Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der optischen Mikroskopie zu beantworten, z. B. wie man Bilder mit superAuflösung sowie FRET-Bilder mit demselben Mikroskop nimmt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir drei verschiedene Bildgebungsmodule zu einem Mikroskop kombinieren konnten, wodurch die Gesamtkosten deutlich reduziert werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Zusammenstellung des Erregungspfads schwer zu erlernen ist.
Sie erfordern eine ordnungsgemäße Auswahl der Teile und eine empfindliche optische Ausrichtung. Installieren Sie zunächst eine Datenerfassungskarte über eine PCI-Schnittstelle und verbinden Sie sie mit ihr, um die Laser mit dem Computer zu verbinden. Steuern Sie das Ein- und Ausschalten der Laser durch den Transistor-Transistor-Logikausgang und deren Leistungseinstellung durch den analogen Ausgang dieser Karte.
Als nächstes bereiten Sie einen vibrationsisolierten optischen Tisch mit Spiegeln und Strahlsplittern vor, wie hier gezeigt und im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Kombinieren Sie die Laserstrahlen zu einer Singlemode-Lichtwellenleiter, indem Sie zunächst eine Faseradapterplatte in einer Z-Achsen-Übersetzungshalterung montieren. Als nächstes montieren Sie eine achromatische Doppellinse in einer Käfigplatte.
Verwenden Sie eine Verlängerungsstange, um den Adapter und die Linse zu verbinden, um einen Käfig zu bilden. Verwenden Sie dann einen Zoll dicken optischen Pfosten, um den Käfig auf dem optischen Tisch zu montieren. Richten Sie den 647-Nanometer-Laser aus, indem Sie die Komponenten so einstellen, dass sie eine maximale Laserleistung durch die Faser erhalten.
Sobald die Ausrichtung des ersten Lasers abgeschlossen ist, installieren Sie vorübergehend ein Paar Iris und richten Sie den Rest der Laser nacheinander aus. Überprüfen Sie die Ausrichtungseffizienz jedes Lasers mit einem Leistungsmesser. Achten Sie darauf, eine Iris vor der Adapterplatte zu lassen, um die Reflexionen der Laser zu reduzieren.
Entwerfen und installieren Sie anschließend die Vergrößerungslinse, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Um den Astigmatismuseffekt zu erzeugen, der für die Extraktion der Z-Koordinaten jedes einzelnen Moleküls notwendig ist, legen Sie eine 3D-Linse mit einer Brennweite von 10 Metern in die Kassette und legen Sie sie in den Emissionsstrahlpfad ein. Um die Vibrationen bei der sequenziellen multicolor-Epifluoreszenz-Bildgebung zu minimieren, verwenden Sie Emissionsfilter, die in einem Barrierefilterrad neben dem Mikroskop platziert sind.
Zur gleichzeitigen Multicolor-Detektion bei einmolekularen FRET-Experimenten legen Sie einen weiteren Filtersatz in einen Emissionsspalter. Um den Beiläufigswinkel des Anregungslasers auf beugungsbegrenzte Bildgebung mittels Epi-Erregung einzurichten, stellen Sie zunächst den Beifallswinkel des Anregungslasers auf den Epi-Modus im Beleuchtungsarm ein. Lösen Sie anschließend die 3D-Linse aus, und legen Sie den Bypass-Würfel in den Emissionsspalter ein.
Legen Sie dann die Mag-Linse für eine verbreiterte Beleuchtung ein. Nach der Einrichtung nehmen Sie Mehrkanal-, Z-Stack- und/oder Zeitablaufzeiten Ihrer Probe basierend auf den gewünschten Ergebnissen. Um die mehrfarbige Einzelmoleküldetektion von oberflächenimmobilisierten Molekülen einzurichten, bewegen Sie das Filterrad zunächst in eine leere Position.
Dadurch können die Laser passieren. Passen Sie dann den beiläufigen Winkel der Anregungslaser an den Rasenwinkel an, und lösen Sie sowohl die Mag- als auch die 3D-Objektive aus. Als Nächstes können Sie den Dreikanalmodus in den Emissions-Splitter einbinden, indem Sie zuerst den Bypass-Würfel durch einen Kalibrierwürfel ersetzen, der es ermöglicht, dass das gesamte Licht durch alle Kanäle geleitet wird.
Schalten Sie dann die Kamera unter DIC ein und stellen Sie die Blende des Emissionsteilers ein, bis drei vollständig getrennte Kanäle auf dem Bildschirm erscheinen. Drehen Sie die vertikal-horizontalen Einstellregler am Emissionsteiler und richten Sie die drei Kanäle grob aus. Schalten Sie als Nächstes die Kamera aus und ersetzen Sie den Kalibrierwürfel durch den Dreifachwürfel.
Legen Sie eine Probe von 100-Nanometer-Mehrkanalperlen. Bei Anregung mit 488 Nanometern emittieren die 100-Nanometer-Mehrkanalperlen unterschiedliche Wellenlängen des Lichts und ermöglichen eine Dreikanalausrichtung. Schalten Sie dann die Kamera und den 488-Nanometer-Laser ein, zoomen Sie auf eine der hellen Perlen und richten Sie schließlich die drei Kanäle aus, indem Sie die Einstellregler wieder drehen.
Wenn die Probe nun mit einem schwachen Laser verwendet wird, navigieren Sie zu einem Bereich mit einer angemessenen Spotdichte und passen Sie die Laserleistung und Belichtungszeit an, um akzeptable Signal-Rausch- und Photobleichwerte zu erreichen. Verwenden Sie dann die Imaging-Software, um Zeitrafferbilder zu erstellen. Für eine hochauflösende Bildgebung beginnen Sie mit dem Einsetzen der 3D-Linse und entfernen Sie die Mag-Linse.
Bestimmen Sie dann den beiläufigen Winkel des optimalen Anregungslasers als Rasenwinkel. Um die richtige Objektivhöhe für die SR-Bildgebung zu finden, verwenden Sie DIC-Bildgebung, um die mittlere Ebene der Zellen zu finden. Identifizieren Sie die Ebene anhand der Höhe, in der die Zellen transparent werden.
Sobald die gewünschte Brennebene bestimmt ist, beginnen Sie mit der Superauflösungsabbildung. Ändern Sie während der Bildgebung die Leistung des 405-Nanometer-Lasers, um eine angemessene Dichte an blinkenden Flecken zu erhalten. Beginnen Sie mit der Bildgebung ohne violette Laserleistung.
Zählen Sie die Anzahl der blinkenden Flecken in einem bestimmten Zeitraum und erhöhen Sie die violette Laserleistung, so dass die Anzahl der blinkenden Flecken über einer benutzerdefinierten Zählschwelle im Sichtfeld gehalten wird. Analysieren Sie die Daten, indem Sie die Schwerpunkte jedes Spots in den Bildgebungsrahmen erkennen, und extrahieren Sie Z-Werte für jeden Punkt aus x- und Y-Breiten. Erstellen Sie ein rekonstruiertes Bild, und visualisieren Sie Objekte in 3D.
Dieses Mikroskop-Setup ermöglicht einen flexiblen und reproduzierbaren Wechsel zwischen verschiedenen bildgebenden Verfahren, einschließlich konventioneller Epifluoreszenz-Bildgebung, einzelmolekularer Detektions-basierter Super-Resolution-Bildgebung und mehrfarbiger Einzelmolekül-Detektion. Um feinere Details in der molekularen Baugruppe zu enthüllen, kombiniert die superhochauflösende Mikroskopie Tausende von Bildern wie diesem. Diese Bilder werden dann rekonstruiert, um ein endgültiges Bild mit Superauflösung zu erzeugen.
Super-Resolution-Techniken ermöglichen eine hohe räumliche Auflösung und liefern Details, die mit anderen Techniken nicht sichtbar sind. Dies wird in den beiden hier gezeigten Bildern hervorgehoben. Das Bild mit super Auflösung zeigt die gleiche bakterielle regulatorische RNase wie das Epifluoreszenzbild, ermöglicht aber die Detektion einzelner Moleküle.
SmFRET ist eine weitere Methode, die in der Lage ist, eine Auflösung von Angstrom bis Nanometer zu erreichen. Hier wurden gefaltete RNA-Moleküle mit einem grünen Spenderfarbstoff und einem roten Akzeptorfarbstoff beschriftet. Fluoreszenzintensitätsbahnen können aus einzelnen Einzelmolekülen extrahiert werden, wodurch freT-Effizienz als Funktion der Zeit erzeugt wird.
Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lasern gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Augenschutz oder das Senken von Laserkräften sollten immer bei der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.
