Dieses Protokoll beschreibt, wie man ein Polysomenprofil erzeugt, das molekulare Details über die Aktivität von Ribosomen in der Zelle enthüllt. Diese Technik ermöglicht es Benutzern, die wertvollen Informationen eines Polysomenprofils zu erhalten, die keinen Zugang zu automatisierten Gradientenfraktionierungssystemen haben. Nehmen Sie sich Zeit für die Vorbereitung der Farbverläufe und lagern Sie die Farbverläufe an einem Ort, an dem sie nicht durch einen Kompressor oder andere mechanische Vorgänge unterbrochen werden, wenn sie sich in einem linearen Farbverlauf absetzen.
Um zu beginnen, bereiten Sie Stammlösungen von 7 und 47% Saccharose in Saccharosegradientenpuffer vor. Filter sterilisieren die Saccharose-Stammlösungen durch einen 0,22-Mikron-Filter. Bereiten Sie 14 Milliliter 17, 27 und 37% Saccharoselösungen durch Dosieren und Mischen der 7- und 47%-Stammlösungen vor.
Legen Sie sechs Polypropylen-Zentrifugenröhrchen in ein Reagenzglas-Rack. Stellen Sie sicher, dass genügend Platz zwischen den Röhren vorhanden ist, damit die Aktionen mit einem Rohr die anderen nicht stören. Befestigen Sie eine neun Zoll, 22 Gauge Nadel mit einer stumpfen Spitze an einer Drei-Milliliter-Spritze und führen Sie eine Testfüllung durch und dosieren Sie, um sicherzustellen, dass die Spritze die Saccharoselösung ohne Tropfen halten kann, bevor Sie die Farbverläufe einrichten.
Fügen Sie zwei Milliliter der 7% igen Saccharose auf den Boden jedes Zentrifugenröhrchens hinzu. Dann fügen Sie zwei Milliliter der 17% igen Saccharose unter die 7% ige Lösung hinzu, indem Sie die Nadelspitze in unmittelbarer Nähe des Röhrchenbodens positionieren. Geben Sie die Lösung vorsichtig und langsam ab.
Wiederholen Sie den Vorgang mit je zwei Milliliter der 27-, 37- und 47%igen Saccharoselösung, wobei sichergestellt wird, dass jede Schicht durch eine Linie unterscheidbar ist, die den Abstand der Dichten markiert. Lagern Sie die Steigungen über Nacht bei vier Grad Celsius, damit sie sich zu einem kontinuierlichen, steigenden Saccharoseanteil absetzen können. Nach dem Wachstum und der Ernte von Hefe, Saccharomyces cerevisiae Zellen, resuspendieren die Zellen in gekühlten 700 Mikrolitern Polysomenextraktionspuffer.
Fügen Sie 100 Einheiten RNAse Inhibitor hinzu. Fügen Sie dann 400 Mikroliter vorgekühlte Glasperlen mit einer ungefähren Größe von 425 bis 600 Mikron hinzu. Die Mischung wird mit den Glasperlen in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen gegeben und die Hefezellen durch kräftiges Rühren in einem Perlenschläger fünf Minuten lang aufgebrochen.
Nach dem Aufbrechen der Zellen klären Sie das Lysat durch Zentrifugieren. Bestimmung der Konzentration der RNA im geklärten Lysat durch Messung der Absorption bei 260 Nanometern mit einem fluoreszenzbasierten RNA-Detektionssystem. Stellen Sie sicher, dass die RNA-Konzentration 0,5 bis ein Mikrogramm pro Mikroliter beträgt.
Wenn die RNA-Konzentration zu niedrig ist, reduzieren Sie das Volumen des Extraktionspuffers, der zur Resuspendierung der Zellen verwendet wird. Laden Sie das Lysat vorsichtig auf die Oberseite der Farbverläufe. Legen Sie die Pipettenspitze gegen die Innenwand an der Oberseite des Polypropylenrohrs.
Winkeln Sie das Röhrchen und geben Sie das Lysat langsam auf die Oberseite des Farbverlaufs und tropfen Sie gegen die Wand. Legen Sie die Röhrchen vorsichtig in die vorgekühlten Eimer eines schwingenden Schaufelrotors und zentrifugieren Sie die Farbverläufe. Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren vorsichtig die Zentrifugenröhrchen aus dem schwingenden Schaufelrotor und legen Sie sie in einen Tubenhalter.
Beschriften Sie die 96-Well-Platten, um die Fraktionen zu lagern und auf Eis vorzukühlen. Sammeln Sie 100 oder 200 Mikroliter Fraktionen beginnend von der Oberseite des Gradienten, indem Sie vorsichtig eine Pipettenspitze in die Oberseite des Gradienten einführen und die Brüche sammeln, bis der gesamte Gradient aliquotiert ist. Messen Sie die Absorption jeder Fraktion bei 254 Nanometern mit einem Spektralphotometer gegen die 7- und 47%Saccharoselösungen als Blindlinge.
Erstellen Sie das Polysomenprofil, indem Sie die Fraktionszahl im Vergleich zur Absorption aufzeichnen. Drei repräsentative Polysomenprofile aus Hefe S.Cerevisiae werden gezeigt. Der Kamm jeder ribosomalen Untereinheit und jedes Polysomenpeaks ist auf jedem Profil sichtbar.
Ein repräsentatives Profil aus einem automatisierten Dichtefraktionierungssystem wird hier gezeigt. Dieses Profil wurde aus einem kontinuierlichen Absorptionsprofil hergestellt, als der Saccharosegradient von unten nach oben durch eine Chase-Lösung durch eine Detektor-Durchflusszelle verschoben und in Fraktionen gesammelt wurde. Das Polysomenprofil, das durch Handfraktionierung von 200- und 100-Mikroliter-Proben erzeugt wird, ist hier dargestellt.
Das Wichtigste, woran Sie sich bei diesem Verfahren erinnern sollten, ist, die Farbverläufe nicht zu unterbrechen. Achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuführen oder den Gradienten zu stören, indem Sie die Lösung zu schnell dosieren. Nach diesem Verfahren kann RNA aus den Gradienten extrahiert werden, um weitere Analysen durchzuführen, um mRNAs zu bestimmen, die mit aktiven Ribosomen assoziiert sind
