Die meisten grundlegenden und translationalen Arbeiten stammen von anästhesierten Tieren. Anästhetika können der Datenanalyse und -interpretation Störvariablen hinzufügen. Diese Arbeit ermöglicht es der Wachbildgebung bei Ratten, dieses Problem zu umgehen.
Dieses Design ist recht einfach. Die gesamte Baugruppe ist leicht, so dass sie das normale Leben des Tieres nicht beeinträchtigt. Das bedeutet, dass es auch für die langfristige chronische Bildgebung verwendet werden kann.
Bei der Demonstration dieses Verfahrens wird Dr. Mehwish Bhatti, ein leitender Postdoktorand aus unserem Labor, helfen. Beginnen Sie mit der Herstellung des Kopfimplantats mit einer CAD-Software, um den Bereich hinter dem Bregma und neben der Mittellinie, die auf dem somatosensorischen Kortex zentriert ist, abzubilden. Stellen Sie sicher, dass das Kopfimplantat einen Bereich von 0,9 bis 1,9 Millimetern auf dem Schädel abdeckt, der vom Bildgebungsbereich entfernt ist.
Verwenden Sie nur drei Schrauben, um das Kopfimplantat am Rattenschädel zu verankern. Entwerfen Sie alle Schraubenlöcher auf der gegenüberliegenden Seite der Mittellinie im kontralateralen Teil der Bildhalbkugel. Damit die Kopfkappe mit Drähten am Kopfimplantat befestigt werden kann, platzieren Sie einen Hohlstab im oberen Teil des Kopfimplantats.
Entwerfen Sie als Nächstes die Kappe und stellen Sie sicher, dass sie den Bildgebungsbereich vollständig abdeckt und vor Traumata schützt. Fügen Sie der Kopfkappe eine Krümmung hinzu, damit sie sich an die Form des Kopfes anpasst, ohne die täglichen Aktivitäten des Tieres in den standardmäßig ausgestalteten Käfigen zu erschweren. Schneiden Sie die Innenseite der Kopfkappe in eine breitere rechteckige Form, damit der obere Teil des Kopfimplantats hineinpasst.
Schneiden Sie senkrecht zu diesem Rechteck zwei weitere rechteckige Bereiche ab, um die Kopfkappe am Kopfimplantat zu verankern. Um die Kopfkappe auf dem Kopf der Ratte zu befestigen, führen Sie die Drähte durch den oberen ausgehöhlten Stab des Kopfimplantats. Gestalten Sie das Kopfgestell so, dass sich ein geschnittenes Teil durch den oberen Steg des Kopfimplantats bewegen kann und mit einer Klemme fixiert wird.
Um die kontralaterale Seite für die Bildgebung zugänglich zu machen, winkeln Sie den anderen geschnittenen Teil an, um zusätzliche Festigkeit zu bieten, um den Rattenkopf fixiert zu halten. Drucken Sie das Kopfimplantat und die Kopfkappe mit dem 3D-Drucker. Messen Sie das Gewicht des Tieres, um die Menge des zu verabreichenden Anästhetikums zu berechnen.
Betäuben Sie das Tier durch intraperitoneale Injektion von Natrium-Pentobarbital. Bei dieser Operation können mehrere Anästhesiealternativen wie Isofluran, Ketamin oder Xylazin verwendet werden. Injizieren Sie Atropin intramuskulär, um die Schleimsekretion während der Atmung zu reduzieren.
Rasieren Sie mit einem Haarschneider den Kopf der Ratte, beginnend zwischen den Augen bis zur Rückseite der Ohren, fünf Millimeter um die Mittellinie zentriert. Überwachen Sie dann die partielle Sauerstoffsättigung und die Herzfrequenz mit einem Pulsoximeter und einer Herzfrequenzmessersonde, die am Hinterbein der Ratte befestigt ist. Wischen Sie den Kopf der Ratte und die Umgebung dreimal mit Betadine und alternativ mit 70%igen Alkoholtüchern ab.
Fixiere die Ratte in einem stereotaktischen System. Führen Sie als Nächstes eine mit Vaseline geschmierte rektale Sonde ein, um die Körpertemperatur der Ratte zu messen und sie durch das Rückkopplungssystem der Heizdecke aufrechtzuerhalten, um eine Unterkühlung nach der Verabreichung des Anästhetikums zu vermeiden. Tragen Sie Augensalbe auf beide Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern.
Verabreichen Sie 2 % Lokalanästhetikum subkutan über die Operationsstelle und drei Millimeter laktatierte Ringer-Lösung bei Raumtemperatur subkutan, um eine Austrocknung zu verhindern und die Versorgung während der Operation zu gewährleisten. Entfernen Sie mit einer scharfen chirurgischen Schere den Teil der Haut über der Operationsstelle. Präparieren und entfernen Sie einen Teil der Haut zwischen Ohr und Auge im temporalen Teil des Kopfes.
Entfernen Sie mit einem Skalpell das darunter liegende Hautgewebe, um den Schädel freizulegen. Reinigen Sie dann den Schädel mit sterilisierter Baumwollgaze. Durchtrennen Sie den Schläfenmuskel und legen Sie den Schädelbereich auf der kontralateralen Hemisphäre für das Kopfimplantat frei.
Setzen Sie das Kopfimplantat auf den Schädel, um die Position der Verankerungsschrauben für das Implantat zu bestimmen. Markieren Sie nun den Schädel mit Tusche, um die Schrauben mit dem Bohrer zu bohren. Bohren Sie die Gratlöcher für die Schrauben mit dem Dentalbohrer drei und schrauben Sie das Kopfimplantat fest.
Trocknen Sie den Schädel mit steriler Gaze und tragen Sie eine dünne Schicht Gewebekleber um und unter dem Kopfimplantat auf, um es auf den Schädel zu kleben. Verwenden Sie Zahnzement, um das Kopfimplantat weiter zu stützen, und lassen Sie den Zement zwei bis drei Minuten trocknen. Verwenden Sie außerdem den dritten Zahnbohrer, um die Dicke eines 7,5 Millimeter mal 7,5 Millimeter großen Bereichs auf der linken Seite des Schädels direkt hinter dem Bregma und seitlich der Mittellinie auf 50 Mikrometer zu verringern.
Tragen Sie eine topische antibiotische Salbe auf die Operationsstelle auf und bedecken Sie sie dann mit einer dünnen Schicht Silikonkautschuk, um den dünnen Schädel zu schützen. Decken Sie als Nächstes die Operationsstelle mit der Kopfkappe ab und fixieren Sie sie mit den beiden kleinen Drähten, die sowohl durch das Kopfimplantat als auch durch die Kopfkappe verlaufen. Tragen Sie Silikonkautschuk auf, um die Kopfkappe und den Schädel zu bedecken, um die Kopfkappe weiter auf dem Kopf der Ratte zu stabilisieren.
Verabreichen Sie Buprenorphin und Antibiotika intraperitoneal, um Schmerzen und Entzündungen zu behandeln bzw. Infektionen vorzubeugen. Gezeigt werden die optischen Bildgebungssignale aus der summierten Antwort einer wachen Ratte und einem Einzelversuch einer anästhesierten Ratte. Die funktionelle Reaktion der Ratte mit festem Wachkopf ist 140-mal stärker als die der anästhesierten Ratte.
Achten Sie darauf, nicht zu viel Zement über die Kopfplatte zu geben. Es kann verhindern, dass die Kappe richtig befestigt wird. Diese Methode kann in großem Umfang auf die Neurobildgebung des wachen Kopfes mit fixiertem dünnem Schädel angewendet werden.
Mit Kraniotomien kann es auf andere Neuroimaging-Protokolle ausgeweitet werden, einschließlich funktioneller Ultraschallbildgebung, Kalziumbildgebung und Fluoreszenzbildgebung. Die Bildgebung im Wachzustand ermöglicht eine neue Arbeit ohne die verwirrenden Variablen, die mit Anästhetika eingeführt werden.
