The work was in part funded by UK Medical Research Council project grant G0601253 to G.S.B. and R.W.B.

Maus post mortem Gewebe Ernte müssen ethische Methoden für diese Anwendung freigegeben. Im Vereinigten Königreich ist Zervikaldislokation eine staatlich anerkannte Methode für erwachsene Mäuse (börsennotiertes Zeitplan 1 Verfahren in Großbritannien Tiere (Scientific Procedures) Act 1986 und der europäischen Richtlinie 2010/63 / EU). Diese Gesetzgebung wird vor Ort an der University of Aberdeen durch den Tierschutz und ethische Review Board durchgesetzt, die alle Verfahren in dem folgenden Protokoll verwendet, überprüft und genehmigt. Hinweis: Es wurden in der Forschung in Banken meldeten Diese Methoden et al 7. 1. Vorbereiten Ohren für Elektrophysiologie <ol><li> Vor Dissektion, bereiten Sie einen Standard physiologischer Kochsalzlösung, wie Liley der (1956) und sättigen sie mit 90% O 2/5% CO 2. Liley der Kochsalzlösung (mM) besteht aus: NaHCO 3 (12), KCl (4), KH 2 PO 4 (1), NaCl (138,8), MgCl 2 (1), CaCl 2 (2) und Glucose(11). </li><li> Menschlich eine erwachsene Maus einschläfern, ohne den Schädel in der Nähe der Ohren zu beschädigen. Hier verwenden wir C57 / Bl6J und MF1-Mäuse aber jede Standard-Labormausstamm verwendet werden kann. Idealerweise Mäuse verwenden, die &lt;25 g sind, wenn elektrische Aufnahme mit Styrylfarbstoffs Kennzeichnung kombiniert werden soll, wie die Kennzeichnung in größeren Mäuse weniger zuverlässig ist, oft nur in eingeschränkten umschriebenen Bereichen gefunden werden. </li><li> Entfernen Sie den Kopf mit großen Schere oder Knochenschere. </li><li> Setzen Sie den Kopf dorsalen Seite nach oben in vergast Liley die in einem breiten Boden Sezieren Schale (50 cm ist in der Regel bequem) auf der Bühne eines Stereo-Präpariermikroskop. Regelmäßig (~ 10 min) Schleuse oder den Kopf mit vergast Salz versenken. </li><li> Sorgfältig einzuschneiden und die Haut an der Basis des äußeren Ohres (Ohrmuschel) mit Springbow Schere und # 3 Zange trennen, den Knorpel des äußeren Gehörgangs (EAM) ausgesetzt wird. Identifizieren Sie die Zweige des Trigeminus (mandibularis, MDV) und große Ohrmuschel Nerven, wie sie f entstehenrom der Schädel in der Spalte des Kiefergelenks und Projekt durch den Knorpel Basis der konkaven zu innervate (anterior) und konvexen (posterior) Aspekte der Ohrmuschel Haut sind. </li><li> In der Nähe des Schädels, zu identifizieren, wo die beiden Nervenäste Ausfahrt in die Nut zwischen der Backe und dem Mastoid Prozess. Maximieren ihrer Länge durch sanft die Ohrmuschel vom Schädel ziehen und die Nerven so nah an den Schädel wie möglich schneiden. </li><li> Entfernen Sie die Ohrmuschel aus dem Kopf mit Springbow Schere so, daß die distalen Stümpfe der geteilten Nerven und Minimierung der Menge an dicht pelage an der Basis des Ohres zu vermeiden, die entfernt wird. </li><li> Übertragen Sie die Ohrmuschel mit einem flexiblen Silikonkautschuk (PDMS) -lined Schüssel gefüllt mit begasten Liley der Flüssigkeit. Öffnen Sie die EAM, indem sie es an seiner schmalsten Stelle (anterior-die meisten) Punkt geteilt wird. Flatten die Ohrmuschel, vordere Haut (konkave) Seite nach unten und Pin an die PDMS sorgfältig an den Rändern mit ~ 6-8 in regelmäßigen Abständen sehr fein (~ 0,2 mm Durchmesser) Insektenstifte. </li><li> Remove die Haut des hinteren Teils der Ohrmuschel vollständig und teilweise die Ohrmuschel Knorpel durch stumpfe Dissektion mit # 3 Pinzette zu entfernen, um die vordere Haut gewährleisten intakt gelassen wird. </li><li> Mit der Spitze eines feinen Insektenstift gegriffen mit einem # 3 Pinzette vorsichtig die Zweige erstrecken (in der Regel 2) des MDV, die posterior zwischen der Haut und EAM Knorpeln entstehen. Pin diese an die PDMS mit den besten möglichen Insektenstifte, spießte das Bindegewebe angrenzenden ihren Schnittenden und nicht die Nervenstämme selbst. </li><li> Entfernen Sie die meisten der umgebenden Bindegewebe um sie herum, sorgfältig Schaden von überschüssigem vermeiden Ziehen oder Schneiden. </li></ol> 2. Die elektrophysiologischen Aufzeichnung einrichten <ol><li> Pin der Ohrmuschel Haut an die PDMS-lined Basis eines Aufnahmekammer mit feinen Insektenstifte an den Rändern (~ 6-8 pro Ohr), legen Sie die gereinigten Nerven an der Basis des Ohres in der Nähe von zwei Saugelektroden - eine für die Aufnahme (zu nehmen Sie den Nerv) und die otihr eine indifferente Elektrode (dem Neutralsignal an einen Differenzverstärker zu schaffen, siehe 7). </li><li> Für die Aufzeichnungselektrode, passen sorgfältig die Blende und die Innendurchmesser der Öffnung auf die kombinierte Dicke der beiden Nerven, so passen sie so eng wie möglich und für so große Länge wie möglich. </li><li> Zeichne die Nerven in die Elektrode durch vorsichtiges Absaugen aus einer 2 ml-Spritze mit dem anderen Ende befestigt ist mit Silikongummischlauch. Achten Sie darauf, die Nerven sind gerade, nicht gefaltet oder verdoppelt. </li><li> Entwickeln Sie einen hohen elektrischen Widerstand / Impedanz fit durch stärkere Absaugung mit Bindegewebe oder ein Fettgewebe zu ziehen einen Stecker zu bilden, die dicht verschließt die Öffnung um den Nerv. </li><li> Füllen Sie das andere (indifferent) Elektrode mit Kochsalzlösung durch Absaugen, falls erforderlich (es durch Kapillarwirkung füllen kann). </li><li> Platzieren Sie identische Aufnahme Drähte (Silber oder Platin) in die Innenbohrung der Aufzeichnungselektroden, die Kochsalzlösung in Kontakt zu treten und den Nerv(Aufnahme) oder verengt, feuerpolierte Ende (indifferent) der Elektrode. Jede Elektrode ist gelötet individuell an verschiedene Kerne von zwei-adriges geschirmtes Kabel. Stellen Sie das Bad (Masse) Elektrode (Ag / AgCl-Pellet) in das Bad und zermalmte es auf den Bildschirm der beiden Core-Kabel an die Aufzeichnungselektroden verbunden. </li><li> Führen Sie die elektrische Aktivität von den beiden Elektroden in die einzelnen Kanäle eines Differenzverstärkers, Filter (Bandgeben 0,2-2 kHz) und Blick auf dem Bildschirm eines Oszilloskops. Überprüfen Sie, dass der Kanal A (Aufnahme) und Kanal B (indifferent) die elektrischen Rauschpegel ähnlich aussehen. In diesem Stadium kann es nicht möglich sein, die normalen spontanen Aktionspotentiale in Kanal A zu sehen, bevor die beiden Elektroden ausgeglichen sind. </li><li> REDRESS keine Unterschiede in Hintergrundrauschen zwischen den Elektroden durch die Impedanz der Aufnahme (Kanal A) zu erhöhen oder indifferent (Kanal B) Elektroden. Tun Sie dies durch das Saugen areolar (adipöse) Bindegewebe weiter in jeder Elektrode und /oder die Anwendung von mehr Saugkraft auf die 50-ml-Spritze. <ol><li> Sobald &quot;ausgewogen&quot; auf diese Weise, wechseln Sie wieder auf Differential (AB) Aufnahme und suchen spontane Aktionspotentiale (APs) in der Spur oder wenn Haare am Rand der Ohrmuschel zu streicheln. Wenn keine Aktivität (spiking) gesehen wird, überprüfen Sie nochmals auf festen Sitz der Nerv in der Aufzeichnungselektrode und die areolar Bindegewebe in der indifferenten Elektrode - in der Regel die engere (höherer Widerstand) der Dichtung und der mehr gleich der Impedanz in den beiden Elektroden, desto besser. Mit der Praxis wird dies eine gute Qualität zu erreichen (&gt; 2: 1) Signal: Rausch-Verhältnis. </li></ol></li><li> Notieren Sie sich die electroneurogram über eine Labor-Schnittstelle und Elektrophysiologie-Software auf einem Computer ausgeführt wird. Ein Audioausgang spiking ist sehr nützlich und kann durch Einspeisen des Neurogramms über einen Audio-Verstärker und zugehörigen Audio-Lautsprecher erreicht werden. Stellen Sie die Schwelle gerade über dem Grundrauschen ist (identifiziert durch die Abwesenheit von white-noise &#39;Zischen&#39;). </li><li> Zur Erhöhung der Droge oder fluoreszierende Styrylfarbstoffs Zugang zu den lanceolate Endungen sorgfältig schälen die Unterhautfettschicht in der Nähe der Ohrmuschel Rand entfernt, ein Fenster von ~ 5 mm x 5 mm Aussetzen der Dermis und der Basis der Follikel (1A Öffnung, B ). </li><li> Pin zurück eine Falte von ~ 1 mm von Fettgewebe geräumten Ohrhaut an den vorderen Rand (auf der Ebene des Fensters nur produziert, wo zutreffend), eine klare Kochsalzlösung gefüllte Lücke zwischen den apposed Hautschichten zu verlassen. Sanft Hub entlang der gefalteten Kante die Haare mit einem Stift oder geerdeten feinen Pinzette vorsteht, ohne die Haut zu berühren, den Bereich der maximalen AP Ausgang auf dem Oszilloskop und dem unverwechselbaren &quot;klickt&quot; und &quot;Pops&quot; in den Audio-Ausgang zu finden. </li></ol> 3. Aufnahme Stimulus-evozierte Aktionspotentiale <ol><li> Positionieren Sie die mechanische Stimulationssonde - eine feuerpolierte 10 cm Borosilikat-Glas-Mikroelektrode zu einem cerami befestigtc piezoelektrische Betätigungseinrichtung - so ist die Bewegung parallel zu der Hautfalte. Setzen Sie die Spitze etwa 0,5-1 mm von Hautfalte, so dass es die Haare berührt aber nicht die Haut. Stellen Sie sicher, wirksam Stimulation durch langsam die Sondenspitze bewegen manuell die Haare abzulenken und zu beobachten / hören zum Spicken. </li><li> Verwenden Sie die Software mechanische Stimulation von 1-3 Haare zu fahren (zB 3 Sekunden bei 5 Hz Sinusoide, alle 10 sec. Sonde Verschiebung 200-500 &amp; mgr; m), und notieren Sie die Stimulation hervorgerufenen Reaktionen in den Nerven. </li><li> Geben Sie mehrere identische mechanische Stimulation Züge in 10 Sekunden-Intervallen. Optimieren Sie die Sondenposition für die Wiederholbarkeit, dann Frequenz der Stimulation reduzieren gemäß Versuchsprotokoll (zB Tropfenwiederholungsrate von 10 s bis 30 s). </li><li> Verwenden Sie die Software AP-ähnliche Aktivität zB unter Verwendung einer einfachen Schwelle auf ~ 2x Hochfrequenzrauschamplitude und ~ 25% der größten APs zu unterscheiden. </li><li> Zählen Sie die APs Überschreiten der Schwelle als&quot;Ereignisse&quot;, Quantifizieren der Frequenz und die Eigenschaften der hergestellten APs. </li></ol> 4. Aufnahme Stimulus-evozierte Firing Kombination mit N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (Dibutylamino) styryl) Pyridinium -dibromid Labeling <ol><li> Um die Auswirkungen der Styrylfarbstoffe auf Stimulus-evozierte zuführenden Brennen und Klemmenbeschriftung, fügen Sie die entsprechende Konzentration eines Styrylfarbstoffs der Wahl, auf die Badelösung prüfen und mit der elektrischen Aufzeichnung fortzusetzen. </li><li> Nach der Belichtungszeit erforderlich (in der Regel mindestens 30 min), bereiten Sie die Vorbereitung auf die Follikel sehen. Klappen Sie die Hautlappen durch die Haltestifte zu entfernen, und setzen die gelöscht dermalen Bereich der Klemmenbeschriftung zu offenbaren. </li><li> Wegspülen externen Farbstoff mit farbstofffreie Kochsalzlösung, so dass 3 vollständige Änderungen der Salzlösung. </li><li> Inkubieren in der letzten Änderung des vergast farbstofffreie Kochsalzlösung für 10 bis 15 min die hartnäckigsten Farbstoff Kontamination zu ermöglichen, von exponierten / externen Membranen auszulaugen. </li><li> Entfernen Sie nicht internalisierte Farbstoff noch auf Membranen mit einem Maskierungsmittel (sulfobutylated Beta-Cyclodextrin, 1 mM, 5 min) in Kochsalzlösung. </li><li> Übertragen Sie die Aufnahmekammer auf die Bühne eines aufrechten Epifluoreszenzmikroskope und greifen in die Kammer mit der Bühne / Dia-Bewegungsmechanismus. </li><li> Illuminate die Vorbereitung mit Anregungslicht geeignet für den Styrylfarbstoffs. Verwenden Sie ein 10X oder 25X Fluoreszenzmikroskopobjektiv , um die Follikel Kennzeichnung (Abbildung 1) zu beobachten. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Hier haben wir eine relativ einfache Herstellung entwickelt, die schnell zerlegt werden kann, hat eine geringe Dichte und Haarfollikel ermöglicht relativ selektive mechanische Stimulation einer kleinen Anzahl von Haarfollikeln. Es ist leicht zugänglich für elektrophysiologische Aufzeichnung und Live-Zell - Fluoreszenz - Bildgebung, einschließlich der Antworten Anwendung zu färben die mechanisch stimuliert Haarfollikel, dh Bildgebung Follikel mit definierten elektrophysiologischen Reaktionen sichtbar zu machen. Während wir noch nicht getan haben, scheint dieses System auch leicht zugänglich, um die sensorischen Nerven für einzelne Einheit (Einzel sensorischen Axon) Aufnahme Unterteilung und gezielte GFP-Expression unter Verwendung von für die Visualisierung sensorischer Terminal endet Morphologie. Wir haben die Ohrhautpräparat 7 verwendet die Eigenschaften der Internalisierung und Freisetzung der fluoreszierenden Membran styryl pridinium Farbstoffe zu untersuchen, eine Technik , die ursprünglich zu studieren lokalisierten Vesic entwickeltle Membran - Recycling in der synaptischen Terminals 8. In Synapsen wird Bildgebung auch bei gleichzeitiger Aufnahme von elektrophysiologischen Reaktionen in identifizierten Terminals 8,9 leicht kombiniert. Es war in diesen frühen Studien , die wir zum ersten Mal die Farbstoffe auch durch mechanosensorischen Endungen 10 internalisiert festgestellt wurden. Für sensorische Neuronen in Kultur und in Cochlea Haarzellen, viel von der Markierung durch Styryl pyridinium Farbstoffe scheint Farbstoffe , die durch die mechanosensorischen Kanäle beinhalten, die sie dann 11,12 blockieren. Die Farbstoffe beschriften dann intrazellulären Membranen, und diese Kennzeichnung ist irreversibel. In Haarzellen jedoch , die nicht mechanisch 13,14 stimuliert werden und in ausdifferenzierten primären sensorischen Nervenendigungen in situ, beispielsweise Ia Digungen in Muskelspindeln 15 und in den lanceolate Digungen hier 7 scheint Styrylfarbstoff Kennzeichnungs Membran Endozytose zu reflektieren, da die Kennzeichnung ist reversibel und blockiert nicht die mechanosensorischen responses 7,15,16. Während einige Farbstoff Internalisierung durch Kanal Permeation in diesen Endungen nicht vollständig ausgeschlossen werden kann, ist es von der weiterhin Brennen während der Farbstoff Inkubation und die Reversibilität der Kennzeichnung deutlich , dass die große Mehrheit der Etikettierung in differenzierten Terminals in situ durch Internalisierung mit Recycling - Vesikel Membran. Somit ist diese einfache Technik für den kombinierten elektrischen und optischen Überwachung einer Reihe von mechanosensorischen Terminalfunktionen in ex vivo Gewebe ohne weiteres eingesetzt. Wie bei den meisten praktischen Techniken, Reproduzierbarkeit Wiederholung und Übung erfordern. Einige der wichtigsten Punkte wert besondere Aufmerksamkeit wird nun beschrieben. Während der Präparation und Aufnahme - Session, maximieren die Lebensfähigkeit des Gewebes und das Überleben durch die Vorbereitung zu gewährleisten ständig mit Kochsalzlösung durchströmt wird , vollständig mit 95% O 2/5% CO 2 gesättigt. Sicherstellen, dass die Haarfollikel nicht während dieses Prozesses verschoben, which will sensorischen Ende Brennen stimulieren. Verwenden Sie entweder eine kontinuierliche, Laminar-Flow-Perfusions-System oder sorgfältig Blase Gas durch das Organbad mit feinen Schlauch in einem Abstand von der Vorbereitung, oder sorgfältig aktualisieren Lösungen für jeden 20-30 Minuten, zu jeder Zeit die Vorbereitung unter der Salzoberfläche zu halten. Absaug- Aufzeichnungselektroden werden durch Modifizieren scharfe Elektrode Borosilikat-Pipetten normalerweise für die intrazelluläre Aufnahme verwendet gemacht. Zuerst sorgfältig die scharfen Spitzen mit # 3 Zange abbrechen die entsprechende Innendurchmesser zu geben, die Nerven und Feuerpolitur durch sehr kurze (&lt;1 sec) Exposition gegenüber Bunsenbrennerflamme zu passen (siehe 2.4 und 2.5). Um ein gutes Signal-zu-Rausch-Verhältnis erhalten, wenn die Aufzeichnung, ist es wesentlich, dass die elektrische Impedanz (Widerstand) in diesen beiden Elektroden sowohl maximiert und gleich. Tun Sie dies, indem die Aufmerksamkeit auf die folgenden in den beiden Elektroden. Für die Aufzeichnungselektrode, sicherzustellen, der Innendurchmesser eine eng anliegende Passform für die Nerven ist, und die maximale Länge neRVE wird in die Aufzeichnungselektrode gezogen. Versuchen Sie, das Bindegewebe rund um die Nerven zu verwenden, um effektiv die Elektrodenspitze abzudichten. Alternativ oder zusätzlich zeichnen das schmale Ende eines geeigneter Größe, verjüngte Stück Fettgewebe in neben dem Nerv. Dann stecken Sie die Elektrodenspitze durch Anlegen starken Sog für ~ 1 min mit einer 50-ml-Spritze mit dem Rohr befestigt. Für eine gut abgedichtete Spitze wird stark abgesaugt wird einfach die Wirksamkeit des Steckers zu stärken und wird nicht mehr flüssig oder Nerv ziehen in. Um Nervenschäden zu vermeiden, sollten Sie jedoch, dass das Bindegewebe den Nerv von Kompression auf das umgebende Material und EAM Knorpel abzufedern. Die indifferente Elektrode sollte der Widerstand / Impedanz der Aufzeichnungselektrode so dicht wie möglich nachahmen. Dies geschieht durch vorsichtiges Feuerpolieren der Spitze so klein eine Öffnung wie möglich geholfen, ohne es wirklich abdichten. Wenn weitere Widerstand erforderlich ist, dann stecken Sie das Ende der indifferenten Elektrode mit adipose Bindegewebe, wie oben für die Aufzeichnungselektrode beschrieben. Die elektrokeramischer gibt exquisite Kontrolle über mechanische Verschiebung, sowohl räumlich als auch zeitlich. Achten Sie jedoch darauf elektrische Verbindungen herstellen - hohe Temperaturen zerstören sie, also nicht Lötzinn verwenden. Verwenden Sie mit Metall beladene Epoxy-Kleber, oder verwenden Sie einen Fachsteckmuffe vom Lieferanten empfohlen. Dadurch wird es sowohl fest halten und die elektrische Verbindung herzustellen. Bringen Sie das Glas anregende Sonde an die elektrokeramischer mit Standard-Epoxidharz. Feuer-Politur das Ende eines Standard-10 cm x 1,5 mm Durchmesser Borosilikat Glaskapillarröhren zur Herstellung von Patch oder scharfe Elektroden für elektrophysiologische Aufzeichnung verwendet, um das Risiko von Gewebeschäden zu minimieren. Wenn einzelne Haarfollikel Stimulation erforderlich ist, Feuerpolitur der Spitze ein einzelnes Haar zu passen, und die Sonde mit einem einzigen Haar in die offene Öffnung positionieren. Dies gibt exquisite Kontrolle über ein einzelnes Haar. Für Styryl dye Etikettierung ist es im Allgemeinen gleichmäßigere in Geweben von jungen Tieren. Es ist nicht ganz klar, warum, aber dies spiegelt wahrscheinlich weniger mechanische Trauma und effektiver tiefe Gewebeentnahme aus den jüngeren Geweben. Seien Sie gründlich in die schaumige Schicht ähnelnden expandiertem Polystyrol Entfernen der Haarfollikel Basen liegt. Vermeiden Sie jedoch zu stark sein, da dies die Nervengeflechte Schicht und die damit verbundenen lanceolate Terminals Risiken zu entfernen. Wenn es wenig oder keine elektrische Antwort auf Haarfollikel Bewegung ist, und Styrylfarbstoff Anwendung führt zur überwiegenden Kennzeichnung Talgdrüsen (gelb / weiß), mit ausgeprägtem Eigenfluoreszenz der Basis des Haarschaftes anstatt lanceolate Digungen (orange / gelb), überenthusiastische Clearance hat die darunter liegende Gewebe beschädigt. Schließlich stark ein Farbstoff-Chelatbildner vor Bildgebung verbessert den Bildkontrast und die Qualität der endgültigen Bilder. Diese Technik könnte in einer Reihe von weiteren Studien nützlich sein. Diese Could umfassen zum Beispiel für den mechanosensorischen Kanal-Screening (n) verantwortlich für die Strecke hervorgerufenen Reaktionen, durch die Zubereitung mit pharmakologischen Liganden selektiv für Kandidatenkanälen Inkubation oder Screening-Mauslinien mit solchen Kanälen genetisch gelöscht. Letzteres könnte mit Fluoreszenz Beurteilung von Änderungen in Terminal Morphologie kombiniert werden durch genetische Manipulation in Mauslinien, zB mit Npy2r gebundenen GFP - Expression 17. Ein letztes Beispiel kann die Rolle der synaptic-like Vesikel (SLVs) 7 in diesen lanceolate Terminals Untersuchung durch die Wirkung von Modulatoren der SLV Umsatz untersucht (Ca, Mg, Latrotoxin, Glutamat - Rezeptor - Liganden) auf Dehnung hervorgerufenen Reaktionen und styryl Farbstoffaufnahme /Freisetzung. Somit eröffnet diese neue Technik eine Reihe von potentiell interessante Wege in der Forschung in den Neurowissenschaften mechansensory auf.

Die lanceolate Terminals sensorischer Axone Innervation Haarfollikeln bei Säugetieren Palisaden bilden um das Haar-Welle Epithel. Ihr Zweck ist, mechanische Verschiebung der Haare zu erkennen, sie umgeben. Sie sind eine Mischung aus schnell und langsam Endungen Anpassung, die überwiegend kurze Ausbrüche von Aktivität in Reaktion auf Haar Bewegung erzeugen. Aktivität aufhört sehr schnell, wenn die Bewegung stoppt, sogar in Gegenwart von fort Verschiebung. Hier beschreiben wir die Entwicklung dieses murine Ohrmuschel Modell für Korrelat Studien von Struktur und Funktion in lanceolate Terminals. Die Ohrmuschel hat viele vorteilhafte Eigenschaften für diese Endungen zu studieren. Erstens ist die Ohrmuschel im wesentlichen zwei Schichten der Haut angelagert back-to-back, mit wenig anderes Gewebe zwischen den Zugang zu den Follikeln und die Anschlüsse zu stören. Die Haut ist sehr dünn und leicht durch minimale Mengen an harten Bindegewebe seziert. Die Innervation ist leicht zugänglich und erkennbar. Während Haar follicles vorhanden sind, sind sie relativ dünn verteilt, mechanisch die Stimulation der einzelne oder kleine Gruppen von Follikeln zu erleichtern. Die dünne darunter liegende Hautschicht ergibt eine gute Zugänglichkeit zu den Nervenendigungen mit pharmakologischen Medikamenten und Farbstoffen. Das macht sie besonders geeignet für die Bildgebung Studien unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie. Die Bildgebung kann entweder in lebenden Terminals sein, oder nach der Fixierung und weitere histologische Verarbeitung. Die Antworten von mechanosensorischen Neuronen Innervation Haarfollikeln traditionell vibrissae 1,2 und in geringerem Ausmaß, in isolierten Hautpräparate 3,4 in Nagetieren untersucht worden. Diese haben uns gelehrt, viel über die allgemeinen Grundsätze der mechanosensorischen Physiologie in den Nervenendigungen in den Haarschaft umgibt. Die vibrissal Vorbereitung ermöglicht exquisite Kontrolle über die Bewegung eines einzelnen Haarfollikel. Jedoch kann es schwierig sein, die Ausgabe aufgrund seiner Komplexität zu entschlüsseln, wie vibrissalFollikel enthalten mindestens 8 verschiedene Arten von anatomisch verschiedene mechanosensorischen Ende 5 und die Abstimmung dieser morphologischen Typen auf bestimmte elektrophysiologischen Reaktionen ist nach wie vor umstritten. Die Mäusehaut / saphenus Vorbereitung wird am häufigsten in seiner enthaarte Zustand verwendet Antworten Berührung und Schmerz zu untersuchen. Die Innervation der Haarfollikel in einem solchen Präparat ist weniger komplex , aber die Dichte der Haarfollikel, sowie das Vorhandensein von drei verschiedenen Follikel - Typen (Wache, Ahle / auchene und Zick - Zack - Haare) in solcher Nähe 6, bedeutet , dass die spezifischen Antworten des Studiums ein einzelner Follikel oder einzelne Art von Ende herausfordernd wieder. Darüber hinaus beinhaltet diese Vorbereitung eine komplexe Präparation. Schließlich Zubereitungen in sowohl vibrissal und andere Haut, ist es schwierig , die Enden , während der ex vivo Präparationen noch am Leben sind beteiligt zu visualisieren. Somit wird Gewebe Schnitte auch in GFP-exprimierenden Mauslinien erforderlich. Alternavely erfordert es weitere histologische / immunologischen Verarbeitung, wie die Fixierung und / oder Antikörper-Inkubation für Immunofluoreszenz. Wir haben daher die Ohrmuschel Vorbereitung und dem verwendeten elektrischen Aufnahmen von einer eingeschränkten Population von Haarfollikel Afferenzen zu machen und zeigen, dass Membran Radfahren in diesen lanceolate Endungen auftritt, belegt durch die Aufnahme von Styrylpyridinium- Farbstoffe. Schließlich haben wir gezeigt, dass der Farbstoff nicht mit mechanischen Empfindlichkeit nicht beeinträchtigt, was anzeigt, es nicht die Mechanotransduktion Kanäle nicht blockiert. Die Ergebnisse der einfachen Stimulation und Analyseprotokolle dargestellt.

<table><tbody><tr><td>PDMS - Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Flexible, inert, translucent solid silicone polymer.</td></tr><tr><td>No. 3 Dumont forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-20</td><td></td></tr><tr><td>Austerlitz Insect pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage.</td></tr><tr><td>AC Differential Preamplifier</td><td>Digitimer</td><td>Neurolog NL104A</td><td>Amplifying the size of the incoming afferent electroneurogram. Differential recording minimises the extraneous electrical noise and baseline drift.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>High/Low-pass Filter</td><td>Digitimer</td><td>Neurolog NL125</td><td>Signal conditioning, by reducing extraneous electrical noise to ensure best signal to noise ratio.</td></tr><tr><td>Spike Trigger</td><td>Digitimer</td><td>Neurolog NL201</td><td>Sets the event detector threshold and displays it on the oscilloscope. This shows the action potential detection efficacy.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Audio Amplifier &amp;amp; speakers</td><td>Digitimer</td><td>Neurolog NL120S</td><td>Useful audio monitoring for the presencec of electrical firing of the sensory endings while adjusting the mechanical stimulation preparation down the microscope&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Digitimer</td><td>PM3380A</td><td>We use this old model but any standard oscilloscope will suffice.</td></tr><tr><td>Piezo electroceramic&amp;nbsp; wafer</td><td>Morgan Electroceramics, Southampton UK</td><td>PZT507</td><td>Electrophysiology/computer interface</td></tr><tr><td>Piezo electroceramic&amp;nbsp; powersupply</td><td>Home made</td><td></td><td>0-200 V DC output to drive the ceramic wafer displacement, with variable electronic control of output via recording/stimulation software and computer interface. We use Spike2 software and 1401micro computer interface.</td></tr><tr><td>Electrophysiology Software</td><td>Cambridge Electronic Design (CED)</td><td>Spike2 v7</td><td>Electrophysiology recording, stimulation and data analysis software</td></tr><tr><td>Laboratory interface</td><td>Cambridge Electronic Design (CED)</td><td>1401 micro</td><td>Electrophysiology interface, between the amplifier/filters and the computer. It inputs the electroneurogram and also drives the electroceramic movement.</td></tr><tr><td>FM1-43/Synaptogreen C4</td><td>Biotium/Cambridge Bioscience</td><td>BT70020</td><td>Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis.</td></tr><tr><td>Advasep 7</td><td>Biotium/Cambridge Bioscience</td><td>BT70029</td><td>A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (&amp;amp; other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence.</td></tr><tr><td>Retiga Exi Fast 1394</td><td>Qimaging</td><td></td><td>Monochrome, cooled CCD camera - basic model</td></tr><tr><td>Volocity 3D Image Analysis Software</td><td>Perkin Elmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>Image capture and analysis software.</td></tr></tbody></table>

combined recording of mechanically stimulated afferent output and nerve terminal labelling in mouse hair follicle lanceolate endings

Eine neuartige Dissektion und Aufzeichnungstechnik wird zur Überwachung afferenten Brennens durch mechanische Verschiebung der Haare in der Maus Ohrmuschel evozierten beschrieben. Die Technik ist sehr kostengünstig und einfach mit Materialien, die üblicherweise in den meisten Elektro Laboratorien oder leicht gekauft fand geführt. Die Präparation ist einfach und schnell, mit der mechanischen durch eine generische elektrokeramischer Wafer durch proprietäre Software gesteuert bereitgestellt Verschiebung. Die gleiche Software auch Aufzeichnungen und analysiert die electroneurogram ausgegeben. Die Aufzeichnung der Aktivität hervorgerufenen Nerven ist über einen kommerziellen Differenzverstärker zu feuerpolierten Standardglas-Mikroelektroden verbunden. Hilfreiche Tipps für die Verbesserung der Qualität der Zubereitung, die Stimulation und die Aufnahmebedingungen gegeben Aufnahmequalität zu optimieren. Das System eignet sich zur Bestimmung der elektrophysiologischen und optischen Eigenschaften von lanceolate Anschlüsse der Palisadendigungen der Haarfollikel sowie dieErgebnisse aus ihrer pharmakologischen und / oder genetische Manipulation. Ein Beispiel für die Kombination von elektrischen Aufzeichnung mit mechanischer Stimulation und Markierung mit einem Styrylpyridinium- Vitalfarbstoff gegeben.

Die elektroAufnahmeAnordnung, mit dem subkutanem Fettgewebe die Haarfollikel freizulegen, ist in 1A gezeigt. Ein Teil dieses freiliegenden Bereich mit einer höheren Vergrößerung in Hellfeldbeleuchtung in 1B gezeigt. die Ohrmuschel Folding-Marge in diesem Bereich auf sich selbst nach oben und zurück macht die Epidermis. Dies positioniert die Haare am Rand des Falzes horizontal, in einer idealen Situation für mechanische Stimulation mit einem stumpfen Sonde (nicht gezeigt) vorstehen. 1C zeigt , dass nach der Farbstoff Belichtung und der Rand in die aufgeklappte Position zurückkehrt wiederum die Follikel stimuliert in dieser Position sind mit einem Styryl pyridinium-Farbstoff markiert. Elektron von Präparaten zeigen in der Regel laufenden AP - Aktivität auch in Abwesenheit von auferlegte Bewegung der Glasfasersonde, einschließlich APs der größten Größe (2A <strOng&gt; i-iii). Aktivität erfolgt bei einer Geschwindigkeit von etwa 10 bis 20 Impulse / s ( &quot;Spikes&quot; Trace), keine Struktur oder Anzeichen von Tonus zeigt, wie die Autokorrelation für die Intervalle zwischen den Perioden der Stimulation sind recht flach. Während 5 Hz, 100 &amp; mgr; m mechanische Stimulation der Haarwellen, in der Regel Gesamtleistung steigt auf 20-50 Impulse / sec, oder 4-10 pro Sinuszyklus. Der Bau der Zyklus Histogramme dann zeigt starke Mitnahme (so genannte &quot;phasenverriegelnden &#39;) der Antworten (Abbildung 2Bi-iii)). Das ist ziemlich wiederholbar, obwohl die Phase der Wellenform , bei der die Antworten gesperrt sind nach ihrer Position abhängt, das heißt , an welcher Stelle in der Bewegung der schwingenden Sonde kontaktiert er das Haar. Eine einfache Schwellendetektion (horizontale Linie , die die Neurogramms Spuren in einer Kreuzung (i-iii)) wurde für diese Analyse verwendet. Allerdings kann die Aufnahme-Software-Funktionalität oft in eine anspruchsvollere Art und Weise verwendet werden, umdiskriminieren Merkmale von Spike Größe und Form. Dies kann dann Antworten von bestimmten Afferenzen isolieren, indem diese Eigenschaften Pseudo-Single-Unit-Aufzeichnung Analyse durchgeführt werden zu können. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53854/53854fig1.jpg" /> Abb . 1: Elektrophysiologische Aufnahmeanordnung und N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (Dibutylamino) styryl) Pyridinium Dibromid Labeling des Haarfollikels Afferent Lanceolate Endungen (A) Eine Ohrmuschel Vorbereitung für eine elektrophysiologische Versuchsaufbau zeigt die Ohrmuschel Orientierung, die Lage der Nerven, die Aufzeichnungselektroden und der belichtete Bereich des Follikel Innervation nach Entfernen Fettgewebe. (B) Mehrere Haarfollikel sind in Hellfeld - Beleuchtung im Bereich der darüberliegenden Fettgewebe bis in die Dermis gelöscht. Die dunkle, in der Regel zweilappig, Formen sind Talgdrüsen. ( <stRong&gt; C) vergrößerte Ansicht des eingerahmten Bereich in B) zeigt zwei lanceolate mit dem Styryl - Farbstoff markiert Digungen N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (Dibutylamino) styryl) pyridinium - dibromid und nach mechanischer Stimulation durch Epifluoreszenzmikroskopie abzubildenden . Ab 7, mit freundlicher Genehmigung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53854/53854fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53854/53854fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53854/53854fig2.jpg" /> Abbildung 2: (A) Stimulus-evozierte Aktivität von der Maus Pinna aufgezeichnet. (Ai-iii) Beispiele, entnommen aus drei verschiedenen Experimenten, der Tätigkeit von kontinuierlichen Neurogramme von Ohrmuschel in Standard Liley der Salzlösung. Jeder Datensatz zeigt einen 5 sec Schnitt etwa 5 Minuten nach dem Start der Aufzeichnung, einschließlich einer 3 Sekunden Dauer von Sinus Verschiebung alsMall Anzahl von Haarwellen. Die mechanische Stimulation wurde alle 30 Sekunden während des gesamten kontinuierlichen Aufzeichnung wiederholt, die in der Regel für 1-2 Stunden dauerte. Benutzerdefinierte Skriptdateien markiert einzelne Ereignisse, die eine Schwelle durch die horizontalen Cursor (Spikes), sowie den Beginn eines jeden sinusförmigen Zyklus (Periode) eingestellt gekreuzt. (AIV) Das Befehlssignal für Sinus Verschiebung. (B) Analyse von Stimulus-evozierte Schmettern Aktivität. (Bi-iii) Zyklus Histogramme in 3 ° Bins aus den Neurogramms Proben (Ai-iii) jeweils konstruiert, die Antworten von mutmaßlichen lanceolate Endungen auf mechanische Stimulation von 5 Hz Sinus Verschiebung von Haarwellen durch eine Glassonde zeigt. Beachten Sie die markierte Phasenverriegelung, in verschiedenen Phasen des Zyklus, in Abhängigkeit von ihrer Position relativ zu der Ausgangsposition der mechanischen Sonde. (Biv) Normalized Sonde Verschiebung Sinuskurve; die tatsächliche Amplitude betrug ungefähr 100. 1, m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53854/53854fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53854/53854fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.

Kombinierte Aufnahme von Mechanisch Stimulated Afferent Output und Nervenendigung Kennzeichnung Maus Haarfollikel Lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...

combined-recording-mechanically-stimulated-afferent-output-nerve

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.4K Aufrufe.  University of Aberdeen. A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.

Serie: Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the postsynaptic activity of a single ribbon synapse 1-4. Ribbon synapses of sensory cells release neurotransmitter continuously, the rate of which is modulated in response to graded changes in IHC membrane potential 5. Ribbon synapses have been shown to operate by multivesicular release, where multiple vesicles can be released simultaneously to evoke excitatory postsynaptic currents (EPSCs) of varying amplitudes 1, 4, 6-11. Neither the role of the presynaptic ribbon, nor the mechanism underlying multivesicular release is currently well understood.
The IHC is innervated by 10-20 auditory nerve fibers, and every fiber contacts the IHC with a unmyelinated single ending to form a single ribbon synapse. The small size of the afferent boutons contacting IHCs (approximately 1 &mu;m in diameter) enables recordings with exceptional temporal resolution to be made. Furthermore, the technique can be adapted to record from both pre- and postsynaptic cells simultaneously, allowing the transfer function at the synapse to be studied directly 2. This method therefore provides a means by which fundamental aspects of neurotransmission can be studied, from multivesicular release to the elusive function of the ribbon in sensory cells.

Whole-cell patch-clamp recordings from auditory nerve fiber dendrites at the inner hair cell ribbon synapse in the mammalian cochlea.

Postsynaptische Recordings am afferenten Dendriten Kontaktaufnahme mit Cochlear inneren Haarzellen: Monitoring multivesikulären Veröffentlichung in einem Ribbon Synapse

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials and Electrocorticograms in Response to Nociceptive Laser Stimuli from Freely Moving Rats

Electrocortical responses, elicited by laser heat pulses that selectively activate nociceptive free nerve endings, are widely used in many animal and human studies to investigate the cortical processing of nociceptive information. These laser-evoked brain potentials (LEPs) consist of several transient responses that are time-locked to the onset of laser stimuli. However, the functional properties of the LEP responses are still largely unknown, due to the lack of a sampling technique that can simultaneously record neural activities at the surface of the cortex (i.e., electrocorticogram [ECoG] and scalp electroencephalogram [scalp EEG]) and inside the brain (i.e., local field potential [LFP]). To address this issue, we present here an animal protocol using freely moving rats. This protocol is composed of three main procedures: (1) animal preparation and surgical procedures, (2) a simultaneous recording of ECoG and LFP in response to nociceptive laser stimuli, and (3) data analysis and feature extraction. Specifically, with the help of a 3D-printed protective shell, both ECoG and LFP electrodes implanted on the rat&#39;s skull were securely held together. During data collection, laser pulses were delivered on the rat&#39;s forepaws through gaps in the bottom of the chamber when the animal was in spontaneous stillness. Ongoing white noise was played to avoid the activation of the auditory system by the laser-generated ultrasounds. As a consequence, only nociceptive responses were selectively recorded. Using the standard analytical procedures (e.g., band-pass filtering, epoch extraction, and baseline correction) to extract stimulus-related brain responses, we obtained results showing that LEPs with a high signal-to-noise ratio were simultaneously recorded from ECoG and LFP electrodes. This methodology makes the simultaneous recording of ECoG and LFP activities possible, which provides a bridge of electrocortical signals at the mesoscopic and macroscopic levels, thereby facilitating the investigation of nociceptive information processing in the brain.

We developed a technique that simultaneously records both electrocorticography and local field potentials in response to nociceptive laser stimuli from freely moving rats. This technique helps establish a direct relationship of electrocortical signals at the mesoscopic and macroscopic levels, which facilitates the investigation of nociceptive information processing in the brain.

Gleichzeitige Aufnahmen von kortikalen lokales Feld Potentialen und Electrocorticograms in Reaktion auf Reize der nozizeptiven Laser von frei beweglichen Ratten

Electrocortical responses, elicited by laser heat pulses that selectively activate nociceptive free nerve endings, are widely used in many animal and ...

Verhalten

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

Understanding vestibular hair cells function under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this function is a vital step in the development of preventative approaches and/or novel therapeutic strategies. However, the majority of studies looking at abnormal vestibular function have not been at the cellular level but focused primarily on behavioral assays of vestibular dysfunction such as gait analyses and vestibulo-ocular reflex performance. While this work has yielded valuable data about what happens when things go wrong, little information is gleaned regarding the underlying causes of dysfunction. Of the studies that focus on the cellular and subcellular processes that underlie vestibular function, most have relied on acutely isolated hair cells, devoid of their synaptic connections and supporting cell environment. Therefore, a major technical challenge has been access to the exquisitely sensitive vestibular hair cells in a preparation that is least disrupted, physiologically. Here we demonstrate a semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium that retains the local micro-environment including hair cell/primary afferent complexes.

Analysis of vestibular hair cell function is complicated by their location deep within the hardest part of the skull, the petrous temporal bone. Most functional hair cell studies have used acutely isolated hair cells. Here we describe a semi-intact preparation of mouse vestibular epithelium for electrophysiological and two-photon microscopy studies.

Eine Isolierte Semi-intakt Vorbereitung der Maus Vestibuläre Sinnesepithel für Elektrophysiologie und hochauflösende Zwei-Photonen-Mikroskopie

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel cell clusters), sebaceous glands, nerves and nerve endings, and capillaries. The spatial arrangement of these structures is tightly controlled on a microscopic scale - as seen, for example, in the orderly arrangement of cell types within a single hair follicle - and on a macroscopic scale - as seen by the nearly identical orientations of thousands of hair follicles within a local region of skin. Visualizing these structures without physically sectioning the skin is possible because of the 2-dimensional geometry of this organ. In this protocol, we show that mouse skin can be dissected, fixed, permeabilized, stained, and clarified as an intact two dimensional object, a flat mount. The protocol allows for easy visualization of skin structures in their entirety through the full thickness of large areas of skin by optical sectioning and reconstruction. Images of these structures can also be integrated with information about position and orientation relative to the body axes.

Mammalian skin contains a diverse array of structures - such as hair follicles and nerve endings - that exhibit distinctive patterns of spatial organization. Analyzing skin as a flat mount takes advantage of the 2-dimensional geometry of this tissue to produce full-thickness high-resolution images of skin structures.

Wohnung Berg-Imaging von Mäusehaut und ihre Anwendung auf die Analyse von Mustern und die Haarfollikel Sinnes Axon Morphologie

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional afferent fibers monitor other characteristics of the muscle environment, including metabolite buildup, temperature, and nociceptive stimuli. Overall, abnormal activation of sensory neurons can lead to movement disorders or chronic pain syndromes. We describe the isolation of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and nerve for in vitro study of stretch-evoked afferent responses in the adult mouse. Sensory activity is recorded from the nerve with a suction electrode and individual afferents can be analyzed using spike sorting software. In vitro preparations allow for well controlled studies on sensory afferents without the potential confounds of anesthesia or altered muscle perfusion. Here we describe a protocol to identify and test the response of muscle spindle afferents to stretch. Importantly, this preparation also supports the study of other subtypes of muscle afferents, response properties following drug application and the incorporation of powerful genetic approaches and disease models in mice.

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons are involved in proprioceptor signaling and also report on metabolic state and injury related events. We describe an adult mouse in vitro muscle-nerve preparation for studies on stretch-activated muscle afferents.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Adult Maus Muskel-Nerven Vorbereitung für das Studium der Brenneigenschaften des Muskel-Afferenzen

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The approach allows unbiased identification and functional characterization of individual colorectal afferents. Extracellular recordings of propagated action potentials (APs) that originate from one or a few afferent (i.e., single-fiber) receptive fields (RFs) in the colorectum are made from teased nerve fiber fascicles. The colorectum is removed with either the pelvic (PN) or lumbar splanchnic (LSN) nerve attached and opened longitudinally. The tissue is placed in a recording chamber, pinned flat and perfused with oxygenated Krebs solution. Focal electrical stimulation is used to locate the colorectal afferent endings, which are further tested by three distinct mechanical stimuli (blunt probing, mucosal stroking and circumferential stretch) to functionally categorize the afferents into five mechanosensitive classes. Endings responding to none of these mechanical stimuli are categorized as mechanically-insensitive afferents (MIAs). Both mechanosensitive and MIAs can be assessed for sensitization (i.e., enhanced response, reduced threshold, and/or acquisition of mechanosensitivity) by localized exposure of RFs to chemicals (e.g., inflammatory soup (IS), capsaicin, adenosine triphosphate (ATP)). We describe the equipment and colorectum&#8211;nerve recording preparation, harvest of colorectum with attached PN or LSN, identification of RFs in the colorectum, single-fiber recording from nerve fascicles, and localized application of chemicals to the RF. In addition, challenges of the preparation and application of standardized mechanical stimulation are also discussed.

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.

In-vitro-Funktionelle Charakterisierung von Maus Colorectal Afferente Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

Medizin

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles in the skin of the mouse pinna. The preparation is simple and relatively fast, reliably yielding extensive regions of multiple labeled units of living nerve terminals to study uptake and release of styryl pyridinium dyes extensively used in studies of vesicle recycling. Subdividing the preparations before labeling allows test vs. control comparisons in the same ear from a single individual. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the labeling and the imaging parameters. This new system is suitable for assaying pharmacologically and mechanically-induced uptake and release of these vital dyes in lanceolate terminals in both wild-type and genetically modified animals. Examples of modulatory influences on labeling intensity are given.

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

Optische Überwachung der Lebensnervenendigung Beschriften in Haarfollikel Lanceolate Endigungen der<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Maus-Ohr-Haut

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments

Afferent nerves not only convey information concerning normal physiology, but also signal disturbed homeostasis and pathophysiological processes of the different organ systems from the periphery towards the central nervous system. As such, the increased activity or &#39;sensitization&#39; of mesenteric afferent nerves has been allocated an important role in the pathophysiology of visceral hypersensitivity and abdominal pain syndromes.
Mesenteric afferent nerve activity can be measured in vitro in an isolated intestinal segment that is mounted in a purpose-built organ bath and from which the splanchnic nerve is isolated, allowing researchers to directly assess nerve activity adjacent to the gastrointestinal segment. Activity can be recorded at baseline in standardized conditions, during distension of the segment or following the addition of pharmacological compounds delivered intraluminally or serosally. This technique allows the researcher to easily study the effect of drugs targeting the peripheral nervous system in control specimens; besides, it provides crucial information on how neuronal activity is altered during disease. It should be noted however that measuring afferent neuronal firing activity only constitutes one relay station in the complex neuronal signaling cascade, and researchers should bear in mind not to overlook neuronal activity at other levels (e.g., dorsal root ganglia, spinal cord or central nervous system) in order to fully elucidate the complex neuronal physiology in health and disease.
Commonly used applications include the study of neuronal activity in response to the administration of lipopolysaccharide, and the study of afferent nerve activity in animal models of irritable bowel syndrome. In a more translational approach, the isolated mouse intestinal segment can be exposed to colonic supernatants from IBS patients. Furthermore, a modification of this technique has been recently shown to be applicable in human colonic specimens.

In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments

Mesenteric afferent nerves convey information from the gastrointestinal tract towards the brain regarding normal homeostasis as well as pathophysiology. Gastrointestinal afferent nerve activity can be assessed by mounting isolated intestinal segments with attached afferent nerves into an organ bath, isolating the nerve, and assessing basal as well as stimulated activity.

In - vitro - Aufnahme von Mesenteriale afferenten Nervenaktivität in Maus - Jejunal und Kolon - Segmente

Afferent nerves not only convey information concerning normal physiology, but also signal disturbed homeostasis and pathophysiological processes of the ...

Terminal H-reflex Measurements in Mice

The Hoffmann reflex (H-reflex), as an electrical analog to the stretch reflex, allows electrophysiological validation of the integrity of neural circuits after injuries such as spinal cord damage or stroke. An increase of the H-reflex response, together with symptoms like non-voluntary muscle contractions, pathologically augmented stretch reflex, and hypertonia in the corresponding muscle, is an indicator of post-stroke spasticity (PSS).
In contrast to rather nerve-unspecific transcutaneous measurements, here, we present a protocol to quantify the H-reflex directly at the ulnar and median nerves of the forepaw, which is applicable, with minor modifications, to the tibial and sciatic nerve of the hindpaw. Based on the direct stimulation and the adaptation to different nerves, the method represents a reliable and versatile tool to validate electrophysiological changes in spasticity-related disease models.

The clinical evaluation of spasticity based on the Hoffmann reflex (H-reflex) and using electrical stimulation of peripheral nerves is an established method. Here, we provide a protocol for a terminal and direct nerve stimulation for H-reflex quantification in the mouse forepaw.

Terminale H-Reflex-Messungen bei Mäusen

The Hoffmann reflex (H-reflex), as an electrical analog to the stretch reflex, allows electrophysiological validation of the integrity of neural circuits ...

Biologie

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicles

Source: Bewick, G. et al., <a href="https://app.jove.com/v/53854">Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates the combined recording of mechanically stimulated afferent output and nerve terminal labeling in the hair follicles of a mouse pinna. It outlines the steps involved in the mechanical stimulation of hair follicle nerve terminals before and after exposure to a fluorescent membrane dye, electrophysiology recording of the generated action potentials, and visualization of the nerve terminal labeling in the hair follicles.

Kombinierte Aufzeichnung der mechanisch stimulierten afferenten Ausgabe und der Markierung der Nervenenden in Haarfollikeln von Mäusen

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Electrophysiological Recording ...

Kombinierte Aufnahme von Mechanisch Stimulated Afferent Output und Nervenendigung Kennzeichnung Maus Haarfollikel Lanceolate Endings

Zusammenfassung

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