Hier verwendeten wir Einzelmolekül-FRET und ortsspezifische Proteinmarkierung über einen natürlichen Aminosäureeinbau, um die Konformationsdynamik von mGluR2 zu untersuchen. Dies ermöglicht es, die Proteindynamik zu untersuchen, ohne die Proteinstruktur zu stören. Die atomare Struktur liefert ein statisches Bild eines Proteins.
Einzelmolekül-FRET ermöglicht es uns jedoch, die gesamte Bandbreite der Proteinbewegung in Echtzeit und Lösung zu visualisieren. Diese Methode kann angewendet werden, um die Dynamik jedes Proteins zu untersuchen. Darüber hinaus kann ein natürlicher Aminosäureeinbau verwendet werden, um Protein-Protein-Interaktionen und das Engineering synthetischer Rezeptoren zu untersuchen.
Das Laden von Proben und die Optimierung der Bildgebung erfordern Geduld und Übung. Markieren Sie zunächst die zu bohrenden Löcher auf dem Glasobjektträger mit einem Marker. Verwenden Sie einen Dremel, um kleine Löcher auf die Rutsche zu bohren, während die Rutsche in Wasser getaucht wird.
Beschallen Sie die Objektträger und Deckblätter 30 Minuten lang in einem Badesonikator bei 23 Grad Celsius in Aceton. Entsorgen Sie Aceton aus dem Objektträger und decken Sie die Gläser ab. Gründlich mit Wasser abspülen und 30 Minuten lang in fünfmoligem Kaliumhydroxid beschallen.
Als nächstes spülen Sie die Objektträger und decken Sie den Slip mit Wasser ab und beschallen Sie ihn zwei Minuten lang mit Methanol. Lassen Sie die mit Methanol gefüllten Gläser bis zum Aminoversalzungsschritt. Frisch zubereitete Aminoversalzungsmischung in den Objektträger geben und Gläser abdecken.
Inkubieren, beschallen und erneut die Objektträger und Deckgläser in einer Aminoversalzungsmischung inkubieren, bevor Sie die Lösung verwerfen. Als nächstes waschen Sie die Gläser mit Methanol, bevor Sie sie mit Wasser füllen. Anschließend spülen Sie die Objektträger mit Wasser ab.
Trocknen Sie sie mit Luftblasen und legen Sie sie in die Montageboxen. Tragen Sie 60 Milliliter PEGylierungslösung auf den Objektträger auf und legen Sie einen Abdeckstreifen darauf. Markieren Sie die nicht PEGylierte Seite vor der Lagerung.
Nach der Inkubation vorsichtig zerlegen und die Objektträger und Slips mit Wasser abspülen. Trocknen Sie sie dann durch Luftblasen und legen Sie sie in ein steriles 50-Milliliter-Röhrchen, wobei die PEGylierte Oberfläche voneinander abgewandt ist. Nach dem Passieren von HEK 293T-Zellen mit 0,05% Trypsin-EDTA werden die Zellen auf Poly-L/D-Lysin-Deckstreifen ausgesät.
Platzieren Sie die Standardmedien mit AZZ-ergänzten Medien für das Wachstum von Zellen und metabotropem Glutamatrezeptor 2 oder mGluR2-Expression. Dann transfizieren Sie die Zellen mit einem Transfektionsreagenz und inkubieren Sie für 24 Stunden, bevor Sie das Medium mit frischen AZZ-ergänzten Medien wechseln. 20 Minuten vor dem Beschriften mit Alkincyaninfarbstoffen waschen Sie die Deckblätter zweimal mit warmem Recording Buffer (RB) und legen Sie sie in ein warmes Standardmedium ohne AZP.
Entfernen Sie dann die Standardmedien und waschen Sie die Zellen mit RB, bevor Sie die frisch zubereitete Etikettierlösung hinzufügen. 15 Minuten bei 37 Grad Celsius im Dunkeln inkubieren. Entfernen Sie nach der Inkubation die Etikettierlösung.
Waschen Sie den Abdeckbecher mit transfizierten Zellen zweimal mit dem RB und suspendieren Sie ihn im selben Medium. Als nächstes pelletieren Sie die Zellen, indem Sie sich fünf Minuten lang bei 1.000 g bei vier Grad Celsius drehen, und entfernen Sie den Überstand, bevor Sie das Pellet in 80 bis 130 Mikrolitern der Lyselösung wieder suspendieren. Brechen Sie das Pellet durch Pipettieren.
Dann wickeln Sie es in Folie und legen Sie es bei vier Grad Celsius für 30 Minuten bis eine Stunde auf die Wippe, um die Zellen zu lysieren. Pelletieren Sie die unlösliche Fraktion durch Zentrifugieren bei 20.000 g und vier Grad Celsius für 20 Minuten. Dann den Überstand in ein frisches kaltes Röhrchen geben und auf Eis lagern.
Entfernen Sie den Objektträger und den Deckel aus dem Gefrierschrank und lassen Sie sie bei Raumtemperatur im Dunkeln erwärmen. Montieren Sie die Kammer, indem Sie die Streifen aus doppelseitigem Klebeband zwischen dem Objektträger und dem Abdeckstreifen einschließen, um sicherzustellen, dass die PEGylierten Oberflächen das Innere der Durchflusskammer bilden. Drücken Sie mit einer Pipettenspitze auf den Abdeckschein, um sicherzustellen, dass das Klebeband den Abdeckschein berührt, und schieben Sie ihn.
Tragen Sie Epoxidharz auf die Kanten des Objektträgers auf. Tragen Sie 40 Mikroliter 500-Nanomol-NeutrAvidin auf jede Bahn auf und inkubieren Sie in einer befeuchteten dunklen Box. Nach zwei Minuten waschen Sie jede Kammerbahn mit 100 Mikrolitern T50-Puffer.
Dann fügen Sie 20 nanomolare biotinylierte Antikörperlösung hinzu und inkubieren Sie für 30 Minuten, bevor Sie mit 200 Mikrolitern T50-Puffer pro Bahn waschen. Schalten Sie den Computer und das Mikroskop ein. Schalten Sie dann die Laser ein, um sich aufzuwärmen.
Schalten Sie anschließend die EMCCD-Kamera ein und öffnen Sie die Software. Montieren Sie die Probenkammer auf dem Mikroskoptisch und fügen Sie die Proteinprobe schrittweise hinzu, um etwa 400 Moleküle pro Sichtfeld zu erhalten. Waschen Sie die Kammer mit 100 Mikrolitern Bildgebungspuffer, ergänzt mit 0,3 Einheiten Protocatechuate 3, 4-Dioxygenase.
Passen Sie die Verstärkung, die Erfassungsrate und die Laserleistung an, um Einzelmolekül-Fluoreszenzsignale sowohl im Donor- als auch im Akzeptanzkanal zu erkennen. Dann regen Sie den Spender an und erfassen Sie Zeitspuren, bis 80% der Spendermoleküle im Sichtfeld photogebleicht sind. Schalten Sie am Ende des Films den 640-Nanometer-Laser ein, um den Akzeptor direkt anzuregen, bis einige der Moleküle photogebleicht sind.
Ändern Sie das Sichtfeld und wiederholen Sie die Schritte zur Erregung von Spender und Akzeptor, um drei Filme pro Bedingung zu sammeln. Für die Auswahl von Einzelmolekül-FRET-Spuren der Partikelpickung wählen Sie die Spuren aus, bei denen die Gesamtintensität der Donor- und Akzepterspuren über die Zeit stabil ist. Wählen Sie dann die Spuren mit antikorrelierten Änderungen der Spender- und Akzeptanzintensitäten aus.
Wählen Sie die Spender- und Akzeptanzmoleküle aus, die eine einstufige Photobleiche und Spuren von mehr als fünf Sekunden Länge zeigen. Berechnen Sie den FRET-Mangel. Identifizieren Sie schließlich den Konformationszustand durch Hidden Markov Modeling (HMM), indem Sie die im Manuskript beschriebenen Schritte ausführen.
Die Markierung von AZP durch Cyaninfarbstoffe wurde durch eine kupferkatalysierte Cycloadditionsreaktion erreicht und führte zu einer effektiven Plasmamembranmarkierung von 548UAA, wobei die Zelloberflächenpopulation mit Donor- und Akzeptorfluorophoren markiert wurde. In der SDS-PAGE-Elektrophorese wurde eine einzelne Bande bei 250 Kilodalton in HEK-293T-Zellen beobachtet, die 548UAA exprimierten, was mit dem dimeren mGluR2 in voller Länge zusammenfiel. Repräsentative selektive Spuren für mehrere kurzlebige und langlebige Spender- und Akzeptanzbleichereignisse werden hier gezeigt.
Konformationszustände wurden mittels HMM-Analyse identifiziert. Übergänge zwischen diskreten FRET-Zuständen wurden aus den idealisierten Anpassungen extrahiert und als Übergangsdichte-Wärmekarte dargestellt. Die idealisierten FRET-Spuren liefern auch Informationen über die Verweilzeit für jede identifizierte Bestätigung.
Die Spuren des Einzelmoleküls mit Donor- und Akzeptanzkanal sind hier dargestellt. Darüber hinaus zeigt Einzelmolekül-FRET vier Konformationszustände der mGluR2-Cystein-reichen Domäne. Eine effiziente Peak-Konservierung ist für den Einzelmolekül-Pulldown unerlässlich, und während dieses Prozesses sollte Vorsicht geboten sein.
Darüber hinaus sollte das Sauerstofffänger unmittelbar vor der Bildgebung hinzugefügt werden. Diese Markierungsmethode und Einzelmolekül-FRET-Experimente wurden auf mehrere Rezeptoren angewendet und haben neue Einblicke in den Mechanismus der Rezeptoraktivierung und Modulation der Rezeptorfunktion geliefert.
