Finanzielle Unterstützung für diese Arbeit wurde durch die National Science Foundation, National Institute of Health (NIH), Materialwirtschaft Technology Center (MTC) und ORDA am SIUC vorgesehen. Wir danken NSF für ein Stipendium (CHE-0959568) für den Kauf eines FE-SEM. Wir möchten Prof. Matthew McCarroll für hilfreiche Diskussionen danken. Julia Reyes wird gerne COLCIENCIAS, kolumbianische Agentur und Universidad Pedagogica y Tecnologica de Colombia für ihre Stipendien und finanzieller Unterstützung danken.

A. Synthese und Charakterisierung von PDA Liposomen 4,5,6 Hinweis 1: Schützen Sie die PDA-Lösung von Licht mit Aluminiumfolie Verpackung auf jedem Behälter durch alle experimentellen Schritte. Anmerkung 2: Zwei verschiedene Sätze von Liposomenlösung (B und C) wurden folgende Verfahren A hergestellt (Synthese und Charakterisierung von Liposomen PDA). Ein. Synthese von N-Hydroxysuccinimid Diacteylene (NHS-PCDA) <ol><li> Liposomen herzustellen, wird ein wesentlicher Bestandteil PCDA-NHS erforderlich. Wir haben PCDA-NHS synthetisiert, indem folgende Vorgehensweise: </li><li> Hinzufügen 10,12-pentacosadiynoic Säure (PCDA) (0,267 g, 0,713 mmol), N-Hydroxysuccinimid (0,0914 g, 0,786 mmol) und 1 - (3 - (dimethylamino) propyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (0,144 g, 0,713 mmol ) in trockenem CH 2 Cl 2 (20 ml). </li><li> Man rührt die Lösung bei Raumtemperatur für 2 Stunden. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Lösungsmittel durch rotary Verdampfer ergeben eine trockene Dünnfilm. </li><li> Verwenden Scheidetrichter, um den Rückstand mit Diethylether (25 ml) und Wasser (25 ml) dreimal extrahiert. </li><li> Die organische Schicht wird mit MgSO 4 (1,0 g) für eine halbe Stunde. Filtern und Entfernung des Lösungsmittels durch Rotationsverdampfung um einen weißen Feststoff Pulver (0,24 g,&gt; 90%) zu erhalten. </li><li> Analysieren endgültige Verbindung unter Nuclear Magnetic Resonance (NMR). </li><li> 1 H-NMR (300 MHz, DMSO), δ (ppm): 0,893 (t, 3H), 1,268 (m, 26H), 1,512 (m, 4H), 1,754 (m, 2H), 2.252 (t, 4H), 2,365 (m, 1H), 2,610 (m, 1H), 2,842 (s, 2H). </li></ol> 2. Liposomenpräparat 5,6,7 <ol><li> Aufzulösen PCDA: PCDA-NHS: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC) :: 8: 1: 1 in 20 ml Dichlormethan. </li><li> Filtern der Lösung mit einem Filterpapier, um Aggregate zu entfernen. </li><li> Man dampft das Lösungsmittel vollständig um einen dünnen Film von Monomeren zu ergeben. </li><li> Trocknen Sie die Dünnschicht Nacht unter vacuum. </li><li> Hydrat der Film mit entionisiertem Wasser (50 ml), um eine Liposomen-Lösung einer gewünschten Konzentration (0,65 bis 1 mM) zu machen. </li><li> Beschallen der erhaltenen Suspension mit einer Sonde Sonicator bei 76 ° C für ~ 18 min. </li><li> Ausweiten vorsichtig die Lösung durch ein Filterpapier, um die Lipid-Aggregate zu entfernen </li><li> Man kühlt die Lösung bei 4 ° C über Nacht zur Selbstorganisation der Monomere zu fördern. Die endgültige Lösung sollte optisch klar. </li><li> Polymerisieren die selbstorganisierte Diacetylen Monomere (Liposom) durch Bestrahlung mit 254 nm UV-Strahlung für ~ 2 min unter Verwendung eines Stiftes Ray UV-Quelle (4,5 mW / cm 2) in Luft. </li><li> Liposom Lösung war bei Raumtemperatur stabil für mindestens zwei Wochen. Die Lösung war stabil, wenn gekühlt. </li></ol> B. Herstellung von Rhodamin-markiertes Rinderserumalbumin (BSA-Rh) modifiziert PCDA Liposomen Ein. Die Bindung von BSA-Rh auf die Oberfläche von Liposomen <ol><li> Lösen BSA-Rh in PBS buffer (Ionenkonzentration betrug 0,01 M, pH 7,2), um die Endkonzentration von 1,2 pM von BSA-Rhodamin Lösung. </li><li> 2 ml (1,2 pM) von BSA-Rhodamin zu 10 ml Liposomenlösung in Schritt A.2. (Siehe oben) bei Raumtemperatur hergestellt. </li><li> Klassische Reaktion zur Bindung von Aminogruppen aus der Lysinrest von Proteinen an Carbonsäure durch NHS Gruppe aktiviert wurde befolgt (Reaktionsschema in Fig. 2). NHS-PCDA entwickelt wurde (Abbildung 2, Stufe 1) für kovalent bindendes Protein-Moleküle mit Liposomen mit NHS-Amin-Reaktionen (Abb. 2, Schritt 2). NHS ist ein ausgezeichnetes Mittel, das Verlassen des Amin-Carbonsäure-Reaktion in der Vorwärtsrichtung antreibt. Die Ausbeute dieser Reaktion unter geeigneten Bedingungen müssen quantitativ sein. </li><li> Entfernung von freiem BSA-Rh: Tränken Sie ein Spectra / Por Biotech Cellulose Ester (CE)-Membran (MW C O: 100.000) in entionisiertem wasser für 15 min. Diese Membran wird zur Dialyse verwendet umgesetztes BSA-Rhodamin (Molekulargewicht ~ 66.000 Da) in entionisiertem Wasser. </li><li> Transferieren es vorsichtig in die Lösung in der Dialysemembran. </li><li> Wechseln Sie das Wasser bei 2 h, 8 h, 14 h, 24 h und 36 h während der Dialyse. </li><li> Sammeln Sie die endgültige Lösung in einer Durchstechflasche mit Aluminiumfolie abgedeckt. </li></ol> C. Herstellung von SR-diamin und Biotin-markierte Liposomen Ein. Anstelle der Verwendung von DMPC im Schritt 2.1, verwenden wir Biotin-markierten-(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(Biotinyl) (Biotin-DOPE). <ol><li> Befolgen Sie alle Schritte durch 2,2 bis 2,9. </li><li> Anstelle von BSA-Rh in Schritt B, verwenden Diamin tagged Sulforhodamin (SR-Diamin). </li><li> Befolgen Sie alle weiteren Schritte in B. </li><li> Die Liposomen in dieser Zubereitung enthaltene Biotin und auf ihren Oberflächen SR-diamin. Nachfolgende Schritte waren ähnlich zu A und B (siehe oben) mit einer Ausnahme: Streptavidin wurde der Lö hinzugefügtan Biotin-Streptavidin Wechselwirkung durch Veränderungen in der zu untersuchen FRET Effizienz. </li></ol> D. Repräsentative Ergebnisse <img alt="Titel Figure" src="/files/ftp_upload/3805/3805figtitle.jpg" /> Titel Figure. Ein Cartoon Erläuterung der Reaktion und FRET auftretenden der Liposomenoberfläche (hergestellt durch folgenden Schritt B). A. Überwachung von Protein Bindung an Liposomen mittels FRET 1 Überwachung von FRET zwischen Rhodamin und PDA Liposomen in Schritt B. hergestellten Anregungs-und Emissionsspektren von BSA-Rh und Absorptionsspektrum PDA getroffen werden (Abbildung 3A). Man kann klar erkennen, dass das Emissionsspektrum des BSA-Rh überlappt mit dem Absorptionsspektrum des PDA. Dies erfüllt die Resonanz Voraussetzung für die FRET-Mechanismus. BSA-Rhodamin markierten Liposomen vor und nach der Polymerisation wurde mit UV-V analysiertist und Fluoreszenzspektroskopie. Für das isolierte Donor und Akzeptor, FRET der Wirkungsgrad stark von Donor-Akzeptor-Distanz (r) und J 1 (j-Wert). Das Abschrecken der Emission beobachtet (Abbildung 3B) wegen FRET zwischen Rhodamin und PDA durch das Auftreten von elektronischen Absorptionsspektrum blauen PDA nach Photopolymerisation. In unserem Fall, FRET-Effizienz ist Null für unpolymerisierten Liposomen und Rhodamin weil J = 0 für unpolymerisierten Liposomen im sichtbaren Bereich. Wir führten ähnlichen Versuchen mit nur PDA Liposomen, die nicht enthielt NHS auf ihrer Oberfläche. In diesen Fällen wurde BSA-Rh nicht an die Oberfläche der Liposomen markiert. In diesem Fall betrug der durchschnittliche Abstand zwischen Rhodamin und PDA (r durchschnittlich) viel größer als Förster-Radius (R 0 = 2,8 nm). So haben wir nicht beobachten einen starken Rückgang der Fluoreszenzintensität. Diese Beobachtung einlso schlägt vor, dass die Fluoreszenzlöschung dominant ist, wenn r &lt;2,8 nm. J und R 0-Werte wurden anhand folgender Formeln: [1] J (λ) = ∫ F D (λ) ε A (λ) λ 4 dλ R 0 = 0,211 [k 2 n -4 J Q D (λ)] 1/6 Der Extinktionskoeffizient (ε) aus blau-PDA ist in dem Bereich von ~ 2.000 bis 10.000 M -1 cm -1 vor der Zugabe von Streptavidin. Der Extinktionskoeffizient von blau-PDA ist abhängig von der Photopolymerisation Zustand. [2] Zum Beispiel wird ε-Werte größer sein für eine Lösung, die eine längere Zeit polymerisiert wurde. Ferner kann die Selbstorganisation der Diacetylen Monomere beeinflussen auch die ε-Werte. Die J calculations berücksichtigen diese Veränderungen, und sie spiegeln Veränderungen in den PDA Extinktionskoeffizienten durch Biotin-Streptavidin molekularen Wechselwirkungen. J-Werte sind berechnet anhand der experimentellen PDA Absorption und SR-101 Emissionsdaten. Die Veränderungen in den J-Werte sind auf im elektronischen Absorptionsspektrum PDA nach Zugabe von Streptavidin zu der Lösung (4C) zu verlagern. Die Einheit von J Werten M -1 cm -1 nm 4. B. Überwachung von FRET mit Zugabe von Streptavidin an die Biotin-markierte Liposomenlösung Hinweis 1: Überwachung von FRET zwischen Rhodamin und PDA Liposomen in Schritt C oben hergestellt. Anregungs-und Emissionsspektren des Sulforhodamin-tagged diamine (SR-diamin) und Absorptionsspektrum PDA getroffen werden (4A). Unpolymerisierten und polymerisierten Biotin markiert Liposomen wurden mittels UV-Visund Fluoreszenzspektroskopie. Die Emission von Rhodamin (SR-101) wird um ca. 45% nach der Polymerisation (4B) hindeutet Fluoreszenzlöschung durch FRET verringert. Fügen Sie 40 ul Aliquots (1 pM) von Streptavidin Lösung zu 2 ml des Liposom-Lösung. Mit der Zugabe von Streptavidin zu der Lösung wird Veränderungen in J-Wert beobachtet (4C). Wie Biotin an Streptavidin bindet, der blaue Peakintensität PDA Liposom (zentriert bei ~ 645 nm in 1) wurde während einer Erhöhung der Absorptionspeaks bei 540 nm vermindert wird beobachtet (A BBILDUNG 1S). 4D zeigt Änderungen in der FRET Wirkungsgrad. Die FRET-Effizienz mit der Zunahme der Streptavidin Konzentration sank steht auch im Einklang mit unserer Vorhersage. Notieren Sie sich die SR-Emission nach jeder 40 ul Aliquot Zugabe von Streptavidin. Wir beobachteten eine stetige Zunahme der Rhodamin-Emission nach der Zugabe von StreptAvidin (Abb. 5). Diese Erhöhung der Rhodamin-Emission ist aufgrund einer Abnahme in der J-Wert für die Sulforhodamin Emissionsspektrum und PDA Absorptionsspektrums nach Biotin-Streptavidin-Wechselwirkungen. Auf molekularer Ebene werden die Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung, um feine Änderungen in der effektiven Länge der Konjugation PDA was zu einer Abnahme in der blau-PDA Form zu einer thermodynamisch stabilen Form der roten PDA 2 zur Folge hat. Dies ist die Grundlage der Veränderungen des J-Werte. Interessanterweise kann die feinen Unterschiede in den molekularen Wechselwirkungen kovalent oder nicht-kovalent gebundenen Biotin PDA Liposomen sondiert werden mit unseren Messen Assay 4. Wir haben auch Kontrollexperimente durchgeführt und überwacht haben die Emission der Kontrollproben unter denselben experimentellen Bedingungen wie die für Streptavidin-Biotin-System. Die Kontrollversuche bestehen aus: (1) liposomaler Lösungen, enthalten Biotin auf ihrerOberfläche wurden Pufferlösung von gleichem Volumen und Konzentration zugesetzt, und (2) Liposom-Lösung ohne Biotin-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche Streptavidin wurden von gleichem Volumen und Konzentration zugesetzt. Die Intensität des Biotin-markierten Liposomen Lösung nach der Zugabe von Streptavidin zeigten erhöhte Intensität, aber die Intensität der Liposomenlösung der Kontrollversuche (zum Beispiel, siehe Abbildung 2B), auf der anderen Seite zeigte eine im Emissionsintensität vermindert. Dies wird Verdünnung der Lösung zugeschrieben. Diese Experimente zeigten deutlich, dass das verstärkte Emission der Lösung aufgrund der spezifischen molekularen Wechselwirkungen war. Förster-Radius (R 0) für Rhodamin und PDA Paar berechnet (Gleichung 2) auf ~ 2,80 nm betragen. Dies bedeutet, dass für isolierte PDA-Rhodamin Paaren, 50% der angeregten Zustand Rhodaminmoleküle ihre Energie übertragen PDA haben, wenn r 2,80 nm beträgt. Wir obs<html> erved dass, wenn Biotin kovalent an das Rückgrat gebunden PDA, die Emission Anstieg 2-3 mal größer als die von nicht-kovalent gebundenem Biotin an Liposomen betrug. 4 Diese Ergebnisse legen nahe, dass unsere vorgeschlagenen Systems empfindlich auf kleine Unterschiede in der Interaktion zu unterscheiden am Wandler (Linker zwischen Biotin und Liposom-Doppelschicht) aufgrund kovalent und nicht-kovalent gebundene Rezeptoren, die an Liposomen. Abhängig von den Scan-und Datenerfassungsfunktionen des Spektrophotometers, die Echtzeit-Überwachung (in Millisekunden bis Sekunden Zeitskala) von Protein-Interaktionen (im UV-VIS-Spektroskopie) sind mit diesem Sensorsystem möglich. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig1.jpg" /> Abbildung 1. Absorptionsspektren der blauen und roten PDA-Lösungen. (Inset) optische Aufnahmen mit einer Digitalkamera aufgenommen wurden. g &quot;/&gt; Abbildung 2. Reaktionsschema für die PCDA-NHS-Synthese (Schritt 1). Reaktion von PCDA-NHS an den Aminsubstituenten von Proteinen (Schritt 2). Schritt 2 ist die Basis der Bindung Lysinrest von Proteinen an der Carbonsäure PCDA Monomer. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3805/3805fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="3A" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig3A.jpg" /> 3A. Beobachteten Veränderung der FRET Wirkungsgrad ist durch die Änderungen im Absorptionsspektrum des PDA. Vor der Polymerisation es keine Überlappung zwischen BSA-Rh-Emission und Absorption PDA aber nach der Polymerisation PDA Absorption überlappt mit BSA-Rh Emission, die die Anforderung für FRET ist. Rhodamin ein Donor (rot) und polymerisierten PDA Liposomen wirken als Akzeptor (blau). <img alt="3B" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig3B.jpg" /> Abbildung3B. Fluoreszenzspektren von BSA-Rh tagged Liposomen vor (blau) und nach PCDA Polymerisation (rot). Eine große Abnahme in der Rhodamin-Emission wurde beobachtet aufgrund zwischen Rhodamin und PDA FRET. <img alt="4A" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4A.jpg" /> .. 4A Spektrale Überlappung (J) Änderung für PDA (blau oder rot) und Sulforhodamin Absorptionsspektrum Emissionsspektrum (orange) 4A ist das repräsentative Spektrum für extremen Zustand, das heißt, wenn ein Überschuss an Streptavidin zu der Lösung gegeben wurde. 4A zeigt einen nahezu vollständigen Blau-nach-Rot PDA Transformation nach der Zugabe eines Überschusses an Streptavidin. Es ist deutlich erkennbar, dass J (spektrale Überlappung) mit blau-Verschiebung des PDA Absorptionsspektrum erhöht <img alt="4B" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4B.jpg" /> 4B. Fluoreszenz-Spektren vor (blau) und nach (red) Liposom Polymerisation. <img alt="4C" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4C.jpg" /> 4C Zustand für FRET:. J Änderung zwischen Donor (Sulforhodamin) und Akzeptor (PDA) mit dem Streptavidin zusätzlich zur Liposomenlösung. <img alt="4D" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4D.jpg" /> Figur 4D. FRET Effizienz Änderung zwischen der Donor (Sulforhodamin) und Akzeptor (PDA) mit dem Streptavidin zusätzlich zur Liposomenlösung. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig5.jpg" /> Abbildung 5. Rhodamin Emissionsspektrum nach der Zugabe von Streptavidin-Aliquots auf den PDA Liposomenlösung. Inset zeigt eine vergrößerte Ansicht der Emission Veränderungen in der SR-101 Spektren.

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	<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (1999).</li><li>Charych, D. H., Nagy, J. O., Spevak, W., Bednarski, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Colorimetric+Detection+of+a+Receptor-Ligand+Interaction+by+a+Polymerized+Bilayer+Assembly.">Direct Colorimetric Detection of a Receptor-Ligand Interaction by a Polymerized Bilayer Assembly.</a> Science. 261, 585-588 (1993).</li><li>Yoon, B., Lee, S., Kim, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Conceptual+and+Technological+Advances+in+Polydiacetylene-based+Supramolecular+Chemosensors.">Recent Conceptual and Technological Advances in Polydiacetylene-based Supramolecular Chemosensors.</a> Chem. Soc. Rev. 38, 1958-1968 (2009).</li><li>Xuelian, L. i., Kohli, P. u. n. i. t. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+Molecular+Interactions+in+Biosensors+Based+on+Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer.">Investigating Molecular Interactions in Biosensors Based on Fluorescence Resonance Energy Transfer.</a> J. Phys. Chem. C. 114, 6255-6264 (2010).</li><li>Li, X., Matthews, S., Kohli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer+in+Polydiacetylene+Liposomes.">Fluorescence Resonance Energy Transfer in Polydiacetylene Liposomes.</a> J. Phys. Chem. B. 112, 13263-13272 (2008).</li><li>Li, X., McCarroll, M., Kohli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer+in+Conjugated+Liposomes.">Modulating Fluorescence Resonance Energy Transfer in Conjugated Liposomes.</a> Langmuir. 22, (2006).</li><li>New, R. R. C., New, R. R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liposomes: A Practical Approach. , 33-104 (1990).</li><li>Chen, X., Lee, J., Jou, M. J., Kim, J. -. M., Yoon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+and+Fluorometric+Detection+of+Cationic+Surfactants+Based+on+Conjugated+Polydiacetylene+Supramolecules.">Colorimetric and Fluorometric Detection of Cationic Surfactants Based on Conjugated Polydiacetylene Supramolecules.</a> Chem. Commun. , 3434-3436 (2009).</li><li>Yarimaga, O., Im, M., Choi, Y. -. K., Kim, T. W., Jung, Y. K., Park, H. G., Lee, S., Kim, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Color+Display+System+Based+on+Thermochromic+Conjugated+Polydiacetylene.">A Color Display System Based on Thermochromic Conjugated Polydiacetylene.</a> Macromolecular Research. 18, 404-407 (2010).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir haben eine selektive Bindung der Lysinrest von Protein auf Liposomenoberfläche unter Verwendung NHS-Amin-Umsetzungsprodukte. Diese FRET basierten Methode ist dazu in der Lage Echtzeit-Überwachung von Biotin-Streptavidin-Bindung und Protein (BSA) Bindung an der Oberfläche der Liposomen. Ähnliches Verfahren angewendet werden, um die Bindungseigenschaften Dynamik der verschiedenen Protein-Wechselwirkungen mit ihrer selektiven Rezeptoren zu untersuchen. Es gibt Flexibilität bei der Auswahl Fluorophore, die Änderun...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namen Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> 10,12-pentacosadiynoic Säure (PCDA) </td><td> GFS Chemikalien </td><td> 3261 </td><td> Lichtempfindlich </td></tr><tr><td> N-Hydroxysuccinimid (NHS) </td><td> Acros Organics </td><td> 157270250 </td><td> Feuchtigkeitsempfindlich </td></tr><tr><td> 1 - (3 - (dimethylamino) propyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC) </td><td> Chem-Impex International </td><td> 00050 </td><td></td></tr><tr><td> 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC) </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 850345P </td><td></td></tr><tr><td> Rhodamin-markierte Bovine Serum Albumin (BSA-Rh) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A4537 </td><td></td></tr><tr><td> (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(Biotinyl) (Biotin-DOPE) </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 870282 </td><td></td></tr></tbody></table>

real-time monitoring of ligand-receptor interactions with fluorescence resonance energy transfer

FRET ist ein Prozess, bei dem Energie ist nicht strahlend von einem angeregten Donor-Molekül zu einem Grundzustand Akzeptor Molekül übertragen über weitreichende Dipol-Dipol-Wechselwirkungen ein. Im vorliegenden Abfühlen Assay, verwenden wir eine interessante Eigenschaft der PDA: Blauverschiebung im UV-Vis elektronischen Absorptionsspektrum PDA (Abbildung 1), nachdem ein Analyt wechselwirkt mit Rezeptoren an PDA 2,3,4,7. Diese Verschiebung in der PDA-Absorptionsspektrum liefert Änderungen der spektralen Überlappung (J) zwischen PDA (Akzeptor) und Rhodamin (Donor), die auf Änderungen in der FRET-Wirkungsgrad führt. Somit werden die Wechselwirkungen zwischen Analyt (Ligand) und Rezeptoren durch FRET zwischen Donor-Fluorophore und PDA detektiert. Insbesondere zeigen wir, das Erfassen eines Modells Proteinmolekül Streptavidin. Darüber hinaus zeigt die kovalente Bindung von-Rinderserumalbumin (BSA) an der Oberfläche der Liposomen mit Mechanismus FRET. Diese Wechselwirkungen zwischen ter Doppelschicht Liposomen und Proteinmoleküle können in Echtzeit erfasst werden kann. Das vorgeschlagene Verfahren ist ein allgemeines Verfahren zum Erfassen kleinen chemischen und biochemischen großen Molekülen. Da Fluoreszenz ist intrinsisch empfindlicher als Farbmessung, kann die Nachweisgrenze des Assays in sub-nanomolaren Bereich oder unteren 8 sein. Weitere, PDA als universelle Akzeptor in FRET zu handeln, was bedeutet, dass mehrere Sensoren mit PDA (Akzeptor) mit Gebern und verschiedene Rezeptoren auf der Oberfläche der PDA Liposomen befestigt funktionalisiert entwickelt werden können.

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Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

Wir demonstrieren FRET zwischen konjugiertes Polymer Polydiacetylen (PDA) und Fluorophor auf die Oberfläche des PDA Liposomen für die Erfassung von Biomolekülen gebunden. PDA Liposomen auch Rezeptormoleküle auf ihren Oberflächen für Biomoleküle als Sonden verwendet werden enthalten. Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen auf Änderungen des FRET-Effizienz zwischen dem Fluorophor und PDA, welche die Grundlage des Fühlmechanismus ist zu führen.

Echtzeit-Überwachung von Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen mit Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.3K Aufrufe.  Southern Illinois University. Wir demonstrieren FRET zwischen konjugiertes Polymer Polydiacetylen (PDA) und Fluorophor auf die Oberfläche des PDA Liposomen für die Erfassung von Biomolekülen gebunden. PDA Liposomen auch Rezeptormoleküle auf ihren Oberflächen für Biomoleküle als Sonden verwendet werden enthalten. Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen auf Änderungen des FRET-Effizienz zwischen dem Fluorophor und PDA, welche die Grundlage des Fühlmechanismus ist zu führen.

Serie: Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Forschung

Biologie

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

Langfristige letale Toxizität Test mit dem Krustentier Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

FRET-Mikroskopie zur Echtzeit-Überwachung der Signalisierung Events in lebenden Zellen mit unimolekularen Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Mammalian cell-based in vitro assays have been widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but have been limited due to the high monetary and time costs of parallel sample preparation that are necessitated due to the destructive nature of firefly luciferase-based screening methods. This video describes the utilization of autonomously bioluminescent mammalian cells, which do not require the destructive addition of a luciferin substrate, as an inexpensive and facile method for monitoring the cytotoxic effects of a compound of interest. Mammalian cells stably expressing the full bacterial bioluminescence (luxCDABEfrp) gene cassette autonomously produce an optical signal that peaks at 490 nm without the addition of an expensive and possibly interfering luciferin substrate, excitation by an external energy source, or destruction of the sample that is traditionally performed during optical imaging procedures. This independence from external stimulation places the burden for maintaining the bioluminescent reaction solely on the cell, meaning that the resultant signal is only detected during active metabolism. This characteristic makes the lux-expressing cell line an excellent candidate for use as a biosentinel against cytotoxic effects because changes in bioluminescent production are indicative of adverse effects on cellular growth and metabolism. Similarly, the autonomous nature and lack of required sample destruction permits repeated imaging of the same sample in real-time throughout the period of toxicant exposure and can be performed across multiple samples using existing imaging equipment in an automated fashion.

Mammalian cells expressing the bacterial bioluminescence gene cassette (lux) produce light autonomously. The resulting bioluminescent dynamics upon chemical exposure have been demonstrated to reflect the treatment effects on cellular growth and metabolism, making these cells an inexpensive, continuous, real-time toxicity screening tool that can easily be adapted for high-throughput automation.

Autonom Bioluminescent Säugerzellen für die kontinuierliche und Echtzeit-Überwachung von Zytotoxizität

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen Mit Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

Echtzeit-Messungen von Membranprotein: Rezeptor-Wechselwirkungen Mit Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

Sonde-basierte Echtzeit-PCR Ansätze zur quantitativen Messung von microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

Der Nachweis von intrazellulären Genexpression in lebenden Zellen der Maus, Mensch und Schwein Origin Mit Fluoreszenz-markierter Nanopartikel

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

Echtzeit-Imaging von Plant Cell Oberflächen Dynamics mit variabler Winkel Epifluoreszenzmikroskopie

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon its autophosphorylation on Thr288. AURKA abundance peaks in mitosis, where it controls the stability and the fidelity of the mitotic spindle, and the overall efficiency of mitosis. Although well characterized at the structural level, a consistent monitoring of the activation of AURKA throughout the cell cycle is lacking. A possible solution consists in using genetically-encoded F&#246;rster&#8217;s Resonance Energy Transfer (FRET) biosensors to gain insight into the autophosphorylation of AURKA with sufficient spatiotemporal resolution. Here, we describe a protocol to engineer FRET biosensors detecting Thr288 autophosphorylation, and how to follow this modification during mitosis. First, we provide an overview of possible donor/acceptor FRET pairs, and we show possible cloning and insertion methods of AURKA FRET biosensors in mammalian cells. Then, we provide a step-by-step analysis for rapid FRET measurements by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) on a custom-built setup. However, this protocol is also applicable to alternative commercial solutions available. We conclude by considering the most appropriate FRET controls for an AURKA-based biosensor, and by highlighting potential future improvements to further increase the sensitivity of this tool.

The activation of the multifunctional Ser/Thr kinase AURKA is hallmarked by its autophosphorylation on Thr288. Fluorescent probes relying on FRET can discriminate between its inactive and activated states. Here, we illustrate some strategies for probe engineering, together with a rapid FRET protocol to follow the kinase activation throughout mitosis.

Echtzeitüberwachung der Aktivierung der Aurora-Kinase A mit konformationellen FRET-Biosensoren in lebenden Zellen

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...