Die Autoren danken Prof. Eero Castren für seine wertvolle Kommentare zum Manuskript. Die Arbeit wird durch Zuschüsse aus der Akademie von Finnland, Zentrum für internationale Mobilität von Finnland und finnische Graduate School of Neuroscience (Gehirn und Geist Doctoral Program) unterstützt.

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Um Gehirn Physiologie und Pathologie, besser zu verstehen, muss die Forschung auf eine Vielzahl von Vorbereitungskomplexitätsstufen durchgeführt werden, unter Verwendung der am besten geeigneten Techniken für jede Zubereitung. Derzeit werden eine Vielzahl von Methoden der Neurowissenschaften (von Ganzkörper-fMRI-Sub-Organellen STED-Mikroskopie) leicht an narkotisierten Tieren angelegt, während Experimente an wach und Tiere verhalten haben eine erhebliche methodische Herausforderung vertreten. Hier wird ein neuer Ansatz beschrieben, bei dem ein Labortier, obwohl sie fest Kopf fixiert ist, kann um eine Klima angehoben Mobil homecage bewegen und erkunden Sie die Umgebung unter Sachstressfreien Bedingungen. Der Kopf fest verhalten Tierpräparation hier vorge bietet eine Reihe entscheidender Vorteile. Erstens sind mit dieser Methode erhaltenen elektrophysiologischen oder Bilddaten kompromisslose weder Narkose noch durch Constrain-induzierten Stress. Die Positionierung der Maus in das MobilheimKäfig ist schnell und nicht betäubt das Tier sogar vorübergehend erforderlich. Zweitens sorgt die Klima angehoben homecage die mechanische Stabilität, die nötig ist, um Änderungen in feinen neuronale Morphologie zu quantifizieren und Einzelzell-elektrophysiologische Aktivität in wach Tiere aufzunehmen. Schließlich wird das Mobil homecage Design kompakter im Vergleich zu der sphärischen Laufband, so dass die Positionierung des mobilen homecage unter einer Standard aufrechten Mikroskop für Zwei-Photonen-Bildgebung oder Patch-Clamp-Aufnahme in das Gehirn wach Maus. Firm Kopf-Fixierung in der mobilen homecage erfordert die Implantation einer speziell entwickelten vierflügelige Metallhalter, mit einer runden Öffnung in der Mitte für optischen oder elektrischen Zugriff auf die zugrunde liegenden Hirnregion. Diese Metallhalter sind an dem Schädel mittels einer Kombination von Klebstoff, Dentalzement und einer kleinen Schraube in den Schädelknochen eingeschraubt angebracht. Dieses chirurgische Verfahren wurde auf der Grundlage einer großen Anzahl von zuvor entwickeltenveröffentlichten Verfahren, und es zeigte sich in einer stabilen und reproduzierbaren Herstellung Schädel Fenster führen. Für in vivo elektrophysiologischen Experimenten eine mondförmige Fenster 34, einer kleinen Größe Kraniotomie (weniger als 0,5 mm) 32 und einem gebohrten glasüberzogene Zubereitung 35 verwendet worden. Hier wurde die &quot;umgekehrte&quot; Schädel Fenster entweder mit einem großen (3,5 mm Durchmesser) oder klein (weniger als 0,5 mm Durchmesser) Kraniotomie implantiert. Minimierung Gehirn Bewegung ist wichtig für stabile Einzelzellableitungen, weshalb es ratsam ist, kleine Größe Kraniotomien für elektrophysiologische Experimente durchzuführen. Nach der Implantation des Schädelfenster für optische Abbildungsexperimente werden die Tiere ließ man mindestens 2 oder 3 Wochen, während dessen die ersten Fenster vorübergehend seine Transparenz verliert und gewinnt es (mit einer Ausbeute von 50-70%, abhängig von erholen der genetische Hintergrund des Mausstamm). Transparenz der Schädelfenster und stabilkeit des Zahnzement &quot;cap&quot; zum Schädel angebracht werden mittels eines regulären Binokular und physikalische Inspektion während der Tierbehandlung überprüft werden. Am Ende der 2-3 wöchigen Erholungsphase sollten diese Tiere, die keine Anzeichen von Rest post-operative Entzündungen oder mechanische Defekte im Zahnzement zeigen aus den Experimenten ausgeschlossen und beendet werden. Das optimale Alter zum Starten der Ausbildung der Mäuse 2-4 Monate (entsprechend dem Körpergewicht 20-40 g). Bei jüngeren Tieren kann Verankerung des Dentalzement &quot;cap&quot; zum Schädel unzuverlässig sein, die ihre Widerstandsfähigkeit gegenüber mechanischen Belastungen, die durch die Fortbewegung des Kopfes fest Maus in der Mobil homecage auferlegt wird erschwert. Obwohl die männlichen und weiblichen Mäusen gleichermaßen bereit sind, in mobilen homecage navigieren erscheinen, gibt es eine Tendenz zur besseren Prozentsatz der Schädelfenster der Wiedererlangung ihrer Transparenz bei weiblichen Mäusen (Daten nicht gezeigt) zu erreichen. Daher, um to eine ausgewogene Mischung von Geschlechtern in der Kohorte von Tieren für die Bildgebung ausgewählt, Implantation Schädelfenster in etwa 30% mehr männliche Mäuse empfohlen. Soziale Interaktionen sind bekannt für das Wohlbefinden der Tiere zu verbessern und Stress zu reduzieren, daher ist es ratsam, dass Wurf betrieben und parallel geschult und in Gruppenhaltung Käfige zusammengehalten. Im Gegensatz zu den für den Kugellaufband Vorbereitung 13 veröffentlichten Verfahren, wird die Methode unter Verwendung der mobilen homecage nicht verlangen, Anästhesie der Maus im Moment der Kopf-Fixierung. Dieser Unterschied ist wichtig, weil es um jegliche Restwirkungen, die sogar eine kurze und &quot;Licht&quot; Anästhesie Episode ist wahrscheinlich auf die physiologischen Messungen kurz nach erhalten haben. In der Tat, auch wenn in den Studien, in denen Kopf-Fixierung wurde unter Vollnarkose durchgeführt und die eigentlichen Experimente wurden nach einer kurzen Wartezeit 13 gestartet, kann man nichtauszuschließen, mögliche langfristige Auswirkungen des kurzen Narkose Episode auf den experimentellen Daten. Andere Studien haben auf Wasserentzug für die systematische Gewöhnung der Tiere, um die Fixierung Kopf verlassen und zur Belohnung Wasser als Mittel der Motivation, das Tier unbeweglich 36 zu bleiben. Jedoch begrenzt der Lohn-basierte Kopffixierungsmethode der Wahl des anwendbaren Verhaltenstests und, besonders wichtig, ist in einem der etablierten Stimulus-Belohnung Verbände. Im Gegensatz dazu ist die Methode der Maus Gewöhnung an Fixierung in mobilen homecage Kopf nicht verlangen, Wasserentzug und die anschließende Belohnung. Ergänzung der mobilen homecage mit einem Wasserzufuhrsystem für lang anhaltende Experimente empfohlen. Die Tiertrainingseinheiten und Experimente vorgestellt wurden hier während der Tageszeit (von 08.00 Uhr bis 18.00 Uhr), die physiologisch passive Zeit für die Mäuse, die unter dem Standard-12-Stunden-Lichtplan (li gehalten werden, entspricht getanGHTS auf 6 Uhr und ab 6 Uhr). Da die Wasseraufnahme wird direkt mit der Maus die Aktivität zugeordnet ist, während der passive Zeitraum Mäuse benötigen keine Wasserabgabe, wenn die Dauer eines Ausbildungs ​​/ Imaging / Aufnahme-Session hat 2 Stunden nicht überschreiten. Neben der Zeitpunkt und die Dauer der Trainingseinheiten, muss man die Frage nach der optimalen Anzahl der Sitzungen für Gewöhnung der Tiere an mobile homecage gewünschte Adresse. Zu diesem Zweck wurden zwei Kriterien, die zur Belastung durch den Kopf der Fixierung induzierten zu bewerten: i) Gewichtsverlust, und ii) die Bewegungsaktivität Niveau. Wie in Abbildung 6 dargestellt, Gewichtsverlust erreicht das durchschnittliche Niveau von 6% auf die Ausbildung Tag 2, und ist vollständig von Trainingstag 4 (6A) umgekehrt. Im Einklang mit der Dynamik wiegen, wird die Bewegungsaktivität Niveau der kopffesten Tiere am ersten Tag der Ausbildung unterdrückt, sondern stabilisiert durch Training Tag 4 (6D). Basierend auf diesen Messungen Anregungen wirt, die die minimale Dauer der Maus Ausbildungszeit auf mobilen homecage beträgt 4 Tage, wie im Protokoll hiermit beschrieben. Die Nutzung der Klima angehoben, Flachboden Mobil homecage erlaubt das Hinzufügen von komplexen Aufgaben (sensomotorische, Wahrnehmungs-und kognitiven) zu den Trainings Paradigmen für Kopf-fixierten Mäusen. In der vorliegenden Studie zwei Protokolle von Verhaltenstests werden vorgestellt. Beide Protokolle nutzen Geruch Cues und kann mit Längs Imaging / Aufnahmen in der Maus Kortex kombiniert werden. Obwohl die mobile homecage aus nicht-absorbierende Materialien hergestellt, noch muss man Berücksichtigung möglicher Interferenzen zwischen dem Geruch von dem Gerät und Test Geruch (s) zu nehmen. Ein weiterer Faktor, mit optisch / taktile Signale einer Verhaltens Experiment stören kann, ist die Verbindungsstelle zwischen der Wand und dem Einsatz, die nicht nahtlos und kann daher von dem Tier als Wahrzeichen wahrgenommen werden. Bemerkenswert ist hier, dass, um Tier Kummer während solcher inte minimierenrventions die Platzierung eines Geruchs-präsentierenden Baumwolle auf das mobile homecage Wand, sollte der Experimentator üben, um solche Interventionen so schnell wie möglich durchzuführen und längeren Umgang mit dem Kohlenstoffkäfig. Alternative Strategien für neuartige Geruch / Objektpräsentation sind denkbar, z. B. indem Hydrogel-basierte Lösung, Tropfen oder Objekte (z. B. Futterchips) auf kleine Regale an der inneren Oberfläche des Kohlenstoffkäfigwand auf der Höhe mit Kopf Positionierung des Tieres kompatibel angebracht. Mobil homecage ermöglicht kopffesten Tiere eine breite Palette von zweidimensionalen Bewegungen einschließlich horizontaler Fortbewegung, situp, Pflege, Rühren, lecken, Nasen-Stossen, Fachvorderpfote Bewegungen und Wand berühren mit Vorderbeine, wie in der vorliegenden Studie dargestellt, um durchzuführen . Mit mobilen homecage und die Protokolle hier vorge können die Forscher die sensomotorische neuronale System mit einem hohen Maß an Kontrolle über sowohl die Stimulation Zustand studierens und die Verhaltens Lese-Outs. Darüber hinaus können Studien der kognitiven Fähigkeiten bei wachen Mäusen während Anlage, räumlichen Navigation und Entscheidungsaufgaben durchgeführt werden. Es gibt mehrere praktische Beschränkungen dieses Verfahrens. Zunächst wird eine erhebliche Menge an Druckluft benötigt, um die homecage Hebekraft zu erzielen und dauerhafte Experimente durchzuführen. Zweitens die Mobil homecage in ihrer gegenwärtigen Umsetzung nur 18 cm im Durchmesser und eine relativ kleine und einfache Raum im Vergleich zu der virtuellen Realität, wobei eine komplexe Versuchsumgebung ohne räumliche Einschränkungen gestaltet werden daher. Drittens, während Whisker Stimulation und Belohnung basierte hier vorgestellten, wurde ein Gerät verwendet, das die Möglichkeit der Wandkontakt für die Maus beschränkt. Hinzufügen eines externen optischen oder sensorischen Stimulationskanal (z. B. ein Auge gerichteten Lichtprojektor), würde die Gestaltung eine ergonomische und kompakte Vorrichtung im Vergleich zu benötigendie Mehrfachbild-oder Dome-Projektionslösungen, die in der Kugellaufexperimente verwendet wurden. Zusammenfassend ist die Nutzung der kopffesten Mäuse sich in die Luft gehoben Handy-homecage erleichtert die Studien, die Zell-, Molekular-und Verhaltensebene der Beobachtung und Manipulation in einem einzigen Experiment zu kombinieren. Hier dargestellten speziellen Anwendungen gehören Zwei-Photonen-mikroskopisch visuelle Darstellung, intrinsischen optischen Signal Imaging und Patch-Clamp-Aufnahmen in nicht-narkotisierten Mäusen verhalten. Es wird erwartet, dass dieser Ansatz neue Horizonte in der Experimente an wach, verhalten Maus öffnen und dienen als nützliche Werkzeug für die Medikamentenentwicklung und Grundlagenforschung der Gehirnfunktion.

Ein spannender neuer Trend in den Neurowissenschaften ist es, experimentelle Ansätze für die molekulare und zelluläre Untersuchung der neuronalen Netzwerke im Gehirn wach, verhalten Nagetiere zu entwickeln. Solche Ansätze halten versprechen, neues Licht auf die neurophysiologischen Prozesse, die motorische Funktion, sensomotorische Integration, Wahrnehmung, Lernen, Gedächtnis, sowie Verletzungen Progression, Neurodegeneration und genetische Krankheiten zugrunde liegen, zu vergießen. Darüber hinaus die Aufnahme von wachen Tier Gehirn hält Versprechen in der Entwicklung von neuen therapeutischen Mittel und Behandlungen. Es gibt ein wachsendes Bewusstsein, dass der Anästhesie, die üblicherweise in der neurophysiologischen Experimenten verwendet wurde, können die grundlegenden Mechanismen der Hirnfunktion beeinflussen, möglicherweise zu einer fehlerhaften Interpretation von experimentellen Ergebnissen führt. So die weit verbreitete Betäubungsmittel Ketamin schnell zu Bildung neuer dendritischen Dornen und verbessert die synaptische Funktion 1; weitere häufig verwendet anesthetic Isofluran-Narkose bei chirurgischen Ebenen komplett unterdrückt spontane kortikale Aktivität bei neugeborenen Ratten und Blöcke Spindel-Burst-Schwingungen in zwei erwachsenen Tieren. Derzeit wird nur eine begrenzte Anzahl von Ansätzen ermöglichen Experimente in nicht narkotisierten Mäusen durch Zwei-Photonen-mikroskopische Bildgebung oder Patch-Clamp-Aufnahmen. Diese Ansätze können in frei beweglichen Kopf und fixierte Präparate aufgeteilt werden. Die einzigartige Attraktivität eines frei beweglichen Tier Zubereitung besteht darin, dass die Bewertung natürlicher Verhalten, einschließlich Ganzkörperbewegungen während der Fahrt. Ein Weg, um Bild im Gehirn eines sich frei bewegenden Nagetier ist ein miniaturisiertes Head-Mounted-Mikroskop oder Endoskop 3-5 befestigen. Miniaturisierte Vorrichtungen neigen jedoch dazu, begrenzte optische Leistung im Vergleich zur Ziel-basierten Zwei-Photonen-Mikroskopie haben, und können nicht leicht mit Ganzzell-Patch-Clamp-6 kombiniert werden. Die ExiStachel-Lösungen für Kopf-Fixierung einer wach Nager wurden in erster Linie entweder auf physische Zurückhaltung 7,8 oder auf die Ausbildung der Tier freiwillige Kopfstütze 9 aufweisen verlassen. Ein weiterer beliebter Ansatz ist es, das Tier Gliedmaßen, indem Sie es auf, z. B. eine Kugellaufband 10 zu bewegen; Dieser Ansatz wird häufig mit rechnergenerierten virtuellen Realität kombiniert. Elektrophysiologische Experimente am Kopf fest Mäusen haben meist verwendet, extrazelluläre Ableitungen und wurden zur zentralen Regulierung der Herz-Kreislauf-Funktion 11, Auswirkungen der Narkose auf die neuronale Aktivität 12, die auditive Reaktion im Hirnstamm 13 und 14 Informationsverarbeitung zu untersuchen. Die bahnbrechenden intrazellulären / Ganzzellableitungen an wachen verhalten Tiere wurden in den 2000er Jahren durchgeführt und haben sich auf die neuronale Aktivität, die Wahrnehmung und Bewegung 15-20 bezogenen konzentriert. Etwa zur gleichen Zeit wurden die ersten Studien zur mikroskopischen Abbildung wach Mäuse veröfeingesetzten Ausschusses, in der zwei-Photonen-Mikroskopie wurde in der sensorischen Kortex von Ratten physisch zurückhaltend 7 und an Mäusen auf einer Kugellaufband 21 läuft eingesetzt. Nachfolgende in vivo Mikroskopie und elektrophysiologischen Studien gezeigt, dass eine Kopffixierung Vorbereitung erfolgreich mit Verhaltensparadigmen basierend auf Vordergliedmaße Bewegungen, Geruchserkennung, Rühren, und leckt 8,22-25 kombiniert werden. Mäuse auf der Kugellaufband gelegt trainiert werden kann, um die virtuelle visuelle Umgebung von einem Computer generiert 10,26 navigieren. Die intrazelluläre / ​​extrazellulären Aufnahmen gezeigt, dass in einem Kopf-fixierten Tier Navigation wie virtuelle Umgebung, die Aktivierung von Hippocampus-Ortszellen nachgewiesen werden 27. In einer virtuellen visuellen Umgebung, Mäuse zeigen normale bewegungsbezogenen Theta-Rhythmus in der lokalen Feldpotential-und Theta-Phasen-Präzession während der aktiven Bewegung 27. Vor kurzem hat die räumliche und zeitliche activity Muster neuronaler Populationen wurden optisch in Mäusen während der Arbeitsspeicher Entscheidungsaufgaben in einer virtuellen Umgebung 28 aufgezeichnet. Trotz Durchbruch Forschungs aktiviert ist, hat die sphärische Laufband Design einige inhärente Einschränkungen. Zuerst wird das Tier benötigt, um auf einer unbegrenzten Oberfläche einer rotierenden Luft angehoben Ball, der keine greifbaren Hindernisse wie Wände oder Barrieren stellt bewegen. Diese Einschränkung ist nur zum Teil durch die computergenerierten &quot;Virtual Reality&quot; kompensiert werden, weil visuelle Eingabe ist wohl weniger effektiv an Mäusen und Ratten im Vergleich zur taktilen Sinnes (zB Whisker-touch oder lecken), die diese Arten natürlich verlassen auf. Zweitens kann die beträchtliche Krümmung der Kugeloberfläche unangenehm für den Labormäusen zu Fuß auf einem flachen Boden in ihren Käfigen verwendet wird. Schließlich ist die bloße Durchmesser der Kugel (mindestens 200 mm für Mäuse und 300 mm für Ratten) macht die vertikale Größe der sphärischenLaufband-Gerät relativ groß. Dies macht es schwierig, Kugellaufband mit den meisten handelsüblichen Mikroskopie-Setups zu kombinieren, und erfordert oft eine neue Einrichtung rund um das Laufband durch maßgeschneiderte Mikroskop Frames. Hier wird eine neue Methode beschrieben, bei dem ein Kopf-Fest Maus kann um eine Luft-Mobil homecage angehoben, die einen flachen Boden und Wände bietet greifbare bewegen, und erkunden Sie die physische Umgebung unter stressfreien Bedingungen. Dieser Artikel beschreibt die Verfahren der Maus Ausbildung und Kopf-Fixierung und liefert repräsentative Beispiele, wo Zwei-Photonen-Mikroskopie, intrinsischen optischen Bildgebung und Patch-Clamp-Aufnahmen werden im Gehirn von Mäusen durchgeführt wach verhalten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="733">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:141px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:173px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Tweezers&#160; Stainless Steel, 115mm</td>
			<td style="width:161px;">XYtronic</td>
			<td style="width:141px;">XY-2A-SA</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Animal trimmer, shaving machine</td>
			<td style="width:161px;">Aesculap</td>
			<td style="width:141px;">Isis GT420</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Binocular Microscope</td>
			<td style="width:161px;">Zeiss&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Stemi 2000</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad</td>
			<td style="width:161px;">Supertech</td>
			<td style="width:141px;">TMP-5b</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Blunt microsurgical blade</td>
			<td style="width:161px;">BD</td>
			<td style="width:141px;">REF 374769</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Borosilicate tube with filament</td>
			<td style="width:161px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:141px;">BF120-69-10</td>
			<td style="width:173px;">For patch pipette production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Camera&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Foscam</td>
			<td style="width:141px;">FI8903W</td>
			<td style="width:173px;">Night visibility</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Carprofen</td>
			<td style="width:161px;">Pfizer</td>
			<td style="width:141px;">Rimadyl vet</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dental cement</td>
			<td style="width:161px;">DrguDent, Dentsply</td>
			<td style="width:141px;">REF 640 200 271</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:161px;">FaunaPharma</td>
			<td style="width:141px;">Rapidexon vet</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Disposable drills</td>
			<td style="width:161px;">Meisinger</td>
			<td style="width:141px;">HP 310104001001008</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dulbeco&#8217;s PBS 10X</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:141px;">D1408</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dumont #5 forceps, 110 mm</td>
			<td style="width:161px;">FST</td>
			<td style="width:141px;">91150-20</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:259px;">Eyes-lubricant</td>
			<td style="width:161px;">Novartis</td>
			<td style="width:141px;">Viscotears</td>
			<td style="width:173px;">For eyes protection during operation and as viscose solution for immersion&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Foredom drill control</td>
			<td style="width:161px;">Foredom&#160;</td>
			<td style="width:141px;">FM3545</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Foredom micro motor handpiece</td>
			<td style="width:161px;">Foredom</td>
			<td style="width:141px;">MH-145</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Four-winged metal holder</td>
			<td style="width:161px;">Neurotar</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Head Holder for Mice</td>
			<td style="width:161px;">Narishige</td>
			<td style="width:141px;">SG-4N</td>
			<td style="width:173px;">Assembled on stereotaxic instrument</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Hemostasis Collagen Sponge</td>
			<td style="width:161px;">Avitene, Ultrafoam BARD</td>
			<td style="width:141px;">Ref 1050050</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Imaris</td>
			<td style="width:161px;">Bitplane</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Ketamine</td>
			<td style="width:161px;">Intervet</td>
			<td style="width:141px;">Ketaminol vet</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Kwik-Sil&#160;</td>
			<td style="width:161px;">WPI</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Mai Tai DeepSee laser</td>
			<td style="width:161px;">Spectra-Physics</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Micro dressing forceps, 105 mm</td>
			<td style="width:161px;">Aesculap</td>
			<td style="width:141px;">BD302R</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Microelectrode puller</td>
			<td style="width:161px;">Narishige</td>
			<td style="width:141px;">PC-10H</td>
			<td style="width:173px;">Vertical puller for glass pipette production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:161px;">Sensapex</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Mini bolt</td>
			<td style="width:161px;">Centrostyle</td>
			<td style="width:141px;">Ref. 00343 s/steel M1.0x4.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Mobile Homecage</td>
			<td style="width:161px;">Neurotar</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:259px;">Multiphoton Laser Scanning Microscope</td>
			<td style="width:161px;">Olympus</td>
			<td style="width:141px;">FV1000MPE</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:259px;">Nonwoven swabs 5&#215;5</td>
			<td style="width:161px;">Molnlycke Health Care</td>
			<td style="width:141px;">Mesoft</td>
			<td style="width:173px;">Surgical tampons</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Polyacrylic glue</td>
			<td style="width:161px;">Henkel</td>
			<td style="width:141px;">Loctite 401</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:259px;">Round glass coverslip&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:161px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td rowspan="2" style="width:141px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">1.5 thickness&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Small animal stereotaxic instrument</td>
			<td style="width:161px;">David Kopf Instruments</td>
			<td style="width:141px;">900</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Student iris scissors, straight 11.5 cm</td>
			<td style="width:161px;">FST</td>
			<td style="width:141px;">91460-11</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Xylazine</td>
			<td style="width:161px;">Bayer Health Care</td>
			<td style="width:141px;">Rompun vet</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents

Es ist allgemein anerkannt, dass die Verwendung der Vollnarkose kann die Relevanz der aus einem lebenden Tier Gehirn erhalten oder elektromikroskopische Daten zu untergraben. Darüber hinaus ist die lange aus der Narkose begrenzt die Häufigkeit wiederholter Aufnahme / Bild Episoden in Längsschnittstudien. Daher sind neue Methoden, die stabile Aufnahmen von nicht-narkotisierten Mäusen Verhaltensweisen erlauben würde erwartet, dass die Felder von Mobilfunk-und kognitiven Neurowissenschaften zu fördern. Bestehende Lösungen reichen von der bloßen körperlichen Zwanges, um anspruchsvollere Ansätze wie Linear-und Kugellaufbänder in Kombination mit computergenerierten virtuellen Realität eingesetzt. Hier wird eine neue Methode beschrieben, bei dem ein Kopf-Fest Maus kann um eine Klima angehoben Mobil homecage bewegen und erkunden Sie die Umgebung unter stressfreien Bedingungen. Diese Methode ermöglicht es Forschern, Verhaltenstests (zB Lernen, Gewöhnung oder neuartige Objekterkennung) gleichzeitig mit führenZwei-Photonen-mikroskopische Bildgebung und / oder Patch-Clamp-Aufzeichnungen, die alle in einem einzigen Experiment kombiniert. Dieses Video-Artikel beschreibt die Verwendung des wachen Tier Kopf-Fixierung Gerät (Mobil homecage), zeigt die Verfahren der Tier Gewöhnung, und veranschaulicht eine Reihe von möglichen Anwendungen des Verfahrens.

Die hier vorgestellte Methode wird für die mikroskopische Bildgebung oder Einzelzellelektrophysiologischen Ableitungen an wachen, kopffesten, aber ansonsten frei bewegen und verhalten Mäusen bestimmt. Das Tier kann in zwei Dimensionen in einer realen (im Gegensatz zu virtuellen), Sachanlagen und vertrauten Umgebung, zu bewegen, während Schädel der Tiere ist fest mit dem Kopffixierung Arm fixiert. Gewöhnung der Mäuse in die Luft gehoben-Mobil homecage besteht aus 4-6 Tagen zweimal täglich 2-Stunden-Trainingseinheiten (Abbildung 1). Die ausgebildeten Tiere können dann in den Experimenten sofort verwendet werden. Eine typische Studie umfasst eine Anzahl von Bilderzeugungseinheiten oder Patch-Clamp-Aufnahmen, die in Abständen von einigen Stunden bis zu mehreren Tagen oder Wochen voneinander beabstandet sind. Wichtig ist, optische und elektrophysiologische Aufzeichnungen gleichzeitig mit kognitiven und Verhaltens Stimuli und Anzeigen in einem einzigen Experiment durchgeführt werden. Um die mechanische Stabilität zu beurteilenMauskopf-Fixierung in der mobilen homecage wurden die Bildsequenzen der kortikalen Gefäße mit fluoreszierenden konjugierten Dextran und der kortikalen Dendriten ausdrücken YFP markierten gesammelt, während die Versuchstiere wurden die Navigation im mobilen homecage (Abbildung 2). Die maximalen Verschiebungen des Gehirns während der Fortbewegung des Tieres nicht überschreiten typischerweise 1-1,5 Mikrometer. Diese Verschiebungen aufgetreten in den horizontalen Richtungen und sehr selten in einem detektierbaren Verschiebung der Abbildungsebene resultiert, überflüssig macht eine Korrektur von Bewegungsartefakten. Stabile Kopf-Fixierung in der mobilen homecage ermöglicht die Quantifizierung der einzelnen dendritischen Dornen an wachen Tieren mit der gleichen Zuverlässigkeit wie bei narkotisierten Mäusen. Dichte dendritischer Fortsätze, Morphologie und den Umsatz während Langzeitstudien mit mehreren Bilderzeugungseinheiten in Abständen von einigen Stunden bis zu mehreren Tagen oder Wochen durchgeführt überwacht werden. Die Benutzerfreundlichkeit des mi) Zwei-Photonen-Mikroskopie auf den Thy1-GCaMP3 transgenen Mäusen und ii) intrinsischen optischen Signal Bildgebung in Wildtyp-Mäusen: obil homecage für funktionelle optische Bildgebung wurde in somatosensorischen Kortex von Mäusen wach mit zwei Ansätze getestet. Ca 2 +-Imaging wurde in der Schicht 2/3, die Zellkörper der Neuronen viele fluoreszierend markierten, sowie deren Dendriten und Axone (Fig. 3) enthält, durchgeführt. Die Grundstücke der Fluoreszenz-über-Zeit aus ausgewählten Regionen von Interesse (ROI) sind in Abbildung 3 dargestellt ist, zeigen spontane neuronale Aktivität (gemessen als vorübergehende Erhöhung des GCaMP3 Fluoreszenz) bei aktiver Navigation der Maus die in der mobilen homecage. Die optische Bildgebung basierend auf intrinsische Signale ermöglicht die Abbildung der räumlichen Verteilung der funktionellen Domänen. Abbildung 4 zeigt wellenförmige Veränderungen des Blutsauerstoffpegel (an die regionale neuronale Aktivierung), die entlang somatosensorischen Kortex in Reaktion auf v propagiertibrissa Stimulation bei einer Frequenz von 0,05 Hz liegt. Um Machbarkeit der Patch-Clamp-Aufnahmen mit mobilen homecage zu testen, verwendeten wir 2-3 Monate alten C57BL/6J-Mäusen. Layer 2/3 Neuronen im somatosensorischen Kortex wurden in Ganzzellkonfiguration mit Stromzange-Modus aufgenommen. Patch-Clamp-Aufnahme im Gehirn von Mäusen wach Kopf fest auf mobilen homecage im Wesentlichen der Patch-Clamp in Hirnschnitten blenden. Etwa 50% der Versuche führte zu erfolgreichen Gigaseal Bildung, von denen mehr als 70% ergab stabile Gesamtzellkonfiguration Aufnahme. Vorgänge von Giga Kontaktverluste durch mechanische Verschiebung der Zellen beobachtet. Abbildung 5 zeigt eine 60-Sekunden-Fragment einer repräsentativen 10-Minuten-langen Strom-Clamp-Aufzeichnung mit Episoden von aktiv (Laufen) Maus und passive (Ruhe-) Staaten korreliert. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in"src = &quot;/ files/ftp_upload/51869/51869fig1highres.jpg&quot; width = &quot;600&quot; /&gt; Abbildung 1. Verfahren Kopf-Fixierung von wachen Mäusen in der mobilen homecage. A) Übersicht über die Klima angehoben homecage Mobildesign und Illustrationen der allgemeinen Konzept. B) Schematische Darstellung eines typischen Versuchszeitleiste. Die Untersuchung beginnt mit der Implantation des Schädelfenster zwei Wochen vor der Gewöhnung die Maus, um die Handhabung und die Verpackung, die durch acht zweimal täglichen Training folgt. Die typische Studie umfasst eine Anzahl von Abbildungseinheiten oder Patch-Clamp-Aufnahmen, die in Abständen von einigen Stunden bis zu mehreren Tagen oder Wochen voneinander beabstandet sind. Beide optische und elektrophysiologische Messungen können parallel mit kognitiven oder Verhaltens Reize und Anzeigen in einem einzigen Experiment durchgeführt werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 2. Beispiel der Zweiphotonen mikroskopische Bildgebung am wachen Mäusen bewegen das Mobil homecage. A, B) Kortikale Gefäßsystem, mit dem 70 kDa-Texas Red-konjugiertem Dextran markiert. Der Durchmesser der einzelnen Gefäßsegmente wird durch Auftragen im Laufe der Zeit den Verlauf der über das Gefäßlumen während Perioden der Ruhe-und der Maus ausgeführt (A) gezogenen Linien gemessen. Die Rate der Blutfluss in Arterien und Venen wird durch Zeilenabtastung entlang der parallel zur Gefäßwand (B). C, D) Feine Details der neuronalen Morphologie im Gehirn von transgenen Mäusen, die visualisiert YFP in Subpopulation der Ausdruck gezeichneten Linien gemessen Neuronen unter der Thy1-Promotors. Dreidimensionale Rekonstruktion der Pyramidenzellen in der Maus den somatosensorischen Kortex (C). Die Bilder eines dendritischen bRanch in einem wach, verhalten Maus erworben werden, für die Quantifizierung der einzelnen dendritischen Dorn Morphologie (D). E) Quantifizierung von Hirn Bewegung durch Mausbewegungen verursacht ausreichend stabil. Größere Verschiebungen Amplitude korrelieren mit Perioden von der Maus die Lauf. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Fig. 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig3highres.jpg" width="600" /> Abbildung 3. Beispiel der neuronalen Aktivität in Bevölkerung wach Thy1-GCaMP3 Maus bewegt, um den mobilen homecage. A) Zwei-Photonen-Bild der kortikalen Schicht II / III-Neuronen. ROIs, zum Beispiel neuronale Zellkörper, Dendriten und Axone sind gelb. B) gezeigt AF / F Spuren der GCaMP3 Fluoreszenz von ROIs in A gezeigt (Zeit series bei 1,5 Sekunden / Bild aufgenommen). C) Zoom-In Bereich auf 65 ms / Frame abgebildet. D) Fluoreszenz von gelb ROIs in C über der Zeit aufgetragen, zeigt die vorübergehende Erhöhungen (rot) in der GCaMP3 Fluoreszenz, die an der Aktion entsprechen Potenzial-induzierte Ca 2 +-Einstrom Episoden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Fig. 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig4highres.jpg" width="600" /> 4. Beispiel Abbilden der räumlichen Verteilung der funktionellen Antworten im Kortex einer wachen Maus durch Abbilden der intrinsischen optischen Signale. A) Hellfeld-Blick auf die oberflächlichen Blutgefäße durch die Schädelfenster. B) Magnitude Karte von der Baseline-Aktivität in der mobilen homecage während eines 6-Minuten-Episode. C) Magnitude Karte neuronaler Aktivität entlang somatosensorischen Kortex in Reaktion auf die vibrissa Stimulation mit einer Frequenz von 0,05 Hz ausbreitet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig5highres.jpg" width="600" /> 5. Beispiel der Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung in der Rinde einer wachen Maus bewegen das Mobil homecage. A) Strom-Clamp-Aufzeichnung von einem Neuron in der Maus Rindenschicht 2/3. Eine 0,5 sec, 100 pA Strominjektion (unterhalb der Spur angegeben) resultiert in einem Burst von Aktionspotentialen. Die Zelle zeigte Spike Frequenzanpassung charakteristisch für Pyramidenzellen. B) Dauerstrom-Clamp-Aufzeichnungaus dem gleichen Neuron mit der Maus &#39;Bewegungsaktivität (in rosa über der Kurve dargestellt) korreliert. Repräsentative spontane Aktivität der Schicht 2/3 Neuron in Zeiten der Maus ruhen (C) und Laufen (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig5highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Fig. 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig6highres.jpg" width="600" /> Abbildung 6. Tiergewichtsverlust und Bewegungsaktivität von head-fixed/non-fixed Mäusen während der Trainingseinheiten in der Mobil homecage. A) Tiergewicht (Mittelwert + SD,%) vor dem Training. Beachten Sie, dass die Gewichtsabnahme wird vollständig von der 8.7-ten Trainingseinheit. B) Flugbahn der horizontalen Fortbewegung bezogen auf die mobile homecage der Maus die umgekehrt,die von der verfolgten Bewegung der mobilen homecage während 8. Trainingseinheit. C) Raupenbewegungen eines nicht-Kopf-Fest Maus Erkundung der runden Käfig während der 8. Trainingseinheit. D) Dauer der Kopf fixiert (Kreis) hochgerechnet wurde und nicht fest (Dreieck) Mäuse Bewegung während 1-4 th Tag der Ausbildung (Mittelwert + SD,%). Beachten Sie, dass an Tag 4, zeigen kopffesten Mäusen weder Einfrieren (wie am 1. Tag), noch übermäßige Bewegungsaktivität. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig6highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents

Diese Methode erstellt eine greifbare, vertraute Umgebung für die Maus zu navigieren und zu erkunden während der mikroskopischen Abbildung oder Einzelzellelektrophysiologischen Ableitungen, die feste Fixierung des Kopfes des Tieres verlangen.

Flach platt Klima angehoben Plattform: Eine neue Methode zur Kombination von Verhalten mit Mikroskopie oder Elektrophysiologie auf Awake frei bewegen Nagetiere

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a ...

flat-floored-air-lifted-platform-new-method-for-combining-behavior

Research

JoVE Journal

Behavior

22.5K Aufrufe.  University of Helsinki.  Diese Methode erstellt eine greifbare, vertraute Umgebung für die Maus zu navigieren und zu erkunden während der mikroskopischen Abbildung oder Einzelzellelektrophysiologischen Ableitungen, die feste Fixierung des Kopfes des Tieres verlangen. 