The authors thank Dr. Amir Rattner for helpful comments on the manuscript. Supported by the Howard Hughes Medical Institute.

Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen in der Bedienungsanleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Alle Tiere wurden nach anerkannten institutionellen Tierpflege und Verwendung Ausschuss (IACUC)-Protokoll MO11M29 der Johns Hopkins Medical Institutions abgewickelt. Fragen Sie Ihren örtlichen Richtlinien Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss für genehmigte Methoden der Euthanasie. Tragen Sie Handschuhe, Kittel und Schutzbrille beim Umgang mit Aldehyd-Fixiermittel oder organischen Lösungsmitteln. 1. Herstellung von Materialien <ol><li> Gießen SYLGARD Platten <ol><li> Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, mischen die Härter mit der Basis, und rühren Sie mit einem Kunststoffstab. </li><li> Pipette ~ 35 ml Flüssigkeit pro Sylgard Durchmesser von 10 cm Gewebekulturschale. Zellkulturschalen sind tiefer als die Standard-Bakterien Gerichte; Diese bietet vertikale Freiraum für die Insekten-Pins. </li><li> Legen Sie die dishes auf einer horizontalen Fläche bei Raumtemperatur über Nacht. Bubbles während des Misch gebildet wird verschwinden. </li><li> Nach der Polymerisation Sylgard speichern die Platten bei Raumtemperatur. HINWEIS: Sylgard Platten bei Raumtemperatur Jahren mehrfach gespeichert werden und wiederverwendet werden, bis die Sylgard von der Platte löst. </li></ol></li><li> Lösungen <ol><li> Benzylbenzoat und Benzylalkohol (BBBA). Mix 2 Bände Benzylbenzoat und 1 Volumen Benzylalkohol. Shop in der Dunkelheit in einer Glasflasche mit einem Glasstopfen oder Teflon Spitze. ACHTUNG: Gebrauchte BBBA sollten entsprechend als organisches Lösungsmittel Abfall behandelt werden. Nicht BBBA Kunststoff kontaktieren. </li><li> Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). In 4 g PFA bis 80 ml Wasser, 0,1 ml 1 N NaOH, rühren auf einer heißen Platte bei ~ 70 ° C für ca. 5 min, bis das PFA vollständig gelöst ist, und fügen Sie 10 ml 10x PBS und bringen das Volumen auf 100 ml mit Wasser. ACHTUNG: Das Einatmen von Formaldehyd / PFA und BBBA Dämpfe solltenindem sie diese Lösungen in abgedeckten Behältern minimiert. Formaldehyd / PFA ist krebserregend. </li><li> Oil Red O Bereiten Sie eine 0,5% Lager in Isopropanol. Unmittelbar vor der Verwendung mit Wasser verdünnt, um eine Endkonzentration von 0,3% Oil Red O, und dann durch einen 0,2 &amp;mgr; m Filter. </li></ol></li></ol> 2. Haut-Dissection, Fixierung und Clearing <ol><li> Rückenhaut für Immunfärbung und Melanin Imaging <ol><li> Bei sehr jungen Mäusen (zB Föten und postnatalen Tag (P) 0-P3 Jungtiere), einschläfern die Mäuse durch Isofluran-Inhalation. Euthanize älteren Mäusen durch Isofluran-Inhalation oder durch Ketamin / Xylazin Injektion, gefolgt von Genickbruch. </li><li> Entfernen Sie die Haare mit einem elektrischen Rasierer und Haarentfernung Gel. Bei Mäusen, die jünger als P8, kann dieser Schritt übersprungen werden. </li><li> Verwenden einer Rasierklinge, um einen horizontalen Schnitt von der Basis des Schwanzes entlang jeder Flanke machen, vorbei an der dorsalen Seite der Basis jedes Schenkels ausgehend seitlich zu den Ohren und am Endeten an der Nase. </li><li> Schale sanft die Haut von dem darunterliegenden Gewebe ausgehend von dorsal, indem die Haut zwischen behandschuhten Finger, so dass es nicht durch die Zange eingeklemmt ventral. Beim Schälen der Haut auf der Höhe der Ohren, zuerst schneiden Sie die Ohren mit einer Schere und fahren Sie besonders langsam, wie die Haut an dieser Stelle reißen. </li><li> Von diesem Punkt an, richten Sie die Haut mit der Innenseite nach oben. Pin der Haut Sylgard mit ~ 20 Insektenstifte gleichmäßig um den Umfang angeordnet sind; nicht überdehnen die Haut (Abbildung 2B). Decken Sie die Haut mit 10-20 ml PBS. </li><li> Präparieren Sie die Haut weg-assoziierten Fett-und Bindegewebe mit abgewinkelten oder gebogenen Pinzette mit dem spitzen Ende der Zange ist horizontal ausgerichtet, um das Risiko, dass die Zange wird die Haut durchdringen zu minimieren. Extrudieren Sie alle Luftblasen, die unter der Haut, die durch einen sanften Wattestäbchen über die Hautoberfläche eingefangen worden sind. HINWEIS: Wenn die Haut gehtfür Flachmontage Immunfärbung oder Histochemie verwendet werden, entfernen Sie so viel des Bindegewebes wie möglich; wenn die Haut wird verwendet, um die Haarfollikel auf der Grundlage Melaninpigmentierung visualisieren, weniger vollständige Entfernung von Bindegewebe zufriedenstellend. Pränatale Haut benötigt minimal &quot;Reinigung&quot; von adhärenten Bindegewebe. </li><li> Befestigen Sie das merken Haut durch Zugabe von 20 ml frisch zubereiteten 4% PFA / PBS oder 10% Formalin pro 10 cm Sylgard Platte oder 20 ml frisch zubereitet (wenn die Haut Melanin für Bildgebung oder alkalische Phosphatase (AP) Histochemie verwendet werden) 2% PFA / PBS (wenn die Haut für die Immunfärbung oder Visualisierung von transgenen Keratin (KRT) 17-GFP-11 verwendet werden), und sanft drehen über Nacht in einem kalten Raum. Am nächsten Tag, waschen in PBS für&gt; 10 min. HINWEIS: Standard Formalin 37% Formaldehyd; Daher ist &quot;10% Formalin&quot; 3,7% Formaldehyd. </li><li> Für AP-Färbung und Immunfärbung, weiterhin in Abschnitt 3. Für Melanin imagtion, trocknen die Haut durch eine abgestufte Ethanolreihe (70%, 95%, 100%), ein Tag für jeden Schritt unter leichtem horizontale Dreh bei Raumtemperatur. Rückstände von Bindegewebe. </li><li> Mit der Haut in 100% Ethanol, entfernen Sie die Insekten Stifte und, wenn gewünscht, schneiden Sie die Haut mit einer Schere, um die meisten Peripherie 1-2 mm der Haut mit dem Stiftlöcher zu entfernen. </li><li> Übertragen Sie die Haut mit einem Durchmesser von 10 cm Glasschale, legen zwei Glasobjektträger auf der Haut, um sie vom Eisstockschießen zu verhindern, und 20 ml BBBA. BBBA schnell härtet Gewebe so ist es wichtig für die Haut, unter dem Gewicht der Glasobjektträger vor der Zugabe des BBBA abgeflacht werden. </li><li> In den nächsten Stunden, heben die Folien von der Haut für ein paar Sekunden, bis die BBBA über die Haut zu waschen. HINWEIS: Tragen Sie Handschuhe, wenn Sie mit BBBA. Je nach Alter und Lage der Haut kann es so viel wie 30% Schrumpfung in BBBA sein. </li></ol></li><li> Fuß-Haut für die Analyse der Haarfollikel Patterning HINWEIS: Das Altersspektrum ist in der Regel untersucht P1-P8. <ol><li> Nach Euthanasie, schneiden Sie die Füße über dem Sprunggelenk und einen einzigen geraden Schnitt entlang der Bauchseite durch die Sohlen der Füße. </li><li> Schälen Sie die Haut von der darunter liegenden Gewebe, Vorgehen in einer von proximal nach distal. </li><li> Schneiden Sie die Ziffern, um die Haut zu lösen und stecken Sie es mit der Innenfläche nach oben zeigt (Abbildung 2C) SYLGARD. Es ist minimal Bindegewebe der Haut auf dem Fuß. </li><li> Transgene KRT17-GFP Haut ist nun bereit für die Bildgebung. Für Melanin Bildgebung weiter mit Fixierung, Entwässerung und BBBA Clearing, wie in Abschnitt 2.1 beschrieben. </li></ol></li><li> Fuß-Haut für Visualisierung Talgdrüsen <ol><li> Nach Euthanasie, entfernen die Haare durch Reiben Haarentferner Gel über die Hautoberfläche mit einem behandschuhten Finger und Daumen; 10 Minuten warten. HINWEIS: Verwenden Sie keinen elektrischen Rasierer, der die zarte Fußhaut beschädigt. </li><li> WAsche die Hautoberfläche mit Leitungswasser, sezieren und stecken die Haut Sylgard wie in Abschnitt 2.2 beschrieben. </li><li> Fix mit 1% PFA / PBS für 30 min bei Raumtemperatur und dann in PBS waschen. HINWEIS: Für die Visualisierung Talgdrüsen an den Füßen, die nach der ersten Lebenswoche zu entwickeln, die optimale Zeit für die Analyse mit Oil Red O P21, weil dies markiert den Tiefpunkt der Haarpigmentierung bei der ersten Haarzyklus 12, und daher werden die Talgdrüsen können leichter gesehen werden. Mit Albino-Mäusen konnte diese Analyse in jedem Alter durchgeführt werden. Um Albino Nachkommen Quer pigmentierte mutierten Mäusen zu einer Tyrosinasemutante Linie wie C57BL/6J-Tyr c-2J erhalten. </li></ol></li><li> Schwanz Hautvorbereitung zur Analyse von Melanin Distribution, Haarfollikel Orientierung und Talgdrüse Visualisierung <ol><li> Nach Euthanasie, einen Rundschnitt um die Basis des Schwanzes, und dann einen Längsschlitz, die die Länge des Schwanzes entlang ihrer Bauchseite läuft. </li> &lt;li&gt; Ziehen Sie die Schwanzhaut ab an der Spitze an, indem Sie die Spitze der Schwanz Knochen und / oder Bindegewebe mit einer Pinzette und die Haut mit einer zweiten Pinzette. Pin den Schwanz Haut Sylgard. </li><li> Für die Analyse der Melaninverteilung und Haarfollikel Orientierung, zu beheben und zu verarbeiten, die Haut, wie in Abschnitt 2.1 beschrieben. Für die Analyse der Talgdrüsen, schneiden Sie die Schwanzhaut in eine Reihe von Segmenten ~ 0,5 bis 1 cm in der Länge vor der Fixierung und bebrüten die Hautstücke in PBS / 5 mM EDTA über Nacht bei 37 ° C, um die Dermis-Epidermis Haft 13 schwächen. </li><li> Ziehen Sie leicht die Epidermis von der Dermis, Epidermis, um die Pin Sylgard (Innenfläche nach oben), und fixieren Sie sie in 4% PFA / PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Mit PBS waschen, färben und mit Oil Red O wie unten beschrieben. HINWEIS: Ein elektrischer Rasierer und / oder Haarentfernung Gel kann vor Sezieren älteren Schwanzhaut (z. B. P21) verwendet werden, aber diese Behandlung ist optional, da das Haar am Schwanz ist nichtso dicht wie an anderer Stelle im Körper. </li></ol></li></ol> 3. Färbung Reaktionen <ol><li> Menschliche Plazenta-alkalische Phosphatase (AP) Histochemistry Visualisieren genetisch markierten Axon Lauben 10,14,15 (3A, B) <ol><li> Nach PFA Fixierung auf Sylgard, legen festen Häute in einem 10 cm Glasschale und tauchen unter PBS / 1 mM MgCl 2. Drehen Sie vorsichtig die Schale in einem Wasserbad bei 70 ° C für 90 min, um die endogene Phosphatase-Aktivität zu zerstören. </li><li> Visualisieren AP Reporteraktivität histochemisch mit 4-48 h Inkubation bei Raumtemperatur in 0,1 M Tris, pH 9,5, 0,1 M NaCl, 50 mM MgCl 2, 0,34 &amp;mgr; g / ml NBT und 0,175 &amp;mgr; g / ml BCIP, typischerweise mit 10-15 ml Färbelösung pro P21 Rückenhaut. Überwachen Sie die Reaktion unter dem Binokular, kümmert sich um sie über die optimale Zeit gehen, wie durch visuelle Inspektion der Axon-Färbung Intensität relativ unspezifische Ablagerung NBT beurteilt zu lassen. </li&gt; <li> Die Reaktion durch Waschen mit drei Änderungen von PBS/0.1% Tween-20 im Laufe von 1 h, Re-Stift den Schalen zu Sylgard, dehydrieren die Felle durch eine Ethanol-Serie, und dann übertragen die Felle auf eine 10 cm-Schale mit BBBA. HINWEIS: BBBA löst sich langsam die NBT Niederschlag. In den ersten paar Stunden in BBBA, wird eine feine Hintergrund gefällt NBT aufzulösen; Als Ergebnis wird die Lösung BBBA verdunkeln und die Haut aufzuhellen. Ändern Sie die frische BBBA nach ein paar Stunden. </li><li> Nach der Abbildung des AP-gefärbte Haut, überträgt es auf&gt; 1 h bei Raumtemperatur in Ethanol und dann speichern Sie es in frischem Ethanol bei -20 ° C AP-gefärbten Häute können auf diese Weise für viele Monate ohne Signalverlust gelagert werden. </li></ol></li><li> Oil Red O Färbung zu visualisieren Talgdrüsen 4 (3C-F) <ol><li> Insektenstifte entfernen und übertragen die leicht behoben Fuß oder Schwanz Skins aus dem Sylgard Platte mit den Vertiefungen einer 6-Loch-Gewebekulturplatte mitbis zu zwei Hautproben pro Vertiefung. Für 5 min bei Raumtemperatur Wasser: Waschen mit Isopropanol 60:40. </li><li> Stain in 2 ml 0,3% Oil Red O in 60:40 Isopropanol: Wasser (siehe Abschnitt 1.2) bei Raumtemperatur für 2 Stunden. </li><li> 5 min bei Raumtemperatur, gefolgt von einem Wasserwaschwasser waschen mit Isopropanol 60:40. Sorgfältig schneiden Sie die Ränder der Haut, auch die Stiftlöcher, mit einer feinen Schere, so dass die Oberfläche der Haut kann so flach wie möglich gemacht werden. </li><li> Legen Sie die Haut auf einem Objektträger mit der Außenseite nach oben, ein paar Tropfen von Wasser oder wässrigen Eindeckmedium, decken Sie die Haut mit einem Deckglas, und dann sanft kleben Sie das Deckglas auf den Objektträger weiter glätten die Haut. </li></ol></li><li> Wohnung Berg Immunfärbung 4,16,17 (Abbildungen 3G, H) <ol><li> Schneiden Sie ein Rechteck aus PFA fixiert Haut (z. B. 1 cm x 0,5 cm), Kennzeichnung seiner Ausrichtung mit einem asymmetrischen Schnitt (z. B. Clip die vordere rechte Ecke). Führen Sie die Inkubation undWaschschritte mit sanften Drehung auf einer rotierenden horizontalen Plattform. In die Vertiefungen einer 6 - oder 12-Well-Gewebekulturplatte, mehrmaliges Waschen mit PBS, um Rest PFA entfernen, mit ~ 10 Wechseln von PBS mit 0,3% Triton X-100 (0,3% PBST) über 5-8 Stunden bei Raumtemperatur auf die Haut durchlässig zu. </li><li> Inkubieren mit dem primären Antikörper in 0,3% PBST mit 5% Ziegenserum und 20% DMSO für fünf Tage bei Raumtemperatur. Die Vertiefungen der Platte mit durchsichtigem Klebeband oder Klebstoff Kunststoffverdunstungsverluste zu beseitigen. </li><li> 10-15 Änderungen von 0,3% PBST waschen über 5-8 h und Inkubation mit sekundärem Antikörper in 0,3% PBST mit 5% Ziegenserum und 20% DMSO für 3 Tage bei Raumtemperatur. </li><li> 10-15 mit Änderungen von 0,3% PBST über 5-8 Stunden waschen. </li><li> Dehydratisierung in 25%, 50% und 75% Methanol und dann mit je 3x in 100% Methanol für jeweils 20 min 5 min. </li><li> Klar in BBBA über Nacht bei Raumtemperatur. HINWEIS: Wohnung montieren Immunfärbung von Haut jünger als~ P1, ​​wie oben beschrieben, jedoch mit kürzeren Inkubationszeiten durchgeführt und Waschzeiten. Zum Beispiel kann die Haut mit einem P1-Nacht-Inkubation in primärem Antikörper und einem mehrstündigen Inkubation in sekundären Antikörper immungefärbt werden und mit dazwischen Wäschen 2-3 h in 0,3% PBST. Wie oben erwähnt, sind jünger Skins auch dünn genug, dass sie ohne BBBA Clearing abgebildet werden. </li></ol></li><li> Visualisierung Merkelzell-Cluster mit fluoreszierenden Nerven Terminal-Farbstoffaufnahme (Abb. 3I-L) AMI-43 (grün) und AM4-65 (rot) fixierbar sind Fluoreszenzfarbstoffe, die Zellen über nicht-selektiven Kationenkanal 18 eintreten. In der lebenden Haut diese Farbstoffe selektiv aufgenommen und in Merkel-Zellen konzentriert. <ol><li> Lösen Sie 1 mg AM1-43 oder AM4-65 in 2 ml PBS und Speicher in Aliquots bei -80 ° C </li><li> Inject neugeborenen Welpen subkutan mit 2-10 ug Farbstoff pro Gramm Körpergewicht mit einer 29 G-Nadel. </li><li> Einen Tag später einschläfern die Mäuse und disseCT Die Rückenschalen. </li><li> Fix die Felle in 4% PFA / PBS bei 4 ° C über Nacht, waschen mit PBS, und montieren Sie die Haut, wie in Abschnitt 3.2 beschrieben. </li></ol></li></ol> 4. Imaging und Bildanalyse <ol><li> Imaging Haarfollikel Orientierung (Abbildung 4) <ol><li> Verwenden Sie ein Binokular für Bild in Rücken-, Fuß-oder Schwanz Skins, die in BBBA in der Glasschale eingetaucht sind, unter einem Glasobjektträger abgeflacht, und noch immer - dieser Ansatz minimiert BBBA Kontamination des Mikroskops. </li><li> Beleuchten Sie die Schale von unten. Um räumliche Variation der Lichtintensität über das Sichtfeld zu minimieren, erhöhen die Glasschale zu einer Höhe ~ 10 cm über der Standard-Arbeitsoberfläche des Binokular und legen eine Streu Kunststoff-oder Glasplatte über der Lichtquelle. </li><li> Rückgabe die Haut 100% Ethanol für langfristige Lagerung bei -20 ° C. HINWEIS: Lassen Sie die Haut in BBBA für mehr als einen Tag bewirkt, dass die Melanin-Granula zu brechen einTeil. Sobald die Haut wurde BBBA behandelt es wird hart und flach bleiben ab diesem Zeitpunkt. Verschiedenen Häute mit einer Reihe von Kerben an ihrem vorderen und / oder hinteren Enden kodiert werden, so dass sie zusammen lagern kann, um Platz im Gefrierfach zu speichern. </li></ol></li><li> Imaging and Tracing Axon Lauben (3A, B) <ol><li> Zeigen AP gefärbten Haut (Abschnitt 3.1.3) zwischen zwei Glasplatten des Typs für kleine Protein-Gele verwendet. Vermeiden Sie die Einführung von Luftblasen zwischen den Platten und der Haut, und dann sorgfältig Docht entfernt überschüssiges BBBA mit einem Papiertuch. Legen Sie die Sandwich-Platte Haut-Platte auf einem Mikroskoptisch (2D). </li><li> Verwenden Hellfeld oder DIC Beleuchtung mit einer 10X-Objektiv und 2 um oder 5 um Z-Schritte. Verwenden Sie einen mechanisierten XY-Tisch, um eine Montage von XY Bilder, die zusammengenäht sind, um einen einzigen dreidimensionalen Graustufen-Datensatz erstellen zu erfassen. HINWEIS: Für einen großen Axon Laube, diese Datenmenge kann eine seins groß wie 5 Gb. </li><li> Eine manuelle, automatische oder halbautomatische Ablaufverfolgung von Axon Dorne mit einem aus einer Vielzahl von Software-Paketen. HINWEIS: Software wie Neuromantic (http://www.reading.ac.uk/neuromantic/) ist ein kostenloses Tool, das neuronale Rekonstruktion in einer PC-Umgebung läuft und ist relativ einfach zu meistern 10. </li></ol></li></ol>

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Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Aal Ert&#252;rk, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nat. Methods. 10, 508-513 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Die Beherrschung der oben beschriebenen Methoden Dissektion erfordert nur Geduld, eine ruhige Hand und ein paar gute Dissektion Werkzeuge. Die Rückenhaut Dissektion ist relativ einfach, aber die Schwanz-und Fuß-Haut Dissektionen - vor allem in der frühen postnatalen Alters - sind anspruchsvoller. Am frühen pränatalen Altersgruppen (z. B. vor dem E15), die Haut ist schwer zu entfernen, ohne es zu zerreißen. Günstig für viele Untersuchungen über das Wachstum und Musterbildung der Hautstrukturen in Mäuse...

Die Haut ist eines der größten Organe im Körper, mit wichtigen Funktionen in somato-Sensation, Isolierung / Wärmeregulation und Immunabwehr ein. Das Verständnis der molekularen und zellulären Grundlagen der Entwicklung und Funktion der Haut hat der langjährige Interesse wegen der grundlegenden Bedeutung der Haut als biologisches System und seine Bedeutung für Dermatologie gewesen. Säugetierhaut enthält eine Vielzahl von multizellulären Strukturen, einschließlich geschichteten Lagen von Keratinozyten, dermale Bindegewebe, verschiedene Arten von Haarwurzeln, Talgdrüsen, arrector Pili Muskeln, Blutgefäße, und mindestens ein Dutzend verschiedene Klassen von afferenten (sensorischen) und ableitenden Nerven Fasern (Abbildung 1). Verschiedene Regionen des Körpers mit charakteristisch unterschiedliche Hauttypen zugeordnet. In den meisten Säugetieren wird fast die gesamte Körperoberfläche mit der Haut, die dicht mit Haarfollikel verpackt ist abgedeckt. [Menschen und Nacktmulle Ausnahmen von thist Muster.] Das Haar ist von den Hohlhandflächen der Hände und Füße, die auch mit spezialisierten epidermalen Muster (Dermatoglyphen), exokrine Drüsen und sensorischen Nervenenden verbunden sind, fehlt. Die zellulären und molekularen Ereignisse, die das Wachstum, die Differenzierung und die räumliche Anordnung der Zellen innerhalb der Haarfollikel zu steuern sind von besonderem Interesse, da jedes Follikel aufweist, in Miniatur viele der zentralen Merkmale der Organogenese 2. Zu diesen Funktionen gehören die Existenz von Stammzellen und Stammzellnische, präzise choreographierte Zelle Migrationen und die Montage von mehrzelligen Strukturen aus embryologisch unterschiedliche Komponenten. Dieser Artikel beschreibt Methoden zum Präparieren, Fixieren, Kennzeichnung und Imaging-Mäusehaut als intakte zweidimensionalen Blatt, bezeichnet als &quot;whole mount&quot; oder &quot;flat mount&quot; Vorbereitung. Seit Mäusehaut relativ dünn ist, ist es möglich, Bild durch die gesamte Dicke des abgeflachten Skin mit herkömmlichen konfokalen Mikroskopie. Die flache Halterung Ansatz auf Säugetierhaut Bildgebung ist technisch vorteilhaft, weil es umgeht die Notwendigkeit für physische Schnitte, wodurch Strukturen vollständig durch optische Schnitte rekonstruiert werden. Da fast die gesamte Haut wird als ein einzelnes Objekt bearbeitet, die flache Montage Ansatz ermöglicht auch die Darstellung von mehreren Bereichen der Körperoberfläche unter Beibehaltung Informationen über Position und Orientierung relativ zu den Körperachsen. Schließlich sind die Strukturen innerhalb der Haut typischerweise in Mustern, die in regelmäßigen Abständen wiederholt werden und erleichtert so die Sammlung von Bildern aus verschiedenen Vertretern einer gegebenen Struktur vorhanden. Diese Eigenschaften sind dem Neurobiologen, die auf der Netzhaut eines zweidimensionalen Teil des zentralen Nervensystems, die analog Vorteile für die Untersuchung der neuronalen Morphologie 3 befindet arbeiten. Die hier beschriebene Wohnung montieren Ansatz ist von besonderer utility für die Untersuchung Strukturen, die räumliche Organisation in der zweidimensionalen Ebene der Haut zeigen auf einem relativ großen Maßstab. Ein Beispiel von Großraumorganisation ist die koordinierte Polarität der Haarfollikel und Haarfollikel-assoziierte Strukturen - Merkel-Zell-Cluster, arrector Pili Muskeln, Talgdrüsen und Nervenenden 4. Haarfollikel in einem Winkel bezüglich der Ebene der Haut, und die Komponente des Vektors Follikel, die in den 2-dimensionalen Ebene der Haut liegt orientierten zeigt im allgemeinen eine Orientierung in Bezug auf die Körperachsen, die jeweils genau bestimmt ist Position auf dem Körper. Zum Beispiel, um die Haarfollikel auf der Rückseite Punkt von rostral nach kaudal und Haare auf der dorsalen Oberfläche der Füße zeigen von proximal nach distal. Haarfollikel Orientierung wird durch planare Zellpolarität Signalisierung gesteuert (PCP, auch als Gewebe Polarität 5). Dieses Signalisierungssystem wurde in Drosophila gefunden, wo ein kleinesSatz von Kern PCP Genen gefunden wurde, um die Orientierung kutikulärer Haare und Borsten steuern. Drei Säugetier-Orthologe von Kern PCP Gene - frizzled Homolog 6 (Fzd6, die auch als Fz6 genannt) Cadherin EGF LAG sieben Pass G-Typ-Rezeptor 1 (Celsr1) und Vang-like 2 (Vangl2) - analog zu spielen Rollen in Säuger Haut, die Koordination der Orientierungen der Haarfollikel mit den Körperachsen. Studium der Fz6 Knockout-Mäusen (Fzd6 tm1Nat, im Folgenden bezeichnet Fz6 - / -) zeigen, dass der primäre Defekt in der Abwesenheit von PCP-Signalisierung ist eine erste Randomisierung oder Desorganisation der Haarfollikel Orientierung, ohne Wirkung auf die intrinsische Struktur der Follikel 08.06. Ein zweiter nicht-PCP-System wirkt später auf lokale Ausrichtung der Nähe Follikel, die auf die Produktion von großen Haarmuster wie Quirle und Büschel führt fördern. Ein zweites Beispiel für Großräumliche Organisation in der Haut ist in den Morphologien der sensorischen Axon Lauben gesehen. Sensorische Neuronen, die die Haut innervieren haben ihre Zellkörper in der Hinterwurzel und Trigeminalganglien. Diese Neuronen erfassen Temperatur, Schmerz, Juckreiz, und verschiedene Arten von mechanischen Verformungen Auftreffen auf die Haut-und Haar 9. Sie können in Untergruppen, basierend auf Axondurchmesser und Leitungsgeschwindigkeit, Anschluß Nervenende Struktur, und die Muster der Expression von Rezeptoren, Kanäle und andere Moleküle unterteilt werden. Aufgrund der hohen Dichte der Innervation in der Haut, Analysen beinhalten, dass Visualisierung aller Axone (zB Anti-Neurofilament-Immunfärbung) oder sogar alle Axone von einer einzelnen Klasse (so gesehen, wenn ein Zelltyp wird durch Expression eines fluoreszierenden Reporter markiert) offenbart im allgemeinen eine dichte Überlagerung der Axone, die es unmöglich macht, die Morphologie eines einzelnen Dorn definiert ist. Um dieses Problem zu umgehen, haben wir sehr spärlich genetisch gerichteten l verwendetAbeling, um Rückenhautproben, in denen einzelne gut isoliert Axon Lauben sind Ausdruck einer histochemischen Reporter menschlichen Plazenta-alkalische Phosphatase 10 visualisiert produzieren. Dieser Ansatz ermöglicht die eindeutige Visualisierung der einzelnen Axon Laube Morphologien und eine Definition des somatosensorischen Neuronen Typen basierend auf morphologischen Kriterien.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="824">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:256px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate (BCIP)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11383221001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AM1-43</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>70024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AM4-65</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>70039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>402834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl benzoate</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>B-6630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:256px;">Zeiss</td>
			<td style="width:145px;">LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy3-alpha smooth muscle actin antibody</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C6198</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytokeratin-8&#160;</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-I-c</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection tools&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td>scissors and forceps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electric razor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluoromount G</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>17984-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formalin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass dishes</td>
			<td>Pyrex&#160;</td>
			<td></td>
			<td>6 cm and 10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass plates</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>SE202P-10</td>
			<td>10 cm x 8 cm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hair remover&#160;</td>
			<td>Nair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horizontal rotating platform&#160;</td>
			<td style="width:256px;">Hoefer</td>
			<td style="width:145px;">PR250 Orbital shaker</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine/xylazine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitroblue tetrazolium (NBT)</td>
			<td>Roche&#160;</td>
			<td>11383213001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oil Red O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Razor Blades</td>
			<td style="width:256px;">VWR</td>
			<td style="width:145px;">55411-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibodies&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Alexa-dye conjugated&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard-184</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9020938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture plastic dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6- and 12-well&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology

Die Haut ist ein sehr heterogenes Gewebe. Intra-dermalen Strukturen umfassen Haarfollikel, arrector Pili Muskeln, epidermale Spezialisierungen (wie Merkel-Zell-Cluster), Talgdrüsen, Nerven und Nervenenden, und Kapillaren. Die räumliche Anordnung dieser Strukturen fest auf einer mikroskopischen Skala gesteuert - wie zu sehen ist, beispielsweise in der geordneten Anordnung von Zelltypen in einer einzelnen Haarfollikel - und in einem makroskopischen Maßstab - wie durch die nahezu identischen Orientierungen von Tausenden von Haaren gesehen Follikel in einem lokalen Bereich der Haut. Visualisierung dieser Strukturen ohne physikalisch Schneiden der Haut ist wegen der 2-dimensionalen Geometrie des Organs möglich. In diesem Protokoll zeigen wir, dass der Mäusehaut zerlegt werden kann, fixiert, permeabilisiert und gefärbt, und als intakte zweidimensionales Objekt, einem Flachmontage geklärt. Das Protokoll ermöglicht die einfache Visualisierung von Hautstrukturen in ihrer Gesamtheit durch die gesamte Dicke der große Bereiche der Haut durch optsche Schnitte und Wiederaufbau. Bilder dieser Strukturen kann auch mit Informationen über die Position und Orientierung relativ zu den Körperachsen integriert werden.

Hellfeld-Abbildung der Hautflatmounts können Bild kutane sensorische Afferenzen (3A 10) und Haarfollikel-Muster basierend auf Melaninpigmentierung (Fig. 4) verwendet werden. Konfokale Abbildung der Hautflatmounts kann verwendet werden, um die Geometrie (1) Merkel-Zell-Clustern, mit Anti-Cytokeratin-6 oder mit AM Farbstoffaufnahme (Fig. 3I-L), (2) arrector pili Muskeln, mit Anti visualisiert visualisiert definieren Aktin glatter Muskeln (Fig. 3G, H),<...

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Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Säugetier-Haut enthält eine Vielfalt von Strukturen - wie Haarfollikel und Nervenenden - das charakteristische Muster der räumlichen Organisation zu zeigen. Die Analyse der Haut als flache Halterung nutzt die Vorteile der 2-dimensionalen Geometrie dieses Gewebe voller Dicke hochauflösende Bilder der Strukturen der Haut zu produzieren.

Wohnung Berg-Imaging von Mäusehaut und ihre Anwendung auf die Analyse von Mustern und die Haarfollikel Sinnes Axon Morphologie

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

flat-mount-imaging-mouse-skin-its-application-to-analysis-hair

Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.2K Aufrufe.  Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University School of Medicine.  Säugetier-Haut enthält eine Vielfalt von Strukturen - wie Haarfollikel und Nervenenden - das charakteristische Muster der räumlichen Organisation zu zeigen. Die Analyse der Haut als flache Halterung nutzt die Vorteile der 2-dimensionalen Geometrie dieses Gewebe voller Dicke hochauflösende Bilder der Strukturen der Haut zu produzieren. 

Serie: Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Multiple-Maus Neuroanatomische Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

Tissue Vorbereitung und Immunfärbung von Maus sensorischen Nervenfasern innervieren Haut und Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Proper neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central nervous system (CNS). This bidirectional communication is sophisticatedly mediated by specific signaling pathways between neuron and glia1,2 . Identification and characterization of these signaling pathways is essential to the understanding of how neuron to glia interaction shapes CNS physiology. Previously, neuron and glia mixed cultures have been widely utilized for testing and characterizing signaling pathways between neuron and glia. What we have learned from these preparations and other in vivo tools, however, has suggested that mutual signaling between neuron and glia often occurred in specific compartments within neurons (i.e., axon, dendrite, or soma)3. This makes it important to develop a new culture system that allows separation of neuronal compartments and specifically examines the interaction between glia and neuronal axons/dendrites. In addition, the conventional mixed culture system is not capable of differentiating the soluble factors and direct membrane contact signals between neuron and glia. Furthermore, the large quantity of neurons and glial cells in the conventional co-culture system lacks the resolution necessary to observe the interaction between a single axon and a glial cell.
	In this study, we describe a novel axon and glia co-culture system with the use of a microfluidic culture platform (MCP). In this co-culture system, neurons and glial cells are cultured in two separate chambers that are connected through multiple central channels. In this microfluidic culture platform, only neuronal processes (especially axons) can enter the glial side through the central channels. In combination with powerful fluorescent protein labeling, this system allows direct examination of signaling pathways between axonal/dendritic and glial interactions, such as axon-mediated transcriptional regulation in glia, glia-mediated receptor trafficking in neuronal terminals, and glia-mediated axon growth. The narrow diameter of the chamber also significantly prohibits the flow of the neuron-enriched medium into the glial chamber, facilitating probing of the direct membrane-protein interaction between axons/dendrites and glial surfaces.

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

This study describes the procedures of setting up a novel neuronal axon and (astro)glia co-culture platform. In this co-culture system, manipulation of direct interaction between a single axon (and single glial cell) becomes feasible, allowing mechanistic analysis of the mutual neuron to glial signaling.

Imaging Analyse von Neuron zu Glia Interaktionen in Microfluidic Kultur Platform (MCP)-basierte Neuronale Axon und Glia Co-Kultur-System

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Ganze Berge Immunmarkierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen in der<em&gt; Drosophila</em&gt; Antennen

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Whole-Mount-Imaging von Mouse Embryo Sinnes Axon Projektionen

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamik in Cone Photorezeptor Axonterminalen des Maus-Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Ganze Berge Dissection und Immunfluoreszenz der erwachsenen Maus Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The technique is very cost-effective and easily undertaken with materials commonly found in most electrophysiology laboratories, or easily purchased. The dissection is simple and fast, with the mechanical displacement provided by a generic electroceramic wafer controlled by proprietary software. The same software also records and analyses the electroneurogram output. The recording of the evoked nerve activity is through a commercial differential amplifier connected to fire-polished standard glass microelectrodes. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the stimulation and the recording conditions to optimize recording quality. The system is suitable for assaying the electrophysiological and optical properties of lanceolate terminals of palisade endings of hair follicles, as well as the outcomes from their pharmacological and/or genetic manipulation. An example of combining electrical recording with mechanical stimulation and labeling with a styryl pyridinium vital dye is given.

A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.

Kombinierte Aufnahme von Mechanisch Stimulated Afferent Output und Nervenendigung Kennzeichnung Maus Haarfollikel Lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles in the skin of the mouse pinna. The preparation is simple and relatively fast, reliably yielding extensive regions of multiple labeled units of living nerve terminals to study uptake and release of styryl pyridinium dyes extensively used in studies of vesicle recycling. Subdividing the preparations before labeling allows test vs. control comparisons in the same ear from a single individual. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the labeling and the imaging parameters. This new system is suitable for assaying pharmacologically and mechanically-induced uptake and release of these vital dyes in lanceolate terminals in both wild-type and genetically modified animals. Examples of modulatory influences on labeling intensity are given.

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

Optische Überwachung der Lebensnervenendigung Beschriften in Haarfollikel Lanceolate Endigungen der<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Maus-Ohr-Haut

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic network, electrophysiological recordings are frequently used to study connections among individual neurons. We have optimized a flat-mount preparation for patch clamp recording of genetically marked neurons in both GCL (ganglion cell layer) and INL (inner nuclear layer) of mouse retinas. Recording INL neurons in flat-mounts is favored over slices because both vertical and lateral connections are preserved in the former configuration, allowing retinal circuits with large lateral components to be studied. We have used this procedure to compare responses of mirror-partnered neurons in retinas such as the cholinergic starburst amacrine cells (SACs).

This protocol demonstrates how to perform whole-cell patch clamp recording on retinal neurons from a flat-mount preparation.

Patch-Clamp-Aufzeichnung von Starburst-Amakrinzellen in einer Wohnung Montage Herstellung von Deafferentated Maus Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...