぞれ倍の初期化パラメータを変更し、「-&#39;Runを再。注：プログラムが動かなくなったときにがっかりしてはいけない - ちょうどプログラムを再起動！ </li><li>フィット誤差の最小値を目指して、初期化パラメータの異なる組み合わせを皮切りに、この手順を数回繰り返します。 </li><li>画面から直接フィット結果のリストをコピーし、またはTでそれらを見つける彼は「_FIT_Vol_Results.txt &#39;ファイルを生成されたPfFit。 </li></ol>

<ol>
	<li>Tyerman, S. D., Niemietz, C. M., Bramley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+aquaporins:+multifunctional+water+and+solute+channels+with+expanding+roles.">Plant aquaporins: multifunctional water and solute channels with expanding roles.</a> Plant Cell Environ. 25, 173-194 (2002).</li><li>Maurel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+aquaporins:+Novel+functions+and+regulation+properties.">Plant aquaporins: Novel functions and regulation properties.</a> Febs Letters. 581, 2227 (2007).</li><li>Maurel, C., Verdoucq, L., Luu, D. T., Santoni, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+aquaporins:+Membrane+channels+with+multiple+integrated+functions.">Plant aquaporins: Membrane channels with multiple integrated functions.</a> Annual Review of Plant Biology. 59, 595 (2008).</li><li>Chaumont, F., Moshelion, M., Daniels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+plant+aquaporin+activity.">Regulation of plant aquaporin activity.</a> Biology Of The Cell. 97, 749-764 (2005).</li><li>Ramahaleo, T., Morillon, R., Alexandre, J., Lassalles, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmotic+water+permeability+of+isolated+protoplasts.+Modifications+during+development.">Osmotic water permeability of isolated protoplasts. Modifications during development.</a> Plant Physiology. 119, 885-896 (1999).</li><li>Suga, S., Murai, M., Kuwagata, T., Maeshima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+aquaporin+levels+among+cell+types+of+radish+and+measurement+of+osmotic+water+permeability+of+individual+protoplasts.">Differences in aquaporin levels among cell types of radish and measurement of osmotic water permeability of individual protoplasts.</a> Plant Cell Physiol. 44, 277-286 (2003).</li><li>Shatil-Cohen, A., Attia, Z., Moshelion, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bundle-sheath+cell+regulation+of+xylem-mesophyll+water+transport+via+aquaporins+under+drought+stress:+a+target+of+xylem-borne+ABA?.">Bundle-sheath cell regulation of xylem-mesophyll water transport via aquaporins under drought stress: a target of xylem-borne ABA?.</a> The Plant Journal. 67, 72-80 (2011).</li><li>Hachez, C., Moshelion, M., Zelazny, E., Cavez, D., Chaumont, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+and+quantification+of+plasma+membrane+aquaporin+expression+in+maize+primary+root:+A+clue+to+understanding+their+role+as+cellular+plumbers.">Localization and quantification of plasma membrane aquaporin expression in maize primary root: A clue to understanding their role as cellular plumbers.</a> Plant Molecular Biology. 62, 305-323 (2006).</li><li>Hachez, C., Heinen, R. B., Draye, X., Chaumont, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+pattern+of+plasma+membrane+aquaporins+in+maize+leaf+highlights+their+role+in+hydraulic+regulation.">The expression pattern of plasma membrane aquaporins in maize leaf highlights their role in hydraulic regulation.</a> Plant Molecular Biology. 68, 337-353 (2008).</li><li>Besserer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+regulation+of+maize+plasma+membrane+aquaporin+trafficking+and+activity+by+the+SNARE+SYP121.">Selective regulation of maize plasma membrane aquaporin trafficking and activity by the SNARE SYP121.</a> The Plant Cell. 24, 3463-3481 (2012).</li><li>Moshelion, M., Moran, N., Chaumont, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+the+osmotic+water+permeability+of+protoplast+plasma+membrane.">Dynamic changes in the osmotic water permeability of protoplast plasma membrane.</a> Plant Physiology. 135, 2301-2317 (2004).</li><li>Moshelion, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+water+permeability+and+aquaporin+expression+increase+during+growth+of+maize+suspension+cultured+cells.">Membrane water permeability and aquaporin expression increase during growth of maize suspension cultured cells.</a> Plant, Cell &amp; Environment. 32, 1334-1345 (2009).</li><li>Sade, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+plant+stress+tolerance+and+yield+production:+is+the+tonoplast+aquaporin+SlTIP2;2+a+key+to+isohydric+to+anisohydric+conversion?.">Improving plant stress tolerance and yield production: is the tonoplast aquaporin SlTIP2;2 a key to isohydric to anisohydric conversion?.</a> New Phytologist. 181, 651-661 (2009).</li><li>Volkov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+permeability+differs+between+growing+and+non-growing+barley+leaf+tissues.">Water permeability differs between growing and non-growing barley leaf tissues.</a> J. Exp. Bot. 58, 377 (2007).</li><li>Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+transient+transformation+in+tobacco+protoplasts+is+independent+of+plasmid+amount.">Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount.</a> Plant Cell Reports. 21, 865-871 (2003).</li><li>Hosy, E., Duby, G., V&#233;ry, A. A., Costa, A., Sentenac, H., Thibaud, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+localisation+and+electrophysiological+characterisation+of+ion+channels+heterologously+expressed+in+a+plant+context.">A procedure for localisation and electrophysiological characterisation of ion channels heterologously expressed in a plant context.</a> Plant Methods. 19, (2005).</li><li>Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Recombinant+Type+I+Collagen+Produced+in+Plants.">Human Recombinant Type I Collagen Produced in Plants.</a> Tissue Eng Part A. 19, 1527-1533 (2013).</li></ol>

We have nothing to disclose.

ここで説明すると、他の球状の細胞にも原理的に適用可能な単離された植物プロトプラストのP fを 、 例えば 、カエル卵母細胞11を測定するための簡単かつ非常に効率的な手順です。この方法は、細胞への浸透性投与に応答して、P fは測定することに基づいている。このアプローチに基づく他の方法とは対照的に、しかし、浸透圧モル濃度の溶液の変化、 す...

水の取り込みと細胞膜を横切って流れるが、細胞および全植物の両方のレベルでの植物の存在の基本的な要件です。細胞レベルでは、アクアポリン（AQPs）は、細胞膜1-3の浸透水透過係数（P fの ）の調節において重要な役割を果たす。 現在までに、いくつかの方法は、異なる植物器官からのプロトプラストのfを内因Pを測定するために採用されている（ すなわち 、根、葉、内皮、 等 、ショーモンらによって概説4）。 P fを測定するためのアプローチの一つは、浸透チャレンジにプロトプラストを露出させるために、その体積変化（ すなわち 、体積変化の初期の線形位相の傾き）の初期速度を監視することである。二つの異なる方法が以前に両方の溶液の瞬間的な交換に基づいて、このアプローチに基づいて説明した。最初のものはimmobilizで構成されてい吸引マイクロピペットでプロトプラストをると溶液流5とマイクロピペット6を使用して別の溶液からプロトプラストを転送する第1の切り替え。高速の溶液交換の非常に開始時の画像取得を可能にするこれらのマイクロピペット吸引マイクロピペットの転送方法は、可能性が高いプロトプラストへの物理的なストレスを伴う、（体積変化の早い直線位相を捕捉する）と、特殊な装置や専門家のマイクロマニピュレーションを必要とします。 ここで説明する方法はマイクロマニピュレーションを伴わない浴潅流が瞬間的でない場合、P fの導出を可能にし、細胞への障害を最小限に抑えることができます。 酵素消化の後、等張液に沈めプロトプラストは、電荷相互作用によってプレキシガラス（別名ルーサイトまたはパースペックス）チャンバーのカバースリップガラスの底に固定化される。その後、一定の入浴灌流の間に、等張液をプロトプラストに低浸透圧の挑戦を生成する低張液によって洗い流されている。プロトプラストの膨潤は、映像を記録した後、浴灌流の時間経過および細胞膨潤の時間経過に関する情報を組み合わせることにより、P fは画像処理及び曲線適合手順によって決定される。 この方法の利点は、実験は非常に効率的であること、それが単一のアッセイにおいて同時に少数の細胞を監視することが可能であり、それは特別な機器や特定のマイクロマニピュレーション技術を必要としないこと、すなわち 。この方法のためのいくつかの応用が可能である。例えば、このような葉肉などの異なる組織や植物由来の細胞のさまざまなネイティブのP fの決定とシロイヌナズナの葉7、トウモロコシの葉の葉肉や根皮質細胞8-10または懸濁液培養細胞11,12から鞘細胞をバンドル。 additiでに、そのような卵母細胞11のような球状の動物細胞のP fはを決定することが可能である。 P fに貢献すると決意;もう一つの例は、プロトプラスト（ 例えば 、キナーゼの遺伝子またはいずれかの他の遺伝子に影響を与える場合があります）でのそれらの遺伝子の一過性発現によりAQP活動の検討を必要とする。例えば、トマトAQP SlTIP2の発現; PEG変換と決定SlTIP2によるシロイヌナズナ葉肉プロトプラストにおける2; 2関連P 13 F。最後に、溶液に添加異なる分子/物質（薬物、ホルモンなど）のfを Pに対する効果の検討もAQPブロッカーのHgCl 2 7の例について、調べることができる。 以下のプロトコルは、シロイヌナズナの葉肉細胞とそれらのP fの決定のプロトプラストの単離を記載している。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:288px;">KCl</td>
			<td style="width:140px;">Chem-Impex International</td>
			<td style="width:159px;">01247-1</td>
			<td style="width:516px;"><a href="http://www.chemimpex.com/">http://www.chemimpex.com</a> 
			Any source, anal. grade</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:288px;">CaCl2</td>
			<td style="width:140px;">Merck</td>
			<td style="width:159px;">11718006</td>
			<td><a href="http://www.merck.com/">http://www.merck.com</a> 
			Any source, anal. grade</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:288px;">2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">15152002</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com 
			Any source, anal. grade</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:288px;">D-Sorbitol</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">18032003</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com 
			Any source, anal. grade</td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:288px;">Cellulase</td>
			<td style="width:140px;">Worthington, Lakewood, NJ, USA</td>
			<td style="width:159px;">LS002603</td>
			<td><a href="http://www.worthingtonbiochem.com/">http://www.worthingtonbiochem.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:288px;">Pectolyase</td>
			<td style="width:140px;">Karlan,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Phonix, AZ, USA</td>
			<td style="width:159px;">8006</td>
			<td><a href="http://www.karlan.com/">http://www.karlan.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:288px;">Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">81420</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:288px;"><a href="https://my.labguru.com/catalog/materials/216">Bovine Serum Albumin (BSA)</a></td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">A9418-5G</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:288px;">Protamine sulphate</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P4380</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:288px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P8920</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:288px;">Xylene cyanol</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">X4126</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:288px;">Silicone vacuum grease heavy</td>
			<td style="width:140px;">Merck</td>
			<td style="width:159px;">107921</td>
			<td><a href="https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&amp;SEO_ErrorPageOccurred=true&amp;attachments=CoA">https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&#38;SEO_ErrorPageOccurred=true&#38;attachments=CoA</a></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Inverted microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100/TS100F</td>
			<td><a href="http://www.nikoninstruments.com/">http://www.nikoninstruments.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Peristaltic pump</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td style="width:159px;">EP-1 Econo&#160;Pump</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">Grayscale digital camera</td>
			<td>Scion Corporation</td>
			<td style="width:159px;">CFW-1308M</td>
			<td><a href="http://www.scioncorp.com/">http://www.scioncorp.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">CMU 1394 Camera Driver&#8217; plugin for ImageJ</td>
			<td style="width:140px;">Carnegie Mellon</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html">http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html</a> 
			Free software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ</td>
			<td style="width:140px;">NIH</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> 
			Free software</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Econo Gradient Pump Fittings Kit</td>
			<td style="width:140px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:159px;">731-9006</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Connectors, manifold</td>
			<td style="width:140px;">DirectMed</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S">http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S</a></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Burette infusion sets (columns)</td>
			<td style="width:140px;">Welford</td>
			<td style="width:159px;">IF-BR-001</td>
			<td>http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tubing</td>
			<td style="width:140px;">TYGON</td>
			<td style="width:159px;">R-3603</td>
			<td><a href="http://www.usplastic.com/">http://www.usplastic.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Plexiglass slide etc.</td>
			<td style="width:140px;">Perspectiv</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.perspectiv.co.il/index-en.html">http://www.perspectiv.co.il/index-en.html</a> 
			Our slide was custom-made, it does not appear on the web site but a copy can be remade to order as &#39;a copy of the slide already made for M. Moshelion&#39;.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">3M packaging Scotch tape 1&#39;&#39;, clear</td>
			<td style="width:140px;">Viking Industrial, UK</td>
			<td style="width:159px;">VKMONO25</td>
			<td><a href="http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8">http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8</a> 
			any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the osmotic water permeability coefficient (pf) of spherical cells: isolated plant protoplasts as an example

AQP調節機構を研究することは、細胞および全植物の両方のレベルでの水関係の理解のために重要である。ここで紹介するようなカエル卵母細胞などの他の球状の細胞にも原理的に適用可能な植物プロトプラストにおける浸透水透過係数（P fを ）決定するための簡単かつ非常に効率的な方法です。アッセイの最初のステップは、適切な等張液と室内への酵素的消化により関心対象の植物組織からのプロトプラストの単離である。第二段階は、浸透圧の挑戦アッセイで構成されています。室の底に固定化されたプロトプラストは、等張液で始まる定数灌流に提出し、低張液が続いている。細胞膨張は、ビデオ記録される。第三のステップでは、画像は体積変化を得るために、オフライン処理され、体積変化の時間経過をosmola変化の時間経過と相関しているチャンバ灌流培地のrity、P fで得た、Matlabの（ &#39;PfFit&#39;）で記述された曲線当てはめ手順を使用する。

P fで決定し、異なるAQPsの活性を比較するために、シロイヌナズナの葉からの葉肉プロトプラストが用いられる。これらのプロトプラストは、低い基底（背景）P fはレベル 7を有することが見出されたかつ再現P fの測定を可能にするために機能的な発現系として働くことができる。 6週齢のシロイヌナズナ植物からの成熟葉からプロトプラ...

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Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

細胞の浸透水透過係数（P fは ）測定することは、アクアポリンの調節機構（AQPs）を理解するのに役立ちます。ここに提示球状植物細胞プロトプラストにおけるP fの決定は、プロトプラストの単離および一定の浴潅流の間の浸透圧のチャレンジの結果としての体積変化のそれらの初期速度の数値解析を伴う。

浸透水透過係数（Pの測定<sub&gt; F</sub&gt;）球状細胞の：例として単離された植物プロトプラスト

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

measuring-osmotic-water-permeability-coefficient-pf-spherical-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

16.0K ビュー.  The Hebrew University of Jerusalem. 細胞の浸透水透過係数（P fは ）測定することは、アクアポリンの調節機構（AQPs）を理解するのに役立ちます。ここに提示球状植物細胞プロトプラストにおけるP fの決定は、プロトプラストの単離および一定の浴潅流の間の浸透圧のチャレンジの結果としての体積変化のそれらの初期速度の数値解析を伴う。 

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Osmotic Avoidance in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function of Two Genes, Orthologues of Human NRXN1 and NLGN1, as Candidates for Autism

Neurexins and neuroligins are cell adhesion molecules present in excitatory and inhibitory synapses, and they are required for correct neuron network function1. These proteins are found at the presynaptic and postsynaptic membranes 2. Studies in mice indicate that neurexins and neurologins have an essential role in synaptic transmission 1. Recent reports have shown that altered neuronal connections during the development of the human nervous system could constitute the basis of the etiology of numerous cases of autism spectrum disorders 3.
Caenorhabditis elegans could be used as an experimental tool to facilitate the study of the functioning of synaptic components, because of its simplicity for laboratory experimentation, and given that its nervous system and synaptic wiring has been fully characterized. In C. elegans nrx-1 and nlg-1 genes are orthologous to human NRXN1 and NLGN1 genes which encode alpha-neurexin-1 and neuroligin-1 proteins, respectively. In humans and nematodes, the organization of neurexins and neuroligins is similar in respect to functional domains.
The head of the nematode contains the amphid, a sensory organ of the nematode, which mediates responses to different stimuli, including osmotic strength. The amphid is made of 12 sensory bipolar neurons with ciliated dendrites and one presynaptic terminal axon 4. Two of these neurons, named ASHR and ASHL are particularly important in osmotic sensory function, detecting water-soluble repellents with high osmotic strength 5. The dendrites of these two neurons lengthen to the tip of the mouth and the axons extend to the nerve ring, where they make synaptic connections with other neurons determining the behavioral response 6.
To evaluate the implications of neurexin and neuroligin in high osmotic strength avoidance, we show the different response of C. elegans mutants defective in nrx-1 and nlg-1 genes, using a method based on a 4M fructose ring 7. The behavioral phenotypes were confirmed using specific RNAi clones 8. In C. elegans, the dsRNA required to trigger RNAi can be administered by feeding 9. The delivery of dsRNA through food induces the RNAi interference of the gene of interest thus allowing the identification of genetic components and network pathways.

Osmotic Avoidance in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function of Two Genes, Orthologues of Human NRXN1 and NLGN1, as Candidates for Autism

Neurexins and neuroligins are membrane-neuron adhesion proteins which perform essential roles in synaptic differentiation and transmission. Neuroligin deficient mutants of C. elegans are defective in detecting osmotic strength, but when they also contain a mutation in the gene coding neurexin, they recover the wild type phenotype.

の浸透圧の回避線虫（Caenorhabditis elegans）：二つの遺伝子のシナプス機能、ヒトのオルソログ NRXN1と NLGN1</em自閉症の候補として>、

Neurexins and neuroligins are cell adhesion molecules present in excitatory and inhibitory synapses, and they are required for correct neuron network ...

生物学

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

植物プロトプラストの蛍光活性化細胞選別

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic three-dimensional spring made of light that is formed when a high-intensity laser beam is focused to a very small spot by a microscope's objective lens. To bend a cell, we first bind live bacteria to a chemically-treated coverslip. As these cells grow, the middle of the cells remains bound to the coverslip but the growing ends are free of this restraint. By inducing filamentous growth with the drug cephalexin, we are able to identify cells in which one end of the cell was stuck to the surface while the other end remained unattached and susceptible to bending forces. A bending force is then applied with an optical trap by binding a polylysine-coated bead to the tip of a growing cell. Both the force and the displacement of the bead are recorded and the bending stiffness of the cell is the slope of this relationship.

We present a protocol for bending filamentous bacterial cells attached to a cover-slip surface with an optical trap to measure the cellular bending stiffness.

光トラップを用いた細菌細胞の曲げ剛性の測定

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

単一生細胞におけるmRNAの転写の動態を測定

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is avoided when the herbivore is able to select other plants2. Antibiosis is the degree to which the plant affects the fitness of the herbivore feeding on it1.Tolerance is the degree to which the plant can withstand or repair damage caused by the herbivore, without compromising the herbivore's growth and reproduction1. The durability of herbivore resistance in an agricultural setting depends to a great extent on the resistance mechanism favored during crop breeding efforts3.
We demonstrate a no-choice experiment designed to estimate the relative contributions of antibiosis and tolerance to spittlebug resistance in Brachiaria spp. Several species of African grasses of the genus Brachiaria are valuable forage and pasture plants in the Neotropics, but they can be severely challenged by several native species of spittlebugs (Hemiptera: Cercopidae)4.To assess their resistance to spittlebugs, plants are vegetatively-propagated by stem cuttings and allowed to grow for approximately one month, allowing the growth of superficial roots on which spittlebugs can feed. At that point, each test plant is individually challenged with six spittlebug eggs near hatching. Infestations are allowed to progress for one month before evaluating plant damage and insect survival. Scoring plant damage provides an estimate of tolerance while scoring insect survival provides an estimate of antibiosis. This protocol has facilitated our plant breeding objective to enhance spittlebug resistance in commercial brachiariagrases5.

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

This video explains mechanisms of host plant resistance to herbivory and demonstrates a no-choice test that estimates the relative contributions of antibiosis and tolerance to spittlebug resistance in Brachiaria spp.

特徴付ける草食動物の耐性機構：上Spittlebugs Brachiaria属。例として

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

単離ミトコンドリアマウス心臓における透水性遷移孔の開口部のマルチパラメータ測定

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

単離された血液灌流ラットの肺の準備にシングル微小血管透過性を定量化する

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic compartment of plant leaves is the site of several important biological processes, including cell wall formation, cellular nutrient and water uptake and export, plant-endophyte interactions and defence responses to pathogens. The infiltration-centrifugation method is well established as a robust technique for the analysis of the soluble apoplast composition of various plant species. The fluid obtained by this method is commonly known as apoplast washing fluid (AWF). The following protocol describes an optimized vacuum infiltration and centrifugation method for AWF extraction from Phaseolus vulgaris (French bean) cv. Tendergreen leaves. The limitations of this method and the optimization of the protocol for other plant species are discussed. Recovered AWF can be used in a wide range of downstream experiments that seek to characterize the composition of the apoplast and how it varies in response to plant species and genotype, plant development and environmental conditions, or to determine how microorganisms grow in apoplast fluid and respond to changes in its composition.

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

植物の葉からのアポプラスト液の抽出のための浸透·遠心分離技術の使用<em&gt;インゲンマメ</em&gt;例として

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

The circadian clock regulates about a third of the Arabidopsis transcriptome, but the percentage of genes that feed back into timekeeping remains unknown. Here we visualize a method to rapidly assess circadian phenotypes in any mutant line of Arabidopsis using luminescent imaging of a circadian reporter transiently expressed in protoplasts.

発光時計レポーターとシロイヌナズナプロトプラストトランスフェにおける概日表現型の迅速分析

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants

Chloroplasts are organelles with many vital roles in plants, which include not only photosynthesis but numerous other metabolic and signaling functions. Furthermore, chloroplasts are critical for plant responses to various abiotic stresses, such as salinity and osmotic stresses. A chloroplast may contain up to ~3,000 different proteins, some of which are encoded by its own genome. However, the majority of chloroplast proteins are encoded in the nucleus and synthesized in the cytosol, and these proteins need to be imported into the chloroplast through translocons at the chloroplast envelope membranes. Recent studies have shown that the chloroplast protein import can be actively regulated by stress. To biochemically investigate such regulation of protein import under stress conditions, we developed the method described here as a quick and straightforward procedure that can easily be achieved in any laboratory. In this method, plants are grown under normal conditions and then exposed to stress conditions in liquid culture. Plant material is collected, and chloroplasts are then released by homogenization. The crude homogenate is separated by density gradient centrifugation, enabling isolation of the intact chloroplasts. Chloroplast yield is assessed by counting, and chloroplast intactness is checked under a microscope. For the protein import assays, purified chloroplasts are incubated with 35S radiolabeled in vitro translated precursor proteins, and time-course experiments are conducted to enable comparisons of import rates between genotypes under stress conditions. We present data generated using this method which show that the rate of protein import into chloroplasts from a regulatory mutant is specifically altered under osmotic stress conditions.

Here we describe a new method to study protein import into isolated chloroplasts under stress. The method is rapid and straightforward, and can be applied to study the consequences of different stress conditions for chloroplast protein import, and the corresponding regulatory mechanisms.

ストレス植物から単離された葉緑体へのタンパク質のインポートの分析

Chloroplasts are organelles with many vital roles in plants, which include not only photosynthesis but numerous other metabolic and signaling functions. ...