Der Einfluss von Mikroumweltfaktoren auf das Zellverhalten wird oft mit stark vereinfachten In-vitro-Plattformen untersucht, die einzelne Hinweise isolieren. Unser Ansatz schafft Zellkultursubstrate, die mehrere dieser Hinweise kombinieren. Dieser Ansatz ist sehr vielseitig und ermöglicht eine systematische Untersuchung mit einer Vielzahl von Zellkulturmaterialien, Kontaktführungsmustern, zellulären Messwerten und Proteinen.
Das Verfahren wird an zwei PSE-Kandidaten aus unserem Labor demonstriert. CAS VAN DER PUTTEN und MIRKO D'URSO Erstellen Sie zunächst eine negative Glasform mit einer Femtosekundenlaser-Direktrechtstechnik, die alle interessanten Merkmale enthält. Legen Sie dann die negative Glasform vorsichtig auf den Boden einer Petrischale und gießen Sie das Polydimethylsiloxan-Vorpolymer auf die negative Glasform, um sie vollständig abzudecken.
Stellen Sie diese Petrischale in den Vakuum-Exsikkator und starten Sie die Vakuumpumpe. Sobald ein Vakuum erreicht ist, warten Sie 5 Minuten, um alle Blasen an der Grenzfläche zwischen der Formoberfläche und dem Polydimethylsiloxan-Vorpolymer zu entfernen. Das PDMS-Prepolymer über Nacht im Ofen bei 65 Grad Celsius aushärten.
Verwenden Sie nach dem Aushärten einen Spatel, um die Kanten des PDMS anzuheben. Entfernen Sie den neu ausgehärteten positiven PDMS-Chip aus der negativen Glasform, und wenn der positive PDMS-Chip dazu neigt, an der negativen Glasform zu haften, fügen Sie beim Anheben Ethanol oder Wasser an die Ränder des Abdrucks hinzu. Legen Sie dann den positiven Polydimethylsiloxan-Chip in einen Exsikkator neben eine kleine Durchstechflasche mit einem Tröpfchen Silanisierungsmittel und lassen Sie den Chip über Nacht unter Vakuum.
Gießen Sie PDMS-Vorpolymer in die negative PDMS-Form, um mehrere Zellkulturchips von 5 Millimetern Dicke herzustellen. Als nächstes entfernen Sie die Blasen mit dem Exsikkator und härten für drei Stunden bei 65 Grad Celsius aus. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um den Chip auf die endgültige Größe zu schneiden und die Chips bei Raumtemperatur zu lagern Für die Substratpassivierung mit einer Pinzette legen Sie den Chip in den Korb des Plasma-Ashers.
Verwenden Sie dann Sauerstoffplasma, um die Hydroxylgruppen auf der Oberfläche des Chips zu aktivieren und die Verascungskammer mit Stickstoff zu entlüften. Nehmen Sie den Chip aus dem Korb und legen Sie ihn in einen kleinen Polydimethylsiloxanbehälter. Verwenden Sie nun eine Pasteurpipette, um 500 Mikroliter Poly-L-Lysin auf die Oberseite des Chips zu geben, um die Oberfläche vollständig in die Lösung einzutauchen und 30 Minuten bei Raumtemperatur zu inkubieren.
Anschließend werden 450 Mikroliter des Poly-L-Lysins mit einer Pipette aus dem Zellkulturchip entfernt. Als nächstes spülen Sie die Chipoberfläche mit 500 Mikrolitern 0,1 molaren HEPES-Puffer. Behalten Sie die endgültige Musterqualität bei, indem Sie ein kleines Flüssigkeitsvolumen auf dem Polydimethylsiloxan-Chip belassen, um ein Austrocknen der Probe zu verhindern.
Kurz vor Gebrauch 500 Mikroliter 50 Milligramm pro Milliliter Methoxypolyethylenglykose Cyanamidvaleratlösung in 0,1 molaren Haufenpuffer pro Zellkulturchip vorbereiten und die Probe darin 60 Minuten inkubieren. Entfernen Sie mit einer Mikropipette 450 Mikroliter der Methoxypolyethylenglykosincyanamidvaleratlösung. Waschen Sie die Späneoberfläche fünfmal mit PBS, indem Sie ein- und auspipettieren.
Um alle ungebundenen mPEG-SVA zu entfernen. Legen Sie den Objektträger mit einem fluoreszierenden Textmarker in den optischen Pfad des Mikroskops. Schalten Sie am Mikroskop in den Fluoreszenzmodus und fokussieren Sie das Primo-Bild sorgfältig, um sicherzustellen, dass sowohl das Logo als auch der Text scharf sind.
Klicken Sie auf Weiter, um die Kalibrierungsdaten und das Muster anzuzeigen, um den Kalibrierungsvorgang abzuschließen. Notieren Sie sich bei der Kalibrierung die Z-Position der Bühne und verwenden Sie diese Position später im Protokoll als Referenz. Nachdem Sie den Kalibrierungsobjektträger von der Bühne entfernt haben, legen Sie einen Glasobjektträger, der ein Tröpfchen des Photoinitiators enthält, auf die Bühne und legen Sie das PDMS-Zellkultursubstrat kopfüber in das Photoinitiatortröpfchen.
Stellen Sie sicher, dass die 3D-Merkmale auf der Oberfläche des Zellkultursubstrats dem Glasobjektträger zugewandt sind und vollständig in den Fotoinitiator eingetaucht sind, um eine ordnungsgemäße Strukturierung zu gewährleisten. Konzentrieren Sie sich auf die Ober- oder Unterseite von konvexen bzw. konkaven Strukturen und konzentrieren Sie sich auf den Bereich des Chips an der richtigen Stelle, wie im Manuskript beschrieben. Passen Sie die Mustereinstellungen entsprechend der Funktion an und wählen Sie eine Dosis von 1000 Millijoule pro Milliliter.
Klicken Sie auf die Wiedergabeschaltfläche am rechten unteren Bildschirmrand, um die Musterung zu starten. Wenn Sie fertig sind, beobachten Sie das grün angezeigte Muster. Fügen Sie mit einer Mikropipette zwei Milliliter PBS zu einer Durchstechflasche mit 20 Mikrogramm Rhodamin-markiertem Fibronektin hinzu, um eine Konzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten.
Pipettieren Sie vorsichtig, um die Proteinklumpen zu vermeiden und vor Licht zu schützen. Mit einer Mikropipette 200 bis 500 Mikroliter der Proteinlösung in den Zellkulturchip geben. Stellen Sie die Inkubationszeit und -temperatur je nach bevorzugtem Protein ein und stellen Sie sicher, dass die Probe abgedeckt ist.
Entfernen Sie die Proteinlösung und waschen Sie den Chip fünfmal mit 500 Mikrolitern sterilem PBS. Stellen Sie sicher, dass Sie das PBS über alle relevanten Merkmale des Zellkulturchips mehrmals nach oben und unten pipettieren, um ungebundenes Protein zu entfernen. Sobald die Zellsuspension vorbereitet ist, entfernen Sie PBS und fügen Sie 1 Milliliter der Zellsuspension zum Chip hinzu.
Dann inkubieren Sie es für 60 Minuten bei 37 Grad Celsius. Überprüfen Sie die Adhäsion der Zellen auf dem Musterzellkulturchip unter einem Hellfeldmikroskop. Suchen Sie bei Linienmustern nach länglichen Zellmorphologien.
Und wenn Zellen begonnen haben, außerhalb des strukturierten Bereichs zu haften, entfernen Sie diese, indem Sie das Medium direkt über den Zellen auf dem Substrat auf und ab pipettieren. Nach dem Färben legen Sie die gefärbte Probe kopfüber in einen Tropfen PBS auf einem Glasobjektträger. Erstellen Sie dann je nach erforderlichem Detaillierungsgrad Z-Stacks mit einem geeigneten Objektiv und Z-Abstand, um eine ordnungsgemäße Bildaufnahme zu gewährleisten.
Erstellen Sie ein 3D-Rendering des Z-Stacks mit einer 3D-Rendering-Software. Eine konkave Grube wurde unter Verwendung von lichtinduzierter molekularer Absorption von Proteinen strukturiert und die maximale Intensitätsprojektion und orthogonale Ansicht wurden visualisiert. Das Intensitätsprofil zeigte hochauflösende scharfe Übergänge zwischen strukturierten und nicht strukturierten Bereichen und eine konsistente Proteinintensität.
Die Musterung mit der einzelnen Fokusebene sowie der Methode der zwei und drei Fokusebenen zeigte eine perfekte Ausrichtung der Muster auf den Merkmalen. Die konkaven Halbzylinder, konvexen Halbzylinder, Sattelfläche und PID wurden mit Linien oder konzentrischen Kreisen unterschiedlicher Breite gemustert. Der Affekt im Inneren des Skeletts der menschlichen Keratozyten wird mit Foliden gefärbt und visualisiert.
Die dermalen Fibroblasten wurden auf einem gemusterten konkaven Halbzylinder kultiviert und visualisiert. Die Zellen spürten und hafteten am Multi-Cue-Zellkultursubstrat und blieben im Laufe der Zeit lebensfähig, wie durch F-Actin, Vinculin und Nuclei sichtbar gemacht. Außerdem bildeten die Zellen fokale Adhäsionen hauptsächlich an den Fibronektinlinien.
Die menschlichen dermalen Fibroblasten, die in Gegenwart von Rhodaminfibronektin auf einem gemusterten konkaven Zylinder kultiviert wurden, hafteten an dem Multi-Cue-Substrat und zeigten eine Ausrichtungsreaktion gemäß dem Kontaktführungsmuster. Die Alignment-Reaktion und die Zelllebensfähigkeit bleiben während der gesamten Kulturdauer erhalten. Das Wichtigste bei der Durchführung dieses Protokolls ist, zu verhindern, dass die Oberfläche des Zellkulturchips austrocknet.
Die Verwendung unterschiedlicher Substratmaterialien, Proteinbeschichtungen und Zelltypen kann zusätzliche Optimierungen erfordern. Die Bereitstellung mehrerer Umgebungshinweise in 3D kann neue Möglichkeiten eröffnen, die zelluläre Organisation in komplexen technischen Geweben zu steuern.
