Research at the Lewinson lab is supported by grants from the Israel Academy of Science, the Rappaport Institute for Biomedical research, the Meriuex Research Foundation, and the Marie Curie career reintegration grant (OL). EV is supported by the Fine scholarship and by the Technion Faculty of Medicine. NLL is supported by grants from the Israel Academy of Science.

1. Proteinproben und Buffer Vorbereitung <ol><li> Probenvorbereitung: Reinigung der Proteine ​​von Interesse und sicherzustellen, dass alle Aggregate entfernt werden, durch Injizieren des Proteins vor dem Experiment auf eine Gelfiltrationssäule oder durch Ultrazentrifugation (üblicherweise 10 Minuten bei 100.000 xg genügt). HINWEIS: Obwohl wünschenswert, hochreinen Proteinpräparate sind kein Muss. SPR wurde erfolgreich mit weniger-als-perfekte Reinigungen und sogar mit Gesamtextrakt 8,9 verwendet. </li><li> Buffer Zubereitung: <ol><li> Bereiten des Puffers des Experiments (als &quot;Laufpuffer&quot; oder RB). Für das hier beschriebene Protokoll verwendet 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl und 0,05% (w / v) DDM (n-Dodecyl β-D-maltosid). Denken Sie daran, dass die Wahl der Pufferzusammensetzung kann leicht nach dem untersuchten System geändert werden. </li><li> Filter alle Puffer und Proteinproben mit 0,22 um-Filter. Vergewissern Sie sich vorher, dass die Filter Protein-kompatibel. Im allgemeinen enthalten kurzem vermarktet SPR Plattformen einen Inline-de-gasser; wenn dies nicht der Fall ist, de-Gas die Puffer vor der Verwendung. </li><li> Dialyse über Nacht in verdünnter oder die Proben vor dem RB-Puffer zu Fehlanpassungen zu vermeiden. Dialyse (oder jede andere Methode der Pufferaustausch) empfiehlt sich insbesondere bei der Verwendung von Chemikalien von hoher Viskosität (zum Beispiel Saccharose, Glycerin, DMSO). Vor dem Anschluss des RB-Flasche zum Pumpeneinlaß beiseite stellen 10 ml des RB in einem separaten Röhrchen. </li></ol></li><li> Konzentrierten Ligand Lager in RB auf eine Endkonzentration von ~ 20 &amp; mgr; g / ml. Als Faustregel gilt, für eine stabile Liganden Immobilisierung nutzen niedrigen Ligandenkonzentrationen mit mehr Injektionen bei niedrigen Strömungs, im Gegensatz zu hohen Konzentrationen, hohe Strömungs und kürzere Injektionen. </li><li> Verdünne den Analyten in der RB auf die gewünschte Konzentration. In der Regel testen die Konzentrationsbereich für ein System von unbekannten Affinität von 10 um bis 10 nM in zehnfacher Verdünnung. Beginnen Sie immermit den niedrigeren Konzentrationen ersten. </li></ol> 2. Sensor Chip <ol><li> Chip-Auswahl: Mit einem Nitrilotriessigsäure (NTA) gekoppelt Chip geeignet für die Aufnahme von Proteinen mit einem Oligo-Histidin-Tag. </li><li> Chip-Nutzung: <ol><li> Bei Verwendung einer neuen Chip, nehmen Sie den Chip aus dem Mantel, spülen Sie vorsichtig mit doppelt destilliertem Wasser (DDW), trocknen sorgfältig verbleibenden Flüssigkeiten mit empfindlichen Scheibenwischer, und sicherstellen, dass die Goldschichtoberfläche nicht zu berühren. Setzen Sie den Chip in die Scheide in der richtigen Ausrichtung (die Einfügung ist glatt, wenn der Chip richtig platziert ist). </li><li> Bei Wiederverwendung einen Chip, nehmen Sie die gespeicherten Chip aus dem Puffer, gründlich mit DDW und trocken leise, wie oben angegeben, und legen Sie in die ursprüngliche Hülle. HINWEIS: Die Akkumulation unspezifischer Junk Materials auf dem Chip kann seine Lebensfähigkeit beeinträchtigen. Dies kann durch den Vergleich der EVU vor der Liganden Immobilisierung und nach Abstreifen überwacht werden. Obwohl viele Messungen könnengetan mit der gleichen NiNTA Chip, die Frage der seine Langlebigkeit ist kein &#39;eindeutig&#39; und variiert stark zwischen verschiedenen Chips. </li></ol></li><li> Chip-Docking: Öffnen Sie den Sensorchip Tür und setzen Sie den Chip in der Scheide. Bei Verwendung einer neuen Chip, um die Seriennummer Eingang des Chips Verwendungsdatensatz zu halten. Schließen Sie die Tür und drücken Sie &quot;Dock-Chip&quot;. </li></ol> 3. Temperatureinstellungen <ol><li> Gesetzt den Chip Zelltemperatur auf 25 ° C (oder der bevorzugten Experiment Temperatur). </li><li> Optional: Legen Sie die Proben Raum auf 7 ° C, um die Proteine ​​während des gesamten Experiments stabil zu halten. </li></ol> 4. Lösungen für die Be-und Abisolieren Bereiten Sie die folgenden Lösungen zum Laden und Abziehen: 0,5 mM NiCl 2 in RB, 350 mM EDTA in RB (das Waschmittel zu EDTA-Lösung bis zu einer Endkonzentration wie in RB), 0,25% SDS in H 2 O und 100 mM HCl in H 2 O. Bei der Verwendung von Mikrozentrifugen Badewannees und nicht bezeichnet Rohre SPR, vergessen Sie nicht, schneiden Sie die Kappen der Rohre. 5. Minister die SPR Instrument mit RB 6. Starten Sie einen neuen Run <ol><li> Die Durchflussrate, die während des Experiments verwendet werden. Um die hier beschriebenen Ergebnisse zu erzielen setzen die Strömung auf 50 ml / min. HINWEIS: Dieser Parameter kann während des Experiments geändert werden. </li><li> Definieren Sie die Fließwege und Bezugs Subtraktion. Um die hier beschriebenen setzen die Pfade Fc = 1 und Fc = 2, Subtraktion Fc = 2-1 Ergebnisse zu erzielen. HINWEIS: Das Programm wird in Echtzeit angezeigt werden die Subtraktion der beiden Messzellen. Beachten Sie, dass dieser Parameter nicht während des Experiments geändert werden. </li><li> Wählen Sie den geeigneten Probenträger (kann das Probenvolumen Verbrauch beeinflussen). </li><li> Speichern Sie die Ergebnisdatei. </li></ol> 7. Experiment Cycles Jeder Versuch wird von Zyklen besteht, halten eine klare Aufzeichnung der Injektionen in ea getanch-Zyklus, und trennen Sie die Liganden &#39;Laden, leere Injektion des Puffers und den Analyten Injektion in verschiedenen Zyklen. <ol><li> Zyklus 1: Chip Vorbereitung und Nickelbeladung <ol><li> Stellen Sie sicher, der Fluss und Wegen eingestellt werden gemäß Schritt 6.1 und 6.2. </li><li> Injizieren Sie 350 mM EDTA für 1 min abzuwaschen Reste. </li><li> Stellen Strom bis 10 ml / min. </li><li> Injizieren 0,5 mM NiCl 2 für 2 min. HINWEIS: Nun ist die Chip Harz durch Nickelionen beschichtet. </li></ol></li><li> Zyklus 2: Liganden Immobilisierung <ol><li> Set Flow bis 15 ml / min, Flusspfad Fc = 2. </li><li> Injizieren Ligand A bis zum Erreichen RU Werte 10-20fache seines Molekulargewichts sind. Legen Sie zum Beispiel einen Liganden von 50 kDa bis 500-1.000 EVU. Halten Sie eine Aufzeichnung des RU-Wert erreicht. </li><li> Set Flow bis 15 ml / min, Flusspfad Fc = 1. </li><li> Injizieren Ligand B (Kontrolle) bis zu der gleichen RU Wert wie der Ligand A. Überwachen Sie die Subtraktion Sensogramm (Fc = 2-1) Online, um die Kontrolle derInjektionslänge. </li><li> Set Strom auf 50 ml / min, Flusspfad Fc = 1 und Fc = 2, waschen Sie das System für 5-20 Minuten, bis die Grundlinie (Fc = 2-1) stabilisiert. </li></ol></li><li> Zyklus 3: Leer Injektion. Diese Injektion wird für leere Subtraktion dienen somit alle Komponenten, die mit dem Analyten injiziert werden, mit Ausnahme des Analyten selbst. HINWEIS: Injektionslänge kann in Abhängigkeit von der Zeit bis zum Gleichgewichtszustand (Signal Plateaus) erreichen dauert variieren. <ol><li> Set Flow bis 15 ml / min, Flusspfad Fc = 1 und Fc = 2, Fc = 2-1 Subtraktion. </li><li> Legen Sie die &#39;warten&#39; Befehl für 30 Sekunden (im Folgenden als &quot;warten&quot; genannt) (eine stabile Basislinie haben). </li><li> Injizieren Sie 15 Sek RB. HINWEIS: Die Dauer der Einspritzung zwischen verschiedenen Systemen variieren, abhängig von ihrer Vorgleichgewicht kinetischen Konstanten (meist k a). </li><li> Warten 120-600 sec, um die Dissoziationsphase aufzuzeichnen. HINWEIS: Die Länge dieser Schritt ist je nach der <em&gt; k d: Je langsamer die Dissoziation der längere dieser Schritt sein muss. Für sehr langsam dissoziierende Komplexe (k d &lt;10 -4 s -1), warten Sie 10-15 Minuten und gehen dann an die Oberfläche Regeneration (siehe später). </li></ol></li><li> Zyklus 4: Analyt Injektion <ol><li> Copy / die genauen Bedingungen in der Referenzeinspritz (Zyklus 3), so dass diese zwei Injektionen kann später abgezogen werden verwendet, einfügen. Ändern Sie die Position der Steckplätze im Rack von dem Halten der Kontroll-Lösung, eine, die den Analyten-Lösung hält. Wählen Sie eine Konzentration, die über dem erwarteten K D leicht ist. Wenn keine Vorkenntnisse vorhanden ist, wählen Sie 1 uM als guter Ausgangspunkt. </li></ol></li><li> Zyklus 5: Pufferinjektion <ol><li> Taktgeber 3. </li></ol></li><li> Zyklus 6: Analyt Injektion <ol><li> Taktgeber 4. </li></ol></li><li> Zyklus 7: Chip abzustreifen <ol><li> Stellen Strom auf 50 ml / min. &lt;/ Li&gt; <li> Injizieren 350 mM EDTA für 1 min. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal. Verwenden Sie nicht eine einzige Injektion von 3 min, da dies die Chip beschädigen. </li><li> Injizieren von 0,25% SDS für 1 min. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal. Verwenden Sie nicht eine einzige Injektion von 3 min, da dies die Chip beschädigen. </li><li> Falls der Ausgangspegel nicht erreicht ist, zu injizieren 100 mM HCl für 1 min als zusätzliches Stripping-Schritt. </li><li> Legen Sie die &quot;End-Run&quot; Befehl, den Standby-Modus schaltet. </li></ol></li><li> Chip-Speicher <ol><li> Docken Sie den Sensorchip und nehmen Sie es aus dem Gerät. </li><li> Nehmen Sie den Sensor heraus aus der Scheide, berühren nicht die Oberfläche gründlich mit DDW, und in einen 50-ml-Röhrchen mit RB. Lagerung bei 4 ° C. </li></ol></li></ol> 8. Datenanalyse mit Ausgewiesene Auswertesoftware <ol><li> Führen Sie folgende Schritte, um die von SPR vor Ableitung der kinetischen Parameter erhalten Rohdaten verarbeiten. <ol><li> Mit der Auswertesoftware, offendie Ergebnisdatei, wählen Zyklen 3-6 Fc = 2-1 (Referenz abgezogen Daten). </li><li> Achsenverschiebung: <ol><li> Display-Zyklen 3-6. </li><li> Null der Y-Achsen-Wert von der Grundlinie (der ersten 30 sec Wartezeit bei jedem Zyklus), um alle vier Kurven. </li></ol></li><li> Richten Sie die X-Achse der vier Kurven. Wählen ausgeprägten Funktionen (zB Spikes von Injektions Start oder das Ende), um perfekt richten Sie die vier Kurven entlang der X-Achse. Stellen Sie die Zeit des Beginns der Analyt (oder Steuerspeicher) auf Null gesetzt. </li></ol></li><li> Referenz Subtraktion <ol><li> Subtrahieren Sie die Hintergrundantwort durch Subtraktion Kurve der Zyklus 3 von Kurve der Zyklus 4 und Kurve des Zyklus 5 von Kurve Zyklus 6. Verwenden Sie die Kurve Subtraktion, die in der Y-Achse zu finden ist verschiebt Menü. HINWEIS: Es ist wichtig, diesen Schritt, da es keine nicht-spezifischen Komponenten (die nicht mit dem Analyten), die die Oberfläche Brechungsindex beeinflusst haben könnten annulliert durchzuführen. <ol><li> Speichern Sie die abgezogen Kurven in ter Blatt des Projekts unter einem anderen Namen. </li></ol></li><li> Beziehen sich auf diese Kurven als &quot;doppelt abgezogen Kurven&quot;: die erste Subtraktion ist 2-1 Subtraktion beider Einspritzungen durchgeführt wird, und das zweite ist die Subtraktion einer Kurve von einem anderen. HINWEIS: Eine solche Doppel Referenzierung ist der Goldstandard in der SPR-Experimente. </li><li> Überlagern die Kurven subtrahiert, indem Achsenverschiebung, wie vorstehend erläutert. </li></ol></li><li> Bestimmung der Kinetik-Konstanten und Modellanpassung <ol><li> Die Durchführung einer kinetischen Experiment <ol><li> Spritzen Sie eine Reihe von 6-7 Analytkonzentrationen, um eine zuverlässige Daten zur kinetischen Konstanten Bestimmung haben. Wählen Analytkonzentrationen von 10-fach über den 10-fach unter der geschätzten K D, in 2-3-fach-Verdünnungen. Fügen Sie die &quot;Null&quot; Konzentration, später für Doppelreferenz Subtraktion verwendet (siehe oben). Führen Injektionen in dreifacher Ausführung und in zufälliger Reihenfolge. </li><li> Ausrichtenund subtrahieren Sie alle Kurven in Bezug auf die Y-Achse und X-Achse, bevor Modellanpassung. </li></ol></li><li> Modellanpassung <ol><li> Wählen Sie einen geeigneten Analyseprogramm. HINWEIS: Die meisten verfügbaren passend Programme bieten mehrere Modelle, die für die Montage und die Bestimmung der kinetischen Konstanten angewendet werden können. </li><li> Anwenden das einfachste Modell (Langmuir) unter der Annahme einer reversiblen 1: 1-Wechselwirkung zwischen dem Analyten und den Liganden für den Einbau. Es sei denn, überzeugende Daten aus anderen experimentellen Methoden für die Existenz einer komplexen Interaktion, immer den einfachen Langmuir-Modell. </li></ol></li></ol></li></ol>

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All authors declare that they have no competing financial interests.

SPR ist ein hochempfindliches Verfahren, um molekulare Wechselwirkungen zu untersuchen, und ist oft der einzige Ansatz, der Echtzeit-Überwachung von vorübergehenden (noch wichtiger) Wechselwirkungen liefert. Ein Beispiel ist die vorübergehende Wechselwirkung hierin dargestellt, die nicht durch ein anderes Verfahren (Pull-down-Assays, Liposomen Sedimentation Assays 6) festgestellt werden konnte. Darüber hinaus, während andere Verfahren sind begrenzt, um Messungen Gleichgewicht (ob quantitativ oder qualita...

Protein-Protein-Interaktionen (PPI); die Bildung und Dissoziation von Proteinkomplexen, sind Schlüsselereignisse in vielen biologischen Prozessen (zum Beispiel der Replikation, Transkription, Translation, Signalisierung, Zell-Zell-Kommunikation). Semi-quantitative Studien der PPI sind oft unter Verwendung von Pull-Down-oder Immunpräzipitation Experimente. Jedoch sind diese (und ähnliche) Techniken im Bereich von Affinitäten, die gemessen werden kann (niedrigen mikromolaren und höhere Affinität) durch die Waschschritte, die bei einem solchen Verfahren sind beschränkt. Solche &quot;Endpunkt&quot; Techniken nicht identifizieren kann vorübergehend oder geringe Affinität Wechselwirkungen, die häufig von großem biologischen Konsequenzen sind. Zusätzlich wird die zeitliche Auflösung solcher Ansätze äußerst beschränkt, üblicherweise um Größenordnungen langsamer als die Raten der Reaktion. SPR überwindet diese Mängel durch seine erhöhte Sensibilität und überlegene Zeitauflösung 1,2. SPR ist eine markierungsfreie Methode, und als solchemolekulare Wechselwirkung gemessen werden kann (solange die Massenänderung festgestellt werden kann). Neben PPI wurde extensiv verwendet, um Protein-Ligand, Protein-Arzneistoff (oder kleines Molekül), Protein-DNA und Protein-RNA-Interaktionen 3-5 charakterisieren. Die Ergebnisse werden aufgezeichnet und in Echtzeit, was eine schnelle Abänderung der Versuchsbedingungen und Versuchs flexible Bauweise ermöglicht. Das physikalische Prinzip hinter SPR basierte Instrumente besteht in der Verwendung eines optischen Systems, das eine Änderung des Brechungsindex misst auf der Sensoroberfläche auf Masse ändert 2. Einer der Wechselwirkungspartner (hiernach Liganden) auf einer Polymermatrix-Chip und das zweite Molekül (nachstehend Analyt) wird über der Oberfläche floß immobilisiert. Analyt-Bindung an den Liganden verändert die Masse auf der Chipoberfläche. Diese Massenänderung ist direkt und proportional zu Änderungen des Brechungsindex der Oberfläche bezogen. Die Ergebnisse werden in Echtzeit aufgezeichnet undals Reaktionseinheiten (RU) als eine Funktion der Zeit dargestellt. Eine solche Handlung ist eine Sensogramm bezeichnet (zB Abbildung 1). Da SPR folgt die komplette zeitliche Verlauf der Wechselwirkung werden Vorgleichgewicht Geschwindigkeitskonstanten abgeleitet sind, zusätzlich zu den Affinitäten Gleichgewicht. Wie unten beschrieben, die Vor-Gleichgewichtsverhalten eines Systems hält viele Informationen und bietet eine ganz andere Perspektive als Gleichgewicht allein. Nachdem das System kalibriert ist, sind Versuche sehr schnell und benötigen nur geringe Mengen an Proteinmaterial (Mikrogramm Mengen Nanogramm). Sammeln des kompletten kinetischen Daten von einem gegebenen System kann in Tagen erreicht. Die hohe Empfindlichkeit von SPR-Messungen liefert, die nicht durch ein anderes Verfahren 6 sind möglich. Ist diese hohe Empfindlichkeit jedoch ein &quot;zweischneidiges Schwert&quot;, da es eine der Hauptquellen für falsch positive Daten sein. Jeder Faktor, der den Brechungsindex beeinflusst wird aufgezeichnet und auf der Sensogramm. Als solche apsprechende Kontrollen müssen genutzt werden, um falsch-positive zu beseitigen, und die Unterstützung von komplementären Ansätzen wird dringend empfohlen. Abbildung 1 zeigt den Verlauf einer SPR-Experiment unter Verwendung einer NTA-beschichteten Sensorchip. Die Sensogramm in Tafel A zeigt die Injektion von der Nickelionen über die NTA-Matrix (unsubtrahierter Daten) und Platten BD die Daten anzeigen nach Abzug des aus der negativen Kontrollzell abgeleiteten Signals. Rote und blaue Pfeile zeigen Einspritzbeginn und das Ende auf. Immobilisieren des Liganden auf den Chip schrittweise verändert, bis die Masse Einspritzung beendet. Das nach Beendigung der Einspritzung von Ligand beobachtet stabiles Plateau spiegelt die stabile Assoziation des Liganden an der Oberfläche (1B, Zyklus 2). Sobald eine stabile Basislinie erreicht ist ein Puffer gegenüber dem Liganden und der Referenzzelle (1B, Zyklus 3) .Dieses Injektion dient als &quot;Blindkontrolle&quot; eingespritzt, und werdenwährend der Analyse abgezogen. Nach der Injektion werden kleinere Änderungen aufgezeichnet, was eine Strömung von Masse durch den Chip. Dann in einem separaten Kreislauf (Abbildung 1B, Zyklus 4), der Analyt eingespritzt wird; Die schrittweise Erhöhung der RU stellt Verband des Analyten an den Liganden. Die Bindungsstellen allmählich besetzt, bis ein Gleichgewicht erreicht wird. Sobald Einspritzung endet, ein Rückgang der EVU spiegelt Dissoziation des Komplexes. Aus solchen Sensogramme Pre-Gleichgewicht und Gleichgewicht Geschwindigkeitskonstanten abgeleitet werden können (siehe unten). Abbildung 1 zeigt eine transiente Interaktion zwischen dem Liganden und Analyten. Wenn die Interaktion ist stabiler, ist der Rückgang der EVU-Ebene langsamer, was auf einen geringeren k d. Hier beschreiben wir eine SPR-Experiment am Charakterisieren der Wechselwirkung zwischen einem Membrantransporter (solubilisiertem) und seine funktionellen Partner seinen zugehörigen Substrat-Bindungsprotein 6,7 gerichtet. Die gewählte model-System ist ein ATP-Bindungs-Cassette (ABC) Transporter, ModBC-A von Archeaglobus fulgidus. Dieses System wurde für die sehr gut reproduzierbare Ergebnisse &quot;on / off&quot; Raten ausgewählt, hohem Signal-Rausch-Verhältnis und klassisch. Darüber hinaus sind Homologen ABC-Transporter zur Verfügung als wichtige negative Kontrollen dienen. Der Transporter, ModBC (Ligand A) von der Membran mit Reinigungsmittel, gereinigt und auf den Chip immobilisiert extrahiert. Seine löslichen Interaktionspartner, ModA ist der Analyt. Als Negativkontrolle Ligand wird eine andere ABC-Transporter RbsBC verwendet (&quot;Ligand B&quot;).

<table><tbody><tr><td>Biacore T200</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9750-01</td><td></td></tr><tr><td>Sensor Chip NTA&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>14100532</td><td></td></tr><tr><td>BIAevaluation</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biacore T200 Software&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nickel chloride</td><td>Sigma</td><td>N6136</td><td></td></tr><tr><td>Sodium tungstate dihydrate</td><td>Sigma</td><td>T2629</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride&amp;nbsp;</td><td>Bio-Lab LTD.</td><td>19030591</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&amp;beta;-D-Maltopyranoside (DDM)</td><td>Affymetrix</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate solution&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>05030</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes KIMTECH</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>GADOT</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Nylon (NY) Membrane Filter</td><td>Sartorius</td><td>25007--47------N</td><td></td></tr><tr><td>ModBC ABC transporter</td><td>Lewinson lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RbsBC ABC transporter</td><td>Lewinson lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ModA Substrate Binding Protein</td><td>Lewinson lab</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

real time measurements of membrane protein:receptor interactions using surface plasmon resonance (spr)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

In dem hier beschriebenen System wird eine NiNTA Chip verwendet, um die His-markierte Membrantransporter 6,7 immobilisieren. Wobei ein Homodimer ist jedes Transporters doppelt markiert, die Verbesserung seiner Bindung zum NiNTA-Chip. Nach Nickelbeladung, Liganden A (der Transporter von Interesse) auf Fc = 2 immobilisiert, bis ~ 3500 RU (Protokoll Zyklus 2, 2A black label). Dann werden mit dem gleichen Strömungs und Einspritzdauer, Ligand B (Kontrollliganden) an Fc = 1 eingespritzt wird, zun?...

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Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Oberflächenplasmonresonanz (SPR) ist eine markierungsfreie Verfahren zur Detektion biomolekularer Wechselwirkungen in Echtzeit. Hierin wird ein Protokoll für ein Membranprotein: Rezeptor-Interaktion Experiment beschrieben, bei der Diskussion der Vor- und Nachteile der Technik.

Echtzeit-Messungen von Membranprotein: Rezeptor-Wechselwirkungen Mit Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

real-time-measurements-membrane-proteinreceptor-interactions-using

Research

JoVE Journal

Biology

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

22.6K Aufrufe.  The Technion-Israel Institute of Technology.  Oberflächenplasmonresonanz (SPR) ist eine markierungsfreie Verfahren zur Detektion biomolekularer Wechselwirkungen in Echtzeit. Hierin wird ein Protokoll für ein Membranprotein: Rezeptor-Interaktion Experiment beschrieben, bei der Diskussion der Vor- und Nachteile der Technik. 

Serie: Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA is a novel transcription activator found specifically in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia. Protein pulldown assays using affinity beads have revealed that GrgA binds two &#963; factors, namely &#963;66 and &#963;28, which recognize different sets of promoters for genes whose products are differentially required at developmental stages. We have used BLI to confirm and further characterize the interactions. BLI demonstrates several advantages over pulldown: 1) It reveals real-time association and dissociation between binding partners, 2) It generates quantitative kinetic parameters, and 3) It can detect bindings that pulldown assays often fail to detect. These characteristics have enabled us to deduce the physiological roles of GrgA in gene expression regulation in Chlamydia, and possible detailed interaction mechanisms. We envision that this relatively affordable technology can be extremely useful for studying transcription and other biological processes.

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Interactions of transcription factors (TFs) with the RNA polymerase are usually studied using pulldown assays. We apply a Biolayer Interferometry (BLI) technology to characterize the interaction of GrgA with the chlamydial RNA polymerase. Compared to pulldown assays, BLI detects real-time association and dissociation, offers higher sensitivity, and is highly quantitative.

Anwendung der Biolayer-Interferometrie (BLI) zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen bei der Transkription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Forschung

Biochemie

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Biotechnik

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

Fluoreszenz Biomembrane Kraft Sonde: Concurrent Quantifizierung von Rezeptor-Ligand-Kinetik und Binding-induzierte intrazelluläre Signaling auf Einzelzell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. This method combines expression of proteins tagged with the fluorescent non-canonical amino acid ANAP, and FRET between ANAP and fluorescent (trinitrophenyl) nucleotide derivatives. We present examples of nucleotide binding to ANAP-tagged KATP ion channels measured in unroofed plasma membranes and excised, inside-out membrane patches under voltage clamp. The latter allows for simultaneous measurements of ligand binding and channel current, a direct readout of protein function. Data treatment and analysis are discussed extensively, along with potential pitfalls and artefacts. This method provides rich mechanistic insights into the ligand-dependent gating of KATP channels and can readily be adapted to the study of other nucleotide-regulated proteins or any receptor for which a suitable fluorescent ligand can be identified.

This protocol presents a method for measuring adenine nucleotide binding to receptors in real time in a cellular environment. Binding is measured as F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between trinitrophenyl nucleotide derivatives and protein labeled with a non-canonical, fluorescent amino acid.

Messung der Nukleotidbindung an intakte, funktionelle Membranproteine in Echtzeit

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

Ein Markierungsfreie Technik für die Raum-zeitliche Imaging von Single Cell Sekrete

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

Echtzeit-Überwachung von Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen mit Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Biologie

Real-Time Detection of Dynamic Affinity between Biomolecules Using Surface Plasmon Resonance (SPR) Technology

Surface plasmon resonance (SPR) technology is a sensitive precise method for detecting viruses, pathogenic molecular proteins, and receptors, determining blood types, and detecting food adulteration, among other biomolecular detections. This technology allows for the rapid identification of potential binding between biomolecules, facilitating fast and user-friendly, non-invasive screening of various indicators without the need for labeling. Additionally, SPR technology facilitates real-time detection for high-throughput drug screening. In this program, the application field and basic principles of SPR technology are briefly introduced. The operation process is outlined in detail, starting with instrument calibration and basic system operation, followed by ligand capture and multi-cycle analysis of the analyte. The real-time curve and experimental results of binding quercetin and calycosin to KCNJ2 protein were elaborated upon. Overall, SPR technology provides a highly specific, simple, sensitive, and rapid method for drug screening, real-time detection of related pharmacokinetics, virus detection, and environmental and food safety identification.

Real-Time Detection of Dynamic Affinity between Biomolecules Using Surface Plasmon Resonance SPR Technology

The present study aims to elucidate the principle and methodology of surface plasmon resonance (SPR) technology, which finds versatile applications across multiple domains. This article describes SPR technology, its operational simplicity, and its remarkable efficacy, with the goal of fostering broader awareness and adoption of this technology among readers.

Surface plasmon resonance (SPR) technology is a sensitive precise method for detecting viruses, pathogenic molecular proteins, and receptors, determining ...

Medizin

Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets

Extracellular vesicles (EVs) are membrane-derived, tiny vesicles produced by all cells that range from 50 to several hundreds of nanometers in diameter and are used as a means of intercellular communication. They are emerging as promising diagnostic and therapeutic tools for a variety of diseases. There are two main biogenesis processes used by cells to produce EVs with differences in size, composition, and content. Due to their high complexity in size, composition, and cell origin, their characterization requires a combination of analytical techniques. This project involves the development of a new generation of multiparametric analytical platforms with increased throughput for the characterization of subpopulations of EVs. To achieve this goal, the work starts from the nanobioanalytical platform (NBA) established by the group, which allows an original investigation of EVs based on a combination of multiplexed biosensing methods with metrological and morphomechanical analyses by atomic force microscopy (AFM) of vesicular targets trapped on a microarray biochip. The objective was to complete this EV investigation with a phenotypic and molecular analysis by Raman spectroscopy. These developments enable the proposal of a multimodal and easy-to-use analytical solution for the discrimination of EV subsets in biological fluids with clinical potential

This paper proposes a new generation of multiparametric analytical platforms with increased throughput for the characterization of extracellular vesicle subsets. The method is based on a combination of multiplexed biosensing methods with metrological and morphomechanical analyses by atomic force microscopy, coupled with Raman spectroscopy, to qualify vesicular targets trapped on a microarray biochip.

Multimodale Analyseplattform auf einem Multiplex-Oberflächenplasmonen-Resonanztomographie-Chip zur Analyse extrazellulärer Vesikel-Untergruppen

Extracellular vesicles (EVs) are membrane-derived, tiny vesicles produced by all cells that range from 50 to several hundreds of nanometers in diameter ...

Surface Plasmon Resonance (SPR)

Surface plasmon resonance (SPR) is the underlying optical phenomenon behind label-free biosensors to evaluate the molecular affinity, kinetics, specificity, and concentration of biomolecules. In SPR, biomolecular interactions occur on a biosensor made of a thin layer of metal on a prism. Real-time interactions of biomolecules can be monitored by measuring the changes of light reflected off the underside of the metal.
This video describes the basic concepts of SPR and how it is used to analyze and visualize biomolecular interactions. This is followed by a sample preparation and experimental protocol for investigating binding rates using SPR. In the applications section, SPR imaging, localized SPR, and quantum dot enhanced SPR are explored.
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Surface plasmon resonance, or SPR, is the underlying phenomenon behind certain label-free biosensors for evaluating binding and adsorption interactions of biomolecules. Binding assays that require labeling, such as ELISA, can be a time-consuming process, and may alter the functionality of the analyte. In SPR, biomolecular interactions occur on a special sensor made of a thin layer of metal on one face of a prism. By monitoring the changes in light reflected off of the underside of the metal, SPR instruments visualize these interactions in real-time without the use of labels. This video will introduce the principles of SPR, a general procedure for SPR imaging, and some applications of in biochemistry.
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An SPR sensor is usually made of a thin layer of a noble metal atop the face of a prism. To take readings from the sensor, light is reflected off of the prism-metal interface into a photodetector. The reflected light will have a high intensity except at a certain angle, related to the electronic properties of the metal surface, known as the &#34;surface plasmon resonance angle&#34;.
As molecules bind to the surface, the electronic properties of the metal change, which in turn adjusts the angle. As new proteins attach, forming complexes, the angle will shift further. By measuring relative changes in the SPR angle, interactions like these can be monitored in real-time.
Another technique called localized, or &#34;L&#34;SPR, uses metal nanoparticles as the sensor surface. The properties that affect the SPR angle are highly localized to each nanoparticle, which improves sensitivity and signal resolution.
When investigating binding interactions with standard SPR, the sensor is generally mounted in a platform that becomes the floor of a flow cell in the instrument. The biomolecules of interest are carried through the flow cell by buffer solution. The sensor surface is often first coated with a substrate that has a high affinity for the metal. This ensures that a significant amount of ligand, which in turn binds to the analyte of interest, will be immobilized onto the sensor and reduces the likelihood that the ligand will dissociate during the procedure.
Once the ligand is immobilized on the sensor, the analyte is flowed over the sensor in buffer. By monitoring the change in the SPR angle over time as the analyte binds to the ligand, the binding rate and other kinetic information can be calculated.
The reflectance data can also be used for SPR imaging, or SPRi, by directing the reflected light to a CCD detector. This produces a high-contrast, high-resolution image of the entire sensor surface. Using SPR and the related techniques, questions can be answered about molecular affinity, kinetics, specificity, and concentration.
Now that you understand what is being measured in an SPR experiment, let&#39;s look at a procedure for investigating binding rates.
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Before beginning the procedure, the running and sample buffers must be prepared. The running buffer is used to deposit the ligand onto the sensor, and the sample buffer is used to deposit the analyte. The sensor chip is carefully cleaned and loaded into a sheath. Then, the device is placed into the instrument, where it becomes the bottom of the flow cell. The instrument software is set up for the experiment and subsequent analysis. If necessary, the sensor surface is primed with a substrate to capture the ligand. The ligand is flowed over the sensor surface in the running buffer, where it is captured by the substrate on the sensor surface.
Then, the analyte in the sample buffer is run through the flow cell, where it selectively binds to the immobilized ligand. The change in reflectance is plotted and compared against controls to determine rate constants and other reaction kinetics data for the investigated reaction.
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Now that you understand how an SPR experiment is performed, let&#39;s look at a few other applications of SPR in biochemistry.
Here, SPR imaging was used to evaluate proteins with an array of eleven receptors on a sensor. 3D graphs of reflectivity versus time and receptor concentration were prepared from the reflectivity data for each protein. These &#34;profiles&#34; are characteristic to each protein, and thus could subsequently be used for protein identification.
In this experiment, cell secretions were studied using a custom-made LSPR sensor. The sensor was also compatible with SPRi and fluorescence microscopy. Upon depositing the cell on the sensor, the interaction of cell secretions with the nanoparticle array could be measured with high spatial resolution.
Here, the use of quantum dots, nanoscale semiconductors, as an SPR signal enhancement agent mixed with the analyte was investigated. This enhanced &#34;nano-SPRi&#34; method was compared to assays by standard SPRi and the ELISA method. The nano-SPRi method significantly improved the sensitivity and limit of detection while still being less time-consuming than the ELISA method.
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You&#39;ve just watched JoVE&#39;s video on surface plasmon resonance. This phenomenon is used to monitor and image biomolecular interactions without the use of labels. This video introduced the principles of SPR, a typical protocol for performing an SPR experiment, and a few applications of SPR in biochemistry.
Thanks for watching!
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Surface Plasmon Resonance SPR: Label-Free Detection

Surface plasmon resonance (SPR) is the underlying optical phenomenon behind label-free biosensors to evaluate the molecular affinity, kinetics, ...

Lehre

JoVE Science Education

Chemie

Grundlagen der Biochemie

Surface Plasmon Resonance to Study Biomolecular Interactions Using a Sensor Chip

Source: Maier, I. <a href="https://app.jove.com/v/63541">Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video describes the surface plasmon resonance, or SPR, technique for studying the interaction between two molecules using a sensor chip. The change in resonance angle and the intensity of the reflected light are detected as a function of the association and dissociation of two molecules, and this provides information about the interactions between the two molecules.

Oberflächenplasmonenresonanz zur Untersuchung biomolekularer Wechselwirkungen mit einem Sensorchip

Source: Maier, I. Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance. J. Vis. Exp. (2022)
This video describes the surface plasmon resonance, or ...