This work was supported by USPHS grants MH-091460 (E.N.), MH-084018 (A.S.), MH-094268 Silvo O. Conte center (A.S.), MH-069853 (A.S.), MH-085226 (A.S.), MH-088753 (A.S.), MH-092443 (A.S.), and MH-096208 (K.I.), grants from DANA (E.N.), Stanley (A.S.), RUSK (A.S.), S-R foundations (A.S.), NARSAD (A.S. and K.I.), and Maryland Stem Cell Research Fund (A.S. and K.I.).
We sincerely appreciate the efforts and contributions of Pearl Kim, Maria Papapavlou, Nao Gamo, Youjin Chung, Yukiko Lema and Mark Christie towards coordination of the biopsy process.

HINWEIS: Alle Teilnehmerinnen und Teilnehmer in dieser Studie wurden Einwilligung Dokumente des Institutional Review Board der Howard University und der Johns Hopkins University zugelassen verabreicht. Nur Teilnehmer, die mit der Unterzeichnung der Einverständniserklärung eingewilligt Dokumente wurden in die Studie aufgenommen. Die Studie Basis dieser Analyse bestand aus: 20 Probanden (12 BD und 10 Kontrollen, 30% Männer) und Durchschnittsalter (sd) von 38,2 (14,1) Jahre. HINWEIS: Sprühen Sie alle Oberflächen mit RNase Zap RNase Kontamination von Glas- und Kunststoffoberflächen zu entfernen. 1. Biopsie <ol><li> Spray aktuelle Lidocain (Xylocain) Flüssigkeit 4% und Oxymetazolin HCl 0,05% in der Nasenhöhle der Studienteilnehmer und lassen 15 Minuten von betäubenden Zeit. </li><li> Genießen ½ x 3-Zoll-chirurgische cottonoids in einer Mischung aus Lidocain und Oxymetazolin und legen Sie in der Nasenhöhle sowie überlegene Teil der Nasenscheidewand und lassen Sie sie für 15 Minuten sitzen. </li><li> Mit einem 30 ° HartNasen Endoskop, um den oberen Abschnitt der Nasenhöhle zu finden, zu entfernen Nasenschleimhaut mit bis Kauen Nasenzange von der überlegenen Teil der Nasenscheidewand, wobei mehrere kleine Proben. </li></ol> 2. Herstellung von Gewebeblöcke <ol><li> Unmittelbar vor der Biopsie, füllen Standardgröße cryomolds mit Gewebe Gefriermedium. </li><li> Mit autoklaviert Pinzette, Montage frischem Gewebe im Einfriermedium einzufrieren und auf Trockeneis. Füllen Rest cryoblock mit dem Gefriermedium, Gefriert cryoblock auf Trockeneis, und speichern Blöcke bei -80 ° C. </li></ol> 3. Kryoschneiden <ol><li> Bereiten Polyethylennaphthalat (PEN) Membranglasobjektträger unmittelbar vor Kryoschneiden. Spray Folien mit RNase Zap-Lösung für 5 min. Dann spülen Sie Folien in Diethylpyrocarbonat (DEPC) Wasser und der Luft trocknen lassen für 30 Minuten. Aktivieren getrockneten Folien unter UV-Licht für 30 Minuten. </li><li> Kryoschnitt jedem Block vollständig auf 30 um. Halten Sie Folien auf trockenen ice und Abschnitte so weit wie möglich eingefroren. Objektträger bei -80 ° C nach Abschluss. </li></ol> 4. Laser-Mikrodissektion <ol><li> Beginnen Sie mit der Dehydratisierung Folien unmittelbar vor der Mikrodissektion. Lassen Sie gefrorene Dias Auftauen für 10 Sekunden, und dann die folgenden Ethanolreihe auf jedes Bild: 60% (2 ml, 15 sec), 80% (2 ml, 15 sec), 95% (3 ml, 25 sec), 100 % (7 ml, 60 sec). </li><li> Schalten photoLokalisationsMikroskopie (PALM) Mikroskop auf und stellen Sie den folgenden Bedingungen: Für die 10-facher Vergrößerung setzen die Energie, um 82, konzentrieren sich auf 74, und die Geschwindigkeit auf 25 - 30 zu 20-facher Vergrößerung, stellen Sie die Energie, um 63, konzentrieren, um 67, und die Geschwindigkeit bis 5 - 6. Stellen Sie nach Bedarf, um optimale Schnittergebnisse zu erhalten. </li><li> Visuell zu identifizieren Nervenzellen mit 20X oder 10X Vergrößerung. Unterscheiden die dünne Oberflächen olfaktorischen Neuronen Schicht aus Basisteil Schleimhaut unter einem Mikroskop ohne die Verwendung von Färbeverfahren. Neuronen beobachten, als dichte säulen Aussehen 18.</li><li> Mit dem Stift-Funktion in der oben erwähnten Mikroskop in Schritt 4.2, Spurenelemente um die neuronale Schicht. Spuren geringfügig von Neuronen Verbrennung von Neuronen aus dem Laser zu vermeiden. Dies ist wichtig, um eine hohe Qualität RNA. Dann initiieren lasergesteuerte Schneid. </li><li> Abholung seziert Abschnitte mit feiner Spitze Mikrodissektion Zange und legte Gewebe in einem Mikroröhrchen, die 100 &amp; mgr; l Lysepuffer auf Eis. Wiederholen Sie dies für alle neuronalen Abschnitte aus einer Probe erhalten. Insgesamt Dissektion Zeit pro Probe sollte 50 Minuten nicht überschreiten. </li><li> Nach Präparation abgeschlossen ist, sofort Wirbel Probe-Lysaten und auf Trockeneis zu halten. Proben bei -80 ° C für die gesamte RNA-Isolierung. </li></ol> 5. Isolierung von Gesamt-RNA und Qualitätskontrolle Analyse <ol><li> Thaw Probe-Lysaten auf Eis. Führen Sie die Gesamt-RNA-Isolierung mit RNAqueous Micro Kit mit DNase-I-Inaktivierung durch folgenden Herstellerprotokoll ohne Änderungen (siehe &lt;strong&gt; Abbildung 1). Die gesamte Elutionsvolumen beträgt ungefähr 20 &amp; mgr; l. </li><li> RNA-Konzentration zu messen und zu bewerten RNA-Qualität mit RNA Integrity Number (RIN) mit Bioanalyzer. Die Proben, die den Qualitätskontrollkriterien in Abbildung 2 treffen für die cDNA-Synthese verwendet werden. </li></ol> 6. cDNA Synthesis <ol><li> Synthetisieren cDNA mit einem validierten kommerziellen Kit (siehe Tabelle der Reagenzien). Führen der Glühschritt durch Kombinieren von 0,1 bis 1,0 ng RNA (je nach Verfügbarkeit) und RNase-freiem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 8 &amp; mgr; l pro Röhrchen. Dann 1 &amp; mgr; l Oligo-d (T) 20-Primers und 1 ul 10 mM dNTP Mix pro Röhrchen, für ein Gesamtvolumen von 10 ul. </li><li> Vorsichtig vortexen und zentrifugieren Proben und Tempern Proben bei 65 ° C für 5 min. Nachdem die Reaktion beendet ist, sofort kühl Proben auf Eis. </li><li> Bereiten Mastermix Lösung entsprechend den Vorgaben in der Tabelle 1. Dann fügen Sie 9,5 μl Master-Mix und 0,5 ul von kommerziell hergestellten Reverse Transkriptase (RT) in jedes Röhrchen. In 0,5 ul RNase-freies Wasser auf Rohr statt RT steuern. </li><li> Führen Sie einen RT-Reaktion mit der ersten Inkubation bei 50 ° C für 50 min, dann 85 ° C für 5 Minuten und einer abschließenden 4 ºC halten, ohne Radfahren. </li><li> Verdünnen Sie alle Proben, die durch 5-fach mit Wasser und aliquoten. Proben bei -80 ° C. </li></ol> 7. Real Time PCR - Bestätigen Neuronale Enrichment <ol><li> Bereiten Sie den Master-Mix-Lösung gemäß den Spezifikationen in Tabelle 2. Verwenden Sie eine interne Kontrolle, wie GAPDH. Vergleichen olfaktorischen Markerprotein (OMP) Ausdruck in mikrodissezierten Gewebe mit OMP-Expression in unzer Gewebe zu neuronalen Bereicherung zu bestimmen. HINWEIS: OMP ist ein Marker für olfaktorische Neuronen. OMP-Sequenz: vorwärts, 5&#39;-CTGTCGGACCTGGCCAAG-3 &#39; umkehren, 5&#39;-CACCCTCGCCAAAGGTGA-3 &#39; GAPDH-Sequenz: vorwärts, 5&#39;-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3 &#39; umzukehren, 5&#39;-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3 &#39;. </li><li> Up PCR-Platte durch Zugabe von 7 ul des Master-Mix in jede Vertiefung und 3 ul cDNA-Set. </li><li> Zentrifugenplatte für 5 Minuten bei 300 g (1300 rpm). Führen Sie Echtzeit-PCR-Reaktion unter Verwendung der für die kommerzielle supermix wie SYBR grüner qPCR angegebenen Standardtemperaturwechselbedingungen. </li><li> Analyse von Daten (siehe Abbildung 2 für Daten). </li></ol> 8. Real Time PCR - Expression von Genen von Interesse <ol><li> Führen Sie auf Proben, die neuronale Bereicherung 2-fach oder mehr zeigen. </li><li> Bereiten Master-Mix auf Eis für jede Sonde (FAM-markierten Sonde von Interesse und VIC-markiertem GAPDH) in getrennten Röhren nach den Vorgaben in Tabelle 3. </li><li> Richten Sie ein PCR-Platte mit 8 ul Mastermix in jede Vertiefung und 2 ul cDNA. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte für 5 Minuten bei 300 g (1300 rpm). Führen Sie Echtzeit-PCR-Reaktion mit dem defAult thermischen Wechselbedingungen nach dem vom Hersteller bereitgestellten Genexpression Mastermix Protokoll. Analysieren Ausdruck Ergebnisse (siehe Abbildung 2 für Daten). </li></ol>

<ol>
	<li>Goodwin, F. K., Jamison, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manic-depressive illness. , (1990).</li><li>Einat, H., Manji, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+plasticity+cascades:+genes-to-behavior+pathways+in+animal+models+of+bipolar+disorder.">Cellular plasticity cascades: genes-to-behavior pathways in animal models of bipolar disorder.</a> Biol Psychiatry. 59 (12), 1160-1171 (2006).</li><li>Severino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacogenomics+of+bipolar+disorder.">Pharmacogenomics of bipolar disorder.</a> Pharmacogenomics. 14 (6), 655-674 (2013).</li><li>Beech, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+differences+in+peripheral+blood+between+lithium+responders+and+non-responders+in+the+Lithium+Treatment-Moderate+dose+Use+Study+(LiTMUS).">Gene-expression differences in peripheral blood between lithium responders and non-responders in the Lithium Treatment-Moderate dose Use Study (LiTMUS).</a> Pharmacogenomics J. 14 (2), 182-191 (2013).</li><li>Horiuchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+cells+via+nasal+biopsy+reflect+the+developing+brain+in+gene+expression+profiles:+utility+and+limitation+of+the+surrogate+tissues+in+research+for+brain+disorders.">Olfactory cells via nasal biopsy reflect the developing brain in gene expression profiles: utility and limitation of the surrogate tissues in research for brain disorders.</a> Neurosci Res. 77 (4), 247-250 (2013).</li><li>Dryer, L., Graziadei, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+of+the+olfactory+bulb+in+an+elasmobranch+fish,+Sphyrna+tiburo:+segregation+of+inputs+in+the+telencephalon.">Projections of the olfactory bulb in an elasmobranch fish, Sphyrna tiburo: segregation of inputs in the telencephalon.</a> Anat Embryol (Berl. 190 (6), 563-572 (1994).</li><li>Hahn, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+neurogenesis+in+human+olfactory+epithelium.">In vivo and in vitro neurogenesis in human olfactory epithelium.</a> J Comp Neurol. 483 (2), 154-163 (2005).</li><li>Cascella, N. G., Takaki, M., Lin, S., Sawa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodevelopmental+involvement+in+schizophrenia:+the+olfactory+epithelium+as+an+alternative+model+for+research.">Neurodevelopmental involvement in schizophrenia: the olfactory epithelium as an alternative model for research.</a> J Neurochem. 102 (3), 587-594 (2007).</li><li>Sawa, A., Cascella, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+olfactory+system+for+clinical+and+basic+psychiatry:+a+promising+entry+point+to+the+mystery+of+brain+mechanism+and+biomarker+identification+in+schizophrenia.">Peripheral olfactory system for clinical and basic psychiatry: a promising entry point to the mystery of brain mechanism and biomarker identification in schizophrenia.</a> Am J Psychiatry. 166 (2), 137-139 (2009).</li><li>Mor, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-382+expression+is+elevated+in+the+olfactory+neuroepithelium+of+schizophrenia+patients.">MicroRNA-382 expression is elevated in the olfactory neuroepithelium of schizophrenia patients.</a> Neurobiol Dis. 55, 1-10 (2013).</li><li>Kano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+of+multiple+histone+methylations+in+olfactory+cells:+further+implications+for+cellular+susceptibility+to+oxidative+stress+in+schizophrenia.">Genome-wide profiling of multiple histone methylations in olfactory cells: further implications for cellular susceptibility to oxidative stress in schizophrenia.</a> Mol Psychiatry. 18 (7), 740-742 (2013).</li><li>Toritsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficits+in+microRNA-mediated+Cxcr4/Cxcl12+signaling+in+neurodevelopmental+deficits+in+a+22q11+deletion+syndrome+mouse+model.">Deficits in microRNA-mediated Cxcr4/Cxcl12 signaling in neurodevelopmental deficits in a 22q11 deletion syndrome mouse model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17552-17557 (2013).</li><li>Evgrafov, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+neuroepithelium-derived+neural+progenitor+cells+as+a+model+system+for+investigating+the+molecular+mechanisms+of+neuropsychiatric+disorders.">Olfactory neuroepithelium-derived neural progenitor cells as a model system for investigating the molecular mechanisms of neuropsychiatric disorders.</a> Psychiatr Genet. 21 (5), 217-228 (2011).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+dynamics+are+altered+in+schizophrenia.">Focal adhesion dynamics are altered in schizophrenia.</a> Biol Psychiatry. 74 (6), 418-426 (2013).</li><li>Ishizuka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+symptoms+of+schizophrenia+correlate+with+impairment+on+the+University+of+Pennsylvania+smell+identification+test.">Negative symptoms of schizophrenia correlate with impairment on the University of Pennsylvania smell identification test.</a> Neurosci Res. 66, 106-110 (2010).</li><li>Sattler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+nasal+olfactory+epithelium+as+a+dynamic+marker+for+CNS+therapy+development.">Human nasal olfactory epithelium as a dynamic marker for CNS therapy development.</a> Exp Neurol. 232 (2), 203-211 (2011).</li><li>Rimbault, M., Robin, S., Vaysse, A., Galibert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+profiles+of+rat+olfactory+epithelia:+individual+and+age+related+variations.">RNA profiles of rat olfactory epithelia: individual and age related variations.</a> BMC Genomics. 10, 572 (2009).</li><li>Tajinda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+biomarkers+from+patients+with+mental+illnesses:+a+novel+method+through+nasal+biopsy+combined+with+laser-captured+microdissection.">Neuronal biomarkers from patients with mental illnesses: a novel method through nasal biopsy combined with laser-captured microdissection.</a> Mol Psychiatry. 15 (3), 231-232 (2010).</li><li>Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+molecular+analysis+of+tissue.">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).</li><li>Fink, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantitative+RT-PCR+after+laser-assisted+cell+picking.">Real-time quantitative RT-PCR after laser-assisted cell picking.</a> Nat Med. 4 (11), 1329-1333 (1998).</li><li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Nurnberger, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+interview+for+genetic+studies.+Rationale,+unique+features,+and+training.">Diagnostic interview for genetic studies. Rationale, unique features, and training.</a> NIMH Genetics Initiative. Arch Gen Psychiatry. 51 (11), 849-859 (1994).</li><li>Montgomery, S. A., Asberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+depression+scale+designed+to+be+sensitive+to+change.">A new depression scale designed to be sensitive to change.</a> Br J Psychiatry. 134, 382-389 (1979).</li><li>Young, R. C., Biggs, J. T., Ziegler, V. E., Meyer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rating+scale+for+mania:+reliability,+validity+and+sensitivity.">A rating scale for mania: reliability, validity and sensitivity.</a> Br J Psychiatry. 133, 429-435 (1978).</li></ol>

Die Autoren berichten über keine finanziellen Beziehungen mit kommerziellen Interessen.

Eine neue Plattform für den Erhalt von angereichertem olfaktorischen Neuronen Schichten durch die Kombination von Nasen Biopsie und LCM vorgestellt und hat sich in dieser Studie bestätigt. Diese Technik kann weitverbreitete Implikationen haben. Es kann zur Biomarker-Studien, einschließlich der für die Behandlung angesprochen haben, und Arzneimittelforschung für andere neuropsychiatrische Störungen angewendet werden, so dass eine breitere Wirkung auf dem Gebiet. Um eine hohe Qualität N...

Bipolare Störung (BD) ist eine schwere neuropsychiatrische Störung, gekennzeichnet durch pathologische Veränderungen in der Stimmung, Antriebs- und Kognition 1. Lithium zur Behandlung von BD verwendet wurde gezeigt stationären mRNA-Spiegel aus einer großen Anzahl von Genen, die im Tierversuch 2 zu verändern, aber es ist nicht bekannt, wenn dieser Moleküle mit klinische Reaktion bei Menschen 2 verbunden. Verständnis des Mechanismus von Lithium Reaktion erfordern würde untersuchen Lithium-induzierten molekularen Veränderungen in neuronalen Geweben. Unglücklicherweise ist es nicht praktikabel, zu erhalten Gehirn Biopsien BD-Patienten vor und nach einer Lithiumtherapie zur molekularen Klassifizierung Lithiumantwort zu identifizieren. Post-mortem-Hirngewebe verwendet wurden, um Biomarker in BD studieren, können sie jedoch nicht verwendet werden, um molekulare Marker mit dynamischen Veränderungen der Emotionen, Kognition und fahren damit verbundenen bewerten; und die Wirksamkeit der im Nachhinein festgestellt Lithium Ansprechen auf die Behandlung kann problematisch sein 4. Lymphozyten und anderen Blutzellen nützlich sein könnte, aber molekulare Veränderungen der Blutzellen kann nicht neuronalen Veränderungen 3-5 reflektieren. Liquor kann nicht aus, um Informationen über die intrazelluläre Moleküle, die krankheitsassoziierten und Medikamente reversibel intrinsische Änderungen spiegeln kann zu erhalten. Das Riechepithel (OE) ist ein einzigartiges Teil des zentralen Nervensystems (ZNS), um limbischen Strukturen 6 embryologically gerichtet; und es ist durch nasale Biopsien leicht zugänglich. Es besteht aus glialen artigen Stütz (dh Sustentaculum) -Zellen basalen proliferierenden Zellen und olfaktorischen Rezeptorneuronen zu verschiedenen Entwicklungsstufen 7-9. Daher sieht OE eine einzigartige Gelegenheit, zugänglich zu studieren dynamischen Veränderungen im ZNS von Patienten mit neuropsychiatrischen Erkrankungen 7. Studien zur Untersuchung der Krankheit assoziiert Ereignisse, die diese occ reflektieren demonstriert den Nutzen der OE als Ersatzgewebeurring in Gehirnneuronen 8,9. Beispielsweise haben Studien OE verwendet, um molekularen Profile psychiatrischen Erkrankung 10-14 zugeordnet untersuchen. Geruchssystem dient auch dazu, die klinische endophenoytpes wie Geruch Defiziten, die mit negativen Symptomen von Schizophrenie 15 assoziiert sind, zu identifizieren. Zusätzlich neurologische Entwicklungsprozesse in der OE weiterhin während des gesamten Lebens und stellt einen nützlichen Weg, um die zugrunde liegende Pathophysiologie von psychiatrischen Erkrankungen 8,9 modellieren. Ein Nachteil der Verwendung dieses Gewebes ist jedoch die erhebliche Kontamination des olfaktorischen Biopsien mit nicht-neuronalen Zellen 16. Zum Beispiel werden die Gesamt-RNA für Genexpressionsuntersuchungen in früheren Studien verwendet OE enthaltenen RNA aus dem gesamten Nasen biopsierten Gewebe einschließlich RNA von nicht-neuronalen Zellen 17 extrahiert. Daher haben die bisherigen Ansätze durch die Qualität der Zellen begrenzt. Um dieses Problem zu überwinden, um einen neuen Ansatz zu erhalten<html> angereicherten neuronalen Zellpopulationen durch Kombinieren Nasen Biopsien mit laser Mikrodissektion (LCM) entwickelt worden 18. LCM ist eine Technik, die für die selektive Isolierung von Zellen unter Verwendung von UV-Laserschneiden in Kombination mit Infrarotlaser 19-21 ermöglicht. Kombinieren LCM mit OE Ansatz minimiert erhebliche Kontamination OE von nicht-neuronalen Zellen, wodurch die Anreicherung von neuronalen Zellen 18. Darüber hinaus kann das neuronale Schicht von der Submukosa-Schicht unter einem Mikroskop zu unterscheiden, wodurch die Notwendigkeit für die Färbung eliminiert. Neuronale Zelltypen weiter von anderen Zellpopulationen unter Verwendung von primären Antikörpern, die von der interessierenden Zelltyp exprimiert 7 unterschieden werden. Daher wird in diesem Verfahren eine einfachere Methode zur Anreicherung von fast rein neuronalen Zellpopulation, die für Genexpressionsstudien, Immunhistochemie und andere morphologische Untersuchungen verwendet werden kann. ve_content &quot;&gt; Diese Studie zielt darauf ab, eine experimentelle Plattform zu molekularen Veränderungen in Riechzellen mit Krankheitszuständen und Ansprechen auf die Behandlung verbunden untersuchen zu schaffen. Zur Lösung dieses Problems eine kleine Gruppe von Nichtraucher-Patienten, die die DSM-IV Diagnosekriterien für BD erfüllt, basierend auf die Diagnostic Interview für genetische Studien (DIG) 22 wurde eingestellt, um zwei nasale Biopsien unterziehen: eine Biopsie vor der Behandlung mit Lithium und das zweite Biopsie, nach 6 Wochen täglich oral Lithium-Therapie Darüber hinaus muss der Berechtigte BD Patienten sein. Symptome für Depressionen , auf Basis von Scoring ≥10 Stelle von 60 in den Kliniker verabreicht Montgomery-Asberg Rating Scale (MADRS) 23; symptomatisch für Hypomanie oder Manie, auf der Grundlage einer Partitur ≥10 von 56 auf der Kliniker verabreicht Young-Mania Rating Scale (YMRS) 24;. oder ≥10 auf beiden MADRS und YMRS Rater-Inter-Rater Koeffizient der Vereinbarung zwischen Klinikern für beide Skalen ist&gt; 0,96 nach Biopsien waren Neuronen enri.CHED von OE von LCM. Folgende zusätzliche Maßnahmen zur Qualitätskontrolle, zur Gewinnung hochwertiger RNA aus dem Gewebe und neuronalen Bereicherung sicherzustellen, Echtzeit RT-PCR durchgeführt, um vor und nach der Behandlung Expression von Genen von Interesse zu untersuchen. Die folgenden Abschnitte enthalten eine Beschreibung der Validierung dieses Ansatzes, Hervorhebung der Optimierung des Protokolls und die Strategien, die zur Fehlersuche das Protokoll angewendet wurden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Reagent</td>
			<td style="width:143px;">Manufacturuer&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Manufacturer Catalog #</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue-Tek Cryomold Molds</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4557</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue-Tek O.C.T Compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cryosectioning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Membrane Slide 1.0 PEN (D)</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>415190-9041-000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rnase Zap</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9780</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DEPC Treated Water</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-068-131</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microdissection</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope: PALM Series MicroLaser System</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Model: Axiovert 200M</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Software: Robo v3.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">No.5 Dumont Microdissction Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-49085</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA Extraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAqueous Micro Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1931</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cDNA Synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperScript III First Strand Synthesis Kit</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>18080-051</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">OMP qPCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR GreenER qPCR SuperMix</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>11760-500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Taqman qPCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Expression Assay Probes</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>Various</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4369016</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

olfactory neurons obtained through nasal biopsy combined with laser-capture microdissection: a potential approach to study treatment response in mental disorders

Bipolare Störung (BD) ist eine schwere neuropsychiatrische Störung mit wenig verstanden Pathophysiologie und in der Regel mit der Stimmung Stabilisator, Lithiumcarbonat behandelt. Tierstudien sowie humangenetischen Studien zeigen, dass Lithium betrifft molekulare Ziele, die in neuronalen Wachstum, Überleben und die Reifung und insbesondere Moleküle im Wnt-Signalweg beteiligt beteiligt sind. Angesichts der ethischen Herausforderung Erhalt Gehirnbiopsie zur Untersuchung dynamischer molekularen Veränderungen mit Lithium-Antwort in dem Zentralnervensystem (ZNS) verbunden sind, kann man die Verwendung von Neuronen aus olfaktorischen Geweben gewonnen betrachten dies zu erreichen goal.The Riechepithel enthält olfaktorischen Rezeptorneuronen in verschiedenen Stadien der Entwicklung und glialen artigen Stützzellen. Dies bietet eine einzigartige Gelegenheit, um dynamische Veränderungen im ZNS von Patienten mit neuropsychiatrischen Erkrankungen zu studieren, mit Riechgewebe sicher von Nasen Biopsien erhalten. Um den Nachteil von subst gestellt überwindenantial Kontamination biopsiert olfaktorischen Gewebe mit nicht-neuronalen Zellen, wurde ein neuer Ansatz, um angereicherte neuronalen Zellpopulationen zu erhalten, durch Kombinieren Nasen Biopsien mit Laser-Mikrodissektion entwickelt. In dieser Studie wurde ein System zur Untersuchung der Behandlung assoziierte dynamische molekularen Veränderungen in neuronalem Gewebe entwickelt und validiert, unter Verwendung einer kleinen Pilot Probe BD Patienten für die Untersuchung der molekularen Mechanismen der Lithiumbehandlung Reaktion beteiligt.

Das Protokoll und die Fehlerbehebung Strategie bei der Untersuchung von molekularen Signaturen wurden erfolgreich optimiert. RNA-Qualität und neuronalen Bereicherung Kriterien für Proben in weiter stromabwärts Echtzeit-PCR-Analyse verwendet werden, wurden vereinheitlicht. RIN und RNA-Konzentration wurden als Störfaktoren zu erfassende Expressionsniveaus untersucht. Basierend auf der Analyse von mehreren Proben mit RINs Bereich 1-10 wurde festgestellt, daß eine minimale RIN von ~ 3.0 und höher reicht für nachgesch...

Watch this Scientific Journal Video about Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disord

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

In dieser Studie wurde eine neue Plattform, um intran molekulare Signaturen der Behandlungserfolg bei bipolaren Störungen (BD) zu untersuchen, wurde entwickelt und validiert. Riechepithel von BD Patienten wurde durch nasale Biopsien erhalten. Dann wurde Laser-Mikrodissektion mit Echtzeit-RT-PCR kombiniert, um die molekulare Signatur von Lithium-Antwort in BD zu untersuchen.

Riechzellen durch nasale Biopsie Combined Erhalten mit Laser-Mikrodissektion: Ein möglicher Ansatz zum Behandlungserfolg bei Mental Disorders Studieren

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

olfactory-neurons-obtained-through-nasal-biopsy-combined-with-laser

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.7K Aufrufe.  Johns Hopkins University.  In dieser Studie wurde eine neue Plattform, um intran molekulare Signaturen der Behandlungserfolg bei bipolaren Störungen (BD) zu untersuchen, wurde entwickelt und validiert. Riechepithel von BD Patienten wurde durch nasale Biopsien erhalten. Dann wurde Laser-Mikrodissektion mit Echtzeit-RT-PCR kombiniert, um die molekulare Signatur von Lithium-Antwort in BD zu untersuchen. 

Serie: Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Laser Capture Mikrodissektion von Drosophila Peripheren Neuronen

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

We describe here a method for biopsying olfactory mucosa from rat and human nasal cavities. These biopsies can be used for either identifying molecular anomalies in brain diseases or isolating multipotent adult stem cells that can be utilized for cell transplantation in animal models of brain trauma/disease.

Isolating Nasal Olfaktorische Stammzellen von Nagetieren oder Menschen

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Targeting Riechhirn Neuronen mit kombinierten In Vivo Elektroporation und Gal4-Based Enhancer-Trap Zebrafischlinien

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of the breadth of molecular regulation. Newer approaches such as high-resolution RNA sequencing (RNA-Seq)1 provides new and expansive information about tissue- or state-specific expression such as relative transcript levels, alternative splicing, and micro RNAs2-4. Prospects for employing the RNA-Seq method in comparative whole transcriptome profiling5 within discrete tissues or between phenotypically distinct groups of individuals affords new avenues for elucidating molecular mechanisms involved in both normal and abnormal physiological states. Recently, whole transcriptome profiling has been performed on human brain tissue, identifying gene expression differences associated with disease progression6. However, the use of next-generation sequencing has yet to be more widely integrated into mammalian studies.
Gene expression studies in mouse models have reported distinct profiles within various brain nuclei using laser capture microscopy (LCM) for sample excision7,8. While LCM affords sample collection with single-cell and discrete brain region precision, the relatively low total RNA yields from the LCM approach can be prohibitive to RNA-Seq and other profiling approaches in mouse brain tissues and may require sub-optimal sample amplification steps. Here, a protocol is presented for microdissection and total RNA extraction from discrete mouse brain regions. Set-diameter tissue corers are used to isolate 13 tissues from 750-&mu;m serial coronal sections of an individual mouse brain. Tissue micropunch samples are immediately frozen and archived. Total RNA is obtained from the samples using magnetic bead-enabled total RNA isolation technology. Resulting RNA samples have adequate yield and quality for use in downstream expression profiling. This microdissection strategy provides a viable option to existing sample collection strategies for obtaining total RNA from discrete brain regions, opening possibilities for new gene expression discoveries.

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

RNA expression profiling of discrete mouse brain regions requires a precise and repeatable tissue collection strategy. A protocol that uses both coronal brain sectioning and tissue corer-assisted microdissection is described here. The yield and quality of total RNA obtained from the resulting samples confirms the utility of the outlined method.

Non-Laser Capture Microscopy Ansatz für die Mikrodissektion von Discrete-Maus Hirnregionen für Gesamt-RNA Isolierung und Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Laser Capture Mikrodissektion von Angereichert Populationen von Neuronen oder Single Neurons zur Genexpressionsanalyse Nach Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor (FGF) to provide an abundant supply of cells. NPCs were differentiated in the presence of a new combination of nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) and retinoic acid on dishes coated with poly-L-lysine and mouse laminin to obtain neuron-rich cultures. NPCs were also differentiated in the absence of neurotrophins, DBC and retinoic acid and in the presence of ciliary neurotrophic factor (CNTF) to yield astrocyte-rich cultures. Differentiated NPCs were characterized by immunofluorescence staining for a panel of neuronal markers including NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin and GAP43. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and STAT3, astrocyte markers, were detected in 10-15% of differentiated NPCs. To facilitate cell-type specific molecular characterization, laser capture microdissection was performed to isolate neurons cultured on polyethylene naphthalate (PEN) membrane slides. The methods described in this study provide valuable tools to advance our understanding of the molecular mechanism of neurodegeneration.

Human neuroprogenitor cells (NPCs) were expanded under proliferating conditions. NPCs were differentiated into neuron-rich cultures in the presence of a combination of neurotrophins. Neuronal markers were detected by immunofluorescence staining. To isolate a pure population of neurons, NPCs were differentiated on PEN membrane slides and laser capture microdissection was performed.

Laser Capture Mikrodissektion von Neuronen aus Differenzierte Menschen Neuroprogenitor Zellen in Kultur

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or between the same cell type in health and disease or following pharmacologic treatments.&#160;In the spinal cord, such preparation from motor neurons, the target of interest in many neurologic and neurodegenerative diseases, is complicated by the fact that motor neurons represent &#60;10% of the total cell population.&#160;Laser capture microdissection (LMD) has been developed to address this problem.&#160;Here, we describe a protocol to quickly recover, freeze, and section mouse spinal cord to avoid RNA damage by endogenous and exogenous RNases, followed by staining with Azure B in 70% ethanol to identify the motor neurons while keeping endogenous RNase inhibited.&#160;LMD is then used to capture the stained neurons directly into guanidine thiocyanate lysis buffer, maintaining RNA integrity.&#160;Standard techniques are used to recover the total RNA and measure its integrity.&#160;This material can then be used for downstream analysis of the transcripts by RNA-seq and qRT-PCR.

High-quality total RNA has been prepared from cell bodies of mouse spinal cord motor neurons by laser capture microdissection after staining spinal cord sections with Azure B in 70% ethanol.&#160;Sufficient RNA (~40-60 ng) is recovered from 3,000-4,000 motor neurons to allow downstream RNA analysis by RNA-seq and qRT-PCR.

Produktion von RNA für die Transkriptomische Analyse von Maus Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies durch Laser Capture Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Laser Mikrodissektion - Eine Demonstration der Isolation der einzelnen Dopamin-Neuronen und die gesamte ventrale Tegmentum

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial distribution. Such techniques also potentially skew gene expression analysis because the process itself can alter expression patterns in individual cells. Here we describe a laser capture microdissection (LCM) method to selectively collect specific brain regions affected by traumatic brain injury (TBI) by using a modified Nissl (cresyl violet) staining protocol and the guidance of a rat brain atlas. LCM provides access to brain regions in their native positions and the ability to use anatomical landmarks for identification of each specific region. To this end, LCM has been used previously to examine brain region specific gene expression in TBI. This protocol allows examination of TBI-induced alterations in gene and microRNA expression in distinct brain areas within the same animal. The principles of this protocol can be amended and applied to a wide range of studies examining genomic expression in other disease and/or animal models.

We describe the use of laser capture microdissection to obtain samples of distinct cell populations from different brain regions for gene and microRNA analysis. This technique allows the study of differential effects of traumatic brain injury in specific regions of the rat brain.

Stereotaktische Atlas-geführte Laser Capture Microdissection Hirnregionen von traumatischen Verletzungen betroffen

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.