This work was supported in part by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 to S.J.C.), the National Institutes of Health (NS065808 to E.R.B.; NS078392 to S.J.C.), start-up funds from the UConn Health Center (to SJC) and the Kim Family Fund (UCHC in support of K.I.C.).

Alle Verfahren, die Tiere wurden in Übereinstimmung mit der Politik auf humane Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt durch das Amt für Labortierschutz (NIH), und nur mit Zustimmung des Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) der Universität dargelegten Connecticut Health Center. 1. Herstellung der Misch Gliakulturen <ol><li> Sterilisieren alle Instrumente vor der Verwendung. 3 ml eiskaltem, sterilen ausgewogener Hank-Salzlösung (HBSS), die keine Kationen (Mg 2 + oder Ca 2 +) zu drei sterile 60 mm Petrischalen auf Eis gehalten kalt zu halten. </li><li> Isolieren Sie die Rinden von postnatalen P0-P2 Maus Welpen, wie zuvor beschrieben, 17,18. HINWEIS: subkortikalen Strukturen, wie Hippocampus, sind nicht in diesen Kulturen enthalten. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Hirnhaut und übertragen dann die isoliert Kortex an die frische HBSS und distanzieren die Gewebe enzymatisch mit einem neural Gewebedissektion Kit nach Vorschrift des Herstellers. </li><li> Platte die Zellen in sterile T-175-Kolben beimpft und über Nacht in den Medien [Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fetales Rinderserum (FBS) mit 1x Penicillin / Streptomycin]. </li><li> Ersetzen Sie alle Medien am nächsten Tag mit frischen Medien. Weiterhin Kulturen inkubiert, mit regelmäßigen Medienwechsel, für ca. 3 Wochen oder bis ein Mobilmonoschicht etabliert. HINWEIS: 1-Verhältnis 19: Diese Monoschicht wird von Astrozyten und Mikroglia mit einer etwa 10 bestehen. </li></ol> 2. Globoidzell- Induktion im gemischten Gliakulturen <ol><li> Bereiten Sie die ECM-beschichtete Deckgläser. <ol><li> Einweichen Kreisdeckgläser mit steriler 1 N Salzsäure (HCl) in einer sterilen Petrischale für 30 min. Waschen Deckgläser mit sterilem Wasser 3x und dann in 95% EtOH einweichen für mindestens 20 min. und lassen Sie dann an der Luft trocknen. </li><li> Ort Tröpfchen verdünnter extrazellulären matrix (ECM) Protein Beschichtungsmaterialien auf ein Blatt Parafilm (zB 150-250 ul / Tröpfchen von Laminin 10 ug / ml in steriler Phosphat-Pufferlösung [PBS]). Verteilen Sie die Tröpfchen, so dass Deckgläser nicht berühren, wenn sie auf dieser Tröpfchen platziert. Stellen sanft getrocknet jedes Deckglas auf einem Tröpfchen mit einer Pinzette. </li><li> Lassen Sie die Deckgläser an den Tröpfchen für ca. 4-6 Stunden in der Kultur Kapuze mit geschlossenem Frontschieber. </li><li> Platzieren Sie die ECM-beschichtete Deckgläser (ECM-beschichtete Seite nach oben) in jede der Vertiefungen einer 24-Well-Platte. Waschen Sie jede Vertiefung mit sterilem PBS 3x und halten bei 4 ° C, bis sie benötigt. </li></ol></li><li> Vorbereitung Gliazellen für die Beschichtung auf Deckgläser. <ol><li> Saugen Sie das Medium von den Gliazellen Kulturen und vorsichtig waschen die Glia-Monolayer 3x mit 10 ml sterilem PBS. Als Nächstes fügen 8-10 ml Trypsin-EDTA-Lösung zu dem T-175 und Inkubation für 5-10 min bei 37 ° C aufweist. </li><li> Wenn die meisten der Monoschicht abgelöst wurde, 20 ml Vollmediumin den Kolben zu Trypsinierung zu stoppen. Sammeln Sie die Medien, die die abgelösten Zellen in ein 50 ml konischen Röhrchen und Spin für 10 min bei 300 g bei Raumtemperatur. </li><li> Saugen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und dann wieder die Zellen in 2 ml frischem Vollmedium durch vorsichtiges Pipettieren die Lösung mit dem P1000 Pipette. </li><li> Bestimmen der Anzahl der Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und resuspendieren Zellen in Komplettmedium bei der gewünschten Dichte (beispielsweise 10 5 Zellen / ml). Platte der Zellen auf den ECM-beschichtete Deckgläser (zB 500 ul in jede Vertiefung der 24-Well-Platte). Hinzufügen zusätzlicher frischem Komplettmedium zu jeder Vertiefung für 3-5 Tagen Inkubation bei 37 ° C, oder bis die Zellen wachsen, um die gewünschte optische Konfluenz. </li></ol></li><li> Behandlung mit Psychosin. <ol><li> Die Rekonstitution der Psychosin in eine Aktienkonzentration (108,3 mM) in Dimethylsulfoxid (DMSO). Verdünnen diese Aktie in 100% EtOH, eine Arbeits Lager machen, dass der CANn in jede Vertiefung der 24-Well-Platte gegeben, um eine Endkonzentration von 10 uM zu erzielen. </li><li> Zum Zeitpunkt der Zugabe des Psychosin, schwenken Sie die Kulturplatte, die Psychosin in Kulturmedien zu mischen. Ergänzung der Psychosin, indem das Äquivalent von 10 uM jeden zweiten Tag für eine Woche. </li></ol></li><li> Nach 7 Tagen Psychosin Behandlung, sammeln die Medien und die Pipette 500 ul kaltem 4% Paraformaldehyd (PFA) in jedes Well. Inkubieren bei Raumtemperatur für 20 min, um die Zellen zu fixieren. Dann waschen Sie jedes Well 3x mit PBS und dann halten Platten bei 4 ° C bis zur Immunzytochemie verarbeitet werden (siehe unten). HINWEIS: Zellkulturmedien für enzymatische oder ELISA-Test an dieser Stelle auf Wunsch abgeholt werden. </li></ol> 3. Immunzytochemie (ICC) zu Globoid Zellen sichtbar <ol><li> Ersetzen PBS mit Blockierungspuffer [PBS + 0,3% Tween-20 + 5% normalem Ziegenserum (NGS)], und Inkubieren der Zellen für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Incubate der fixierten Zellen in primären Antiseren gegen Iba-1 [(1: 1.000) in PBS + 0,3% Tween-20 + 2% NGS] für mindestens 1 h bei Raumtemperatur, dann waschen jedes Well mit PBS 3x 5 min / waschen. </li><li> Fügen Sie den entsprechenden sekundären Fluoreszenz-konjugierte Antikörper, um die primäre Antikörpermarkierung und Gegenfärbung mit 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, 1: 1.000) zu identifizieren, um Kerne zu identifizieren. Inkubieren sekundären Antikörper-Lösung 1 h bei Raumtemperatur und Waschen mit PBS 3x 5 min. </li><li> Montieren Sie je Deckglas auf Objektträger unter dem Mikroskop Montagemedium. Blick gleitet auf einem Fluoreszenzmikroskop für die visuelle und quantitative Analysen. </li></ol> 4. Analyse und Charakterisierung von Globoidzellen in Primärkultur <ol><li> Verwenden Sie die folgenden drei morphologischen Kriterien, um eine Globoidzell in Kultur zu identifizieren: <ol><li> Identifizieren Globoidzellen mit Fluoreszenzmikroskopie von immun Kennzeichnung für die Mikroglia-Marker Iba-1 +. </li><li> IdentifizierenGloboidzellen als kernigen (dh, zwei oder mehr DAPI positiven Kernen). </li><li> Identifizieren Globoidzellen durch eine abgerundete Morphologie unterscheidet sich von der stark verzweigten Aussehen von ruhenden Mikrogliazellen. Hinweis: Zellen können auch für Zelloberflächenmarker-Analyse und Quantifizierung mittels Durchflusszytometrie aus diesen Kulturen gesammelt werden. </li></ol></li><li> Messung der phagozytierenden Aktivierung der Mikroglia und Globoidzellen <ol><li> Um die phagozytische Aktivität von Psychosin behandelten Mikroglia beurteilen, fügen FITC-markierten Latexkügelchen auf die Vertiefungen in Übereinstimmung mit den Anweisungen des Herstellers. Fügen fluoreszierende Latexkügelchen-konjugierten 48 Stunden vor der Fixierung mit PFA. Fix Zellen mit Perlen behandelt (wie in Abschnitt 2.4 erwähnt), und ein Verfahren zur Immunzytochemie (wie in Abschnitt 3 beschrieben). </li><li> Wählen Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper, so daß sie das Fluoreszenzemissionsspektrum des Fluorophors markierten Kügelchen nicht überlappen. </li><li> Analyze die phagozytotische Profile der Iba-1 + Mikroglia durch die Identifizierung die Zellen, die Co-Lokalisation mit den fluoreszenzmarkierten Perlen. HINWEIS: Psychosin wird Mikroglia zu aktivieren. Phagozytierten Perlen innerhalb einkernigen und mehrkernigen Iba-1 + Zellen in dieser Kultur Einstellung identifiziert werden. </li></ol></li></ol> 5. Induktion von Globoidzellen aus gereinigten Mikroglia Kulturen HINWEIS: Ein alternativer Ansatz zur interzellulären Signal zwischen dem Astrozyten und Mikroglia zu entziffern ist ein weiterer Vorteil dieses in vitro Globoidzell Modell. Reinigung von primären Mikrogliazellen für Replattierung oder Co-Kultivierung können durch ihre Unterhalten Immobilie in Kultur erreicht werden, wie in den folgenden Schritten (siehe Abschnitt 5.2) beschrieben. <ol><li> Sammeln Sie die Medien aus den zusammenfließenden Misch Gliakulturen in 50 ml konischen Röhrchen und pflegen sie in den Brutschrank bei 37 ° C. </li><li> Mikroglia-Isolierung aus Primär Mixed Gliakulturen.<ol><li> Nach dem Entfernen der Medien aus einer konfluenten gemischten Gliazellen Kultur T175 Kolben gemischt, warmen Schütteln Medien [bestehend aus kompletten Medien + 25 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) + 25 mM Natriumhydrogencarbonat (Sigma)]. Schütteln Sie die Flaschen für 3-4 h in einem Orbitalschüttler bei 100 Upm (37 ° C). Sammeln Sie die Medien aus diesen Schüttelkolben in 50 ml konischen Röhrchen. HINWEIS: Diese Medien werden die weniger haft Mikroglia aus den Flaschen gehören. </li><li> Drehen Sie die Medien bei 300 g für 10 min bei Raumtemperatur. Saugt den Überstand und resuspendiere die Zellen in 2 ml des Astrozyten-konditioniertem Medium (in Schritt 5.1 gesammelt). </li><li> Stellen Sie die Anzahl von Zellen mit einer Zählkammer und dann die Platte Mikroglia-Zellen auf das Substrat-beschichtete Deckgläser erworben (siehe Abschnitt 2.1) für Immunzytochemie oder Platte auf UltraLow ​​Einhaltung Well-Platten für die künftige Sammlung von Globoidzellen für Co-Kultur mit anderen Zelltypen, wie Oligodendrozyten (als absteigendim folgenden Abschnitt ribed). HINWEIS: Sobald die Mikroglia vergoldet mit Psychosin (10 uM) wie oben beschrieben (siehe Abschnitt 2.3) behandelt werden. </li></ol></li><li> Co-Kultur mit primären Oligodendrozyten für die Analyse der Zytotoxizität. HINWEIS: Sammlung von Psychosin behandelten Mikroglia von den niedrigen Einhaltung Platten für die spätere Co-Kultur auf Primärkulturen von Oligodendrozyten oder Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, können verwendet werden, um das Potenzial zytotoxische Funktion dieser Globoid-ähnliche Zellen in vitro zu untersuchen. <ol><li> Entwickeln Kulturen von primären Oligodendrozyten mit etablierten Methoden 18,20. Um die Psychosin behandelten Mikroglia sammeln, vorsichtig pipettieren, um die lose anhaftenden Zellen vom Boden der Wells zu lösen. Sammeln Sie die Zellen, Zentrifuge bei 300 g für 10 min, und dann sorgfältig in Oligodendrozyten-Differenzierung Medien [von Neurobasal Medien zusammen zu suspendieren, L-Glutamin (1x), B-27 Ergänzung (1x) und Trijodthyronin (T3, 10 ng / ml )]. </li><li> Die Anzahl der Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und dann Samen der Mikroglia auf die Oligodendrozyten-Kultur bei 1 x 10 5 Zellen / ml, was eine ungefähre 1: 2 Mikroglia / Oligodendrozyten-Verhältnis. Inkubieren als Co-Kultur für bis zu 3 Tagen. </li><li> Befestigen Sie die Zellen, die für Immunzytochemie (siehe Abschnitt 2.4). Sammeln Zellkulturmedien für ELISA oder chemische Analysen, wie gebraucht. </li></ol></li></ol>

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The authors declare no conflicts of interest.

Das hierin beschriebene Protokoll sieht ein neues Modellsystem, in dem die Entwicklung und funktionelle Charakterisierung von aktivierter Mikroglia und Globoidzellen studieren. Frühere Arbeiten von Im et al. mit einer HEK293-Zelllinie ein Template für die Entwicklung des vorliegenden Protokolls für das Studium der Globoidzell Bildung 21. Es ist auch wichtig, darauf hinzuweisen, dass die Globoidzellen im Modell abgeleitet von den nativen Globoidzellen identifizierbar GLD abweichen. Zum Beispiel hab...

Globoidzell Leukodystrophie (GLD), auch als Morbus Krabbe genannt, ist eine tödliche demyelinisierende Krankheit von Funktionsverlust-Mutationen in der galatocerebrosidase (GALC) Gen 1 resultieren. Die am weitesten verbreitete Form der GLD ist die Kinder-Variante, die von Beginn in der frühen Kindheit und typisiert wird, gekennzeichnet durch einen aggressiven klinischen Verlauf der motorischen und kognitiven Rückgang führt zu vorzeitigem Tod oft vor Ablauf von fünf Jahren 2,3. Genetische Tests wird verwendet, um eine Diagnose der GLD 4 überprüfen. Neuropathologie der GLD enthüllt weit verbreitete Demyelinisierung, neuronale Atrophie, Astrogliose und Gegenwart angeschwollen mehrkern Mikroglia genannt Globoidzellen 5-7. Die Identifizierung von Globoidzellen, oft tubulous Einschlüsse in ihrem Zytoplasma enthält, hat in den letzten 97 Jahre zu einem prägenden Merkmal der GLD, obwohl die spezifische Funktion dieser Zellen ist auffällig vor schwer. Die Beteiligung von Nicht-MYELUrsprung Gliazellen (Astrozyten und Mikroglia) in der Pathogenese der GLD ist seit langem als eine sekundäre Reaktion auf die tiefgreifenden Demyelinisierung bei dieser Erkrankung 8. Interessant ist, dass die erste Beschreibung dieser Krankheit, von Knud Krabbe 1916 5 gemacht, berichtete die Bildung von mehrkernigen Phagozyten, lipidhaltigen Ablagerungen, die genannt worden &#39;Globoidzellen&#39; und sind ein charakteristisches Merkmal dieser Krankheit. Globoidzellen sind das Markenzeichen Merkmal der GLD Pathologie, obwohl ihre Rolle in der GLD ist seit langem ignoriert. Interessanterweise sind diese Zellen zu den ersten charakteristischen Veränderungen in ZNS-Gewebe von GLD. Dieser Mangel an Wissen kann auf der Annahme, daß die Bildung von vielkernigen Phagozyten genannte Riesenzellen bei anderen Krankheiten, werden typischerweise als eine Folge der Pathologie als eher als eine anfängliche Antriebskraft pathogenen 9 gewesen. Daher gibt es nur wenige Studien zur Untersuchung des Mechanismus, durch WHICH Globoidzellen von Phagozyten insbesondere im ZNS von GLD gebildet. Die in diesem Bericht beschriebenen Verfahren konzentriert sich auf die Bedeutung der Globoidzell Bildung im ZNS und unseren bisherigen Nachweis, dass Psychosin-induzierte multinucleation der Mikroglia in vitro und diese Zellen zeigten höhere Phagozytose. In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen, Globoidzellen in twitcher Gehirne enthalten häufig PAS-positive Ablagerungen, was hohe Phagozytose. Globoidzellen finden sich auch immun für Ferritin zu sein (a Mikroglia-Marker) 10, KP-1 / CD68 (a Monozyten-Marker), und einige sind auch positiv für Vimentin (ein Zwischen Filament-Protein und Marker für Astrozyten und aktivierte Mikroglia) 11, HLA-DRa (ein MHCII Oberflächenrezeptor) und TNF-α 7 und Iba-1 (ein Calcium-Bindungsprotein verwendet, um zu identifizieren Mikroglia) 12. Auf der Grundlage dieser Sammlung von Markern, Globoidzellen stammen aus Mikrogliazellen, die sich entwickelnein einzigartiges Phänotyp. Trotz ihrer Einzigartigkeit wurde die spezifische Funktion und der Beitrag der GCs zu GLD Pathogenese weitgehend übersehen. Globoidzellen haben gedacht worden, um eine sekundäre Folge der chronischen Demyelinisierung sein. Allerdings ist durch frühere Studien, die die zeitliche Assoziation von Globoidzellen auf der weißen Substanz Pathologie der GLD die Anwesenheit von Globoid Zellen in der späten embryonalen frühen postnatalen Zeit identifiziert; mal vorstehenden Oligodendrozytenapoptose und offene Demyelinisierung 13. Somit wird die zeitliche Abfolge der Entwicklung der Neuropathologie in GLD legt nahe, dass Globoidzellen im Voraus der Demyelinisierung bei dieser Erkrankung 14 ausgebildet. Dies führte zu unserer Hypothese, dass die frühe Bildung von Globoidzellen in GLD kann eine Definition von pathogenen Veranstaltung eher als eine sekundäre, reaktive Antwort auf Oligodendrozyten-Schaden 15 stellen. Zusätzlich Dysregulation der Mikroglia-Aktivität in GLD ist als ein factor Begrenzung der Langzeitwirksamkeit von hematopeotic Stammzelltherapien für die Behandlung dieser Krankheit 16. Somit untersucht die Zellfunktionen und Regeln der Mikroglia und Globoidzellen in Reaktion auf Psychosin soll neue Einblicke in die Pathogenese von GLD ist. Bis vor kurzem war das Fehlen eines geeigneten Modells, in dem Globoidzell Bildung zu untersuchen, das Verständnis der genauen Funktion und der Beitrag dieser Zellen zu der Pathologie der GLD beschränkt. In neueren Studien wurde festgestellt, dass Globoid-ähnlichen Zellen können als direkte Reaktion gebildet, um Psychosin, eine pathogene Lipid Toxin, das in GLD sammelt werden. Wir fanden, dass Mikroglia, aber nicht Makrophagen, aktiviert und in Reaktion in Globoidzellen in der Grund Gliakulturen transformiert, um Psychosin 15. Die Umwandlung in Globoidzellen wurde gefunden, durch die extrazelluläre Protease, die Matrix-Metalloproteinase (MMP) -3 15 vermittelt werden. In jüngerer Zeit haben wirhaben diese Ergebnisse, dass Psychosin-aktivierte Mikroglia und Globoidzellen in dieser In-vitro-Modellsystem entwickelt, erweitert und bestimmt sind potent giftig für Oligodendrozyten und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen. Daher wird, wenn im Rahmen der GLD, der frühen Anhäufung von Psychosin und Bildung Globoidzellen vor Demyelinisierung würde eine aufstrebende primären und möglicherweise pathogene Rolle für Mikroglia bei dieser Krankheit unterstützt betrachtet. Wir schlagen vor, dass die Studie von Globoidzell Bildung wird neue Informationen über die Pathogenese der GLD, die zum Verständnis dieser Krankheit beitragen wird offenbaren. Darüber hinaus kann dieses neue Modell der zellulären GLD ein neues Format, aus denen neue therapeutische Ansätze zur Adresse pathologischen Veränderungen bei dieser Erkrankung getestet werden könnten. Daher wird in diesem Bericht stellen wir ein detailliertes Protokoll für die in vitro Entwicklung von Psychosin induzierte Globoidzellen aus Primärkulturen von nicht-myelinisierenden Glia.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="884">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:500px;">Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+).&#160;</td>
			<td style="width:297px;">Life technologies</td>
			<td style="width:87px;">14175-095</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neural Tissue Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-092-628</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40 uM cell-strainer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22363547</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+).&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15070-063</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25299-056</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Psychosine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9256</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>19208</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PCN5000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iba-1</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>019-19741</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor conjugated antisera</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Various</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting Media</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>OB100-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phagocytic Assay Kit</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>500290</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BP310-500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model for the study of cellular pathophysiology in globoid cell leukodystrophy

Die genaue Funktion der Mehrkern Mikroglia genannt Globoidzellen, die im Zentralnervensystem Globoidzell Leukodystrophie (GLD) eindeutig reichlich sind, ist unklar. Diese Wissenslücke wurde durch den Mangel eines geeigneten in vitro-Modell zur Untersuchung behindert. Hier beschreiben wir einen primären murinen Gliazellen Kultursystem, in dem die Behandlung mit Psychosin ergibt multinucleation der Mikroglia ähnlich den Kenn Globoidzellen in GLD gefunden. Mit diesem neuartigen System definierten wir die Bedingungen und Formen der Analyse für das Studium der Globoidzellen. Die mögliche Verwendung von diesem Modellsystem wurde in unserer vorherigen Studie, die eine mögliche Rolle für die Matrix-Metalloproteinase (MMP) identifiziert validiert -3 in GLD. Diese neuartige in vitro-System kann ein nützliches Modell, in dem die Bildung und Funktion, sondern auch die potentielle therapeutische Manipulation dieser einzigartigen Zellen zu studieren.

Dieses Protokoll, wie geschrieben, wird erwartet, dass etwa 36 Tage, um von Anfang bis Ende (siehe Abbildung 1: Experimentell Workflow-Schema) zu vervollständigen. Es ist unsere Erfahrung, dass die Entwicklung von &quot;Globoid-like &#39;Zellen in dieser Primärkultur-System ist zuverlässig und reproduzierbar: die Bildung von vielkernigen Zellen in Reaktion auf Psychosin konsequent mit 7 Tagen der Behandlung beobachtet. Immunzytochemische Färbung der Mikroglia mit Iba-1 i...

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An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell für die Untersuchung der zellulären Pathophysiologie in Globoidzell- Leukodystrophie

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

7.8K Aufrufe.  University of Connecticut Health Center. Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells. 

Serie: An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

Ein Optic Nerve Crush Injury Mausmodell zur retinalen Ganglienzellen Survival Study

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Forschung

Neurowissenschaften

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The blood-brain barrier (BBB) consisting of EC, astrocyte end-feet, pericytes and the basal membrane is responsible for the protection and homeostasis of the brain parenchyma. In vitro BBB models are common tools to study the structure and function of the BBB at the cellular level. A considerable number of different in vitro BBB models have been established for research in different laboratories to date. Usually, the cells are obtained from bovine, porcine, rat or mouse brain tissue (discussed in detail in the review by Wilhelm et al. 1). Human tissue samples are available only in a restricted number of laboratories or companies 2,3. While primary cell preparations are time consuming and the EC cultures can differ from batch to batch, the establishment of immortalized EC lines is the focus of scientific interest.
Here, we present a method for establishing an immortalized brain microvascular EC line from neonatal mouse brain. We describe the procedure step-by-step listing the reagents and solutions used. The method established by our lab allows the isolation of a homogenous immortalized endothelial cell line within four to five weeks. The brain microvascular endothelial cell lines termed cEND 4 (from cerebral cortex) and cerebEND 5 (from cerebellar cortex), were isolated according to this procedure in the F&ouml;rster laboratory and have been effectively used for explanation of different physiological and pathological processes at the BBB. Using cEND and cerebEND we have demonstrated that these cells respond to glucocorticoid- 4,6-9 and estrogen-treatment 10 as well as to pro-infammatory mediators, such as TNFalpha 5,8. Moreover, we have studied the pathology of multiple sclerosis 11 and hypoxia 12,13 on the EC-level. The cEND and cerebEND lines can be considered as a good tool for studying the structure and function of the BBB, cellular responses of ECs to different stimuli or interaction of the EC with lymphocytes or cancer cells.

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

This method describes how to isolate and immortalize microvascular endothelial cells from mouse brain. We describe a step-by-step protocol starting from the homogenization of brain tissue, digestion steps, seeding and immortalization of the cells. Usually, it takes about five weeks to obtain a homogenous, immortalized microvascular endothelial cell line.

Erzeugung eines Immortalisierte Murine Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen Zelllinie als<em&gt; In Vitro</em&gt; Blut-Hirn-Barriere Modell

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Das olfaktorische System als Modell zur Axonal Wachstumsmuster und Morphologie Studieren<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

Dorsalwurzelganglien Neuronen und differenzierten Fettgewebe gewonnene Stammzellen: Eine<em&gt; In-vitro-</em&gt; Co-Kultur Modell zur Regeneration peripherer Nerven Studieren

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

In - vitro - Modellierung von Cancerous Neural Invasion: The Dorsalwurzelganglion Modell

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

Die indirekte Neuron-Astrozyten Cokultur Assay: Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Für die detaillierte Untersuchung von Neuron-Glia Interaktionen Set-up

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

In Utero Ansätze Elektroporation die Erregbarkeit neuronaler Subpopulationen und Einzelzell - Konnektivität zu studieren

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

Zeitabhängige Erhöhung der Netzwerkreaktion auf die Stimulation von neuronalen Zellkulturen auf Mikroelektroden-Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at cellular and subcellular resolution. Advances in molecular and imaging technologies have allowed us to gain numerous detailed insights into cellular and molecular mechanisms of brain development in the transparent zebrafish embryo. Recently, processes of refinement of neuronal connectivity that occur at later larval stages several weeks after fertilization, which are for example control of social behavior, decision making or motivation-driven behavior, have moved into focus of research. At these stages, pigmentation of the zebrafish skin interferes with light penetration into brain tissue, and solutions for embryonic stages, e.g., pharmacological inhibition of pigmentation, are not feasible anymore.
Therefore, a minimally invasive surgical solution for microscopy access to the brain of awake zebrafish is provided that is derived from electrophysiological&#160;approaches. In teleosts, skin and soft skull cartilage can be carefully removed by micro-peeling these layers, exposing underlying neurons and axonal tracts without damage. This allows for recording neuronal morphology, including synaptic structures and their molecular contents, and the observation of physiological changes such as Ca2+ transients or intracellular transport events. In addition, interrogation of these processes by means of pharmacological inhibition or optogenetic manipulation is feasible. This brain exposure approach provides information about structural and physiological changes in neurons as well as the correlation and interdependence of these events in live brain tissue in the range of minutes or hours. The technique is suitable for in vivo brain imaging of zebrafish larvae up to 30 days post fertilization, the latest developmental stage tested so far. It, thus, provides access to such important questions as synaptic refinement and scaling, axonal and dendritic transport, synaptic targeting of cytoskeletal cargo or local activity-dependent expression. Therefore, a broad use for this mounting and imaging approach can be anticipated.

Here we present a method to image the zebrafish embryonic brain in vivo upto larval and juvenile stages. This microinvasive procedure, adapted from electrophysiological approaches, provides access to cellular and subcellular details of mature neuron and can be combined with optogenetics and neuropharmacological studies for characterizing brain function and drug intervention.

In vivo Bildgebung von vollaktivem Hirngewebe bei wachen Zebrafischlarven und Jungtieren durch Schädel- und Hautentfernung

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...