Name: propagation of homalodisca coagulata virus-01 via homalodisca vitripennis cell culture
Uploaded: 2014-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture at JoVE.com

We would like to thank the Texas Pierce&#8217;s Disease Research and Education Program and USDA-APHIS for their funding support for this project. We would also like to thank Hema Kothari at the University of Texas Health Science Center at Tyler for her assistance with confocal microscopy.

1. Zellkultur HINWEIS: Homalodisca vitripennis von der Dr. Wayne Hunter Labor an der USDA Agricultural Research Service (. Ft Pierce, FL USA) etablierten Zelllinien wurden verwendet, um einem Labor stock gemischten Zellstadien einschließlich Anfangs Fibroblasten und Monoschichten zu initiieren. <ol><li> Führen Sie die folgenden Verfahren in einer sterilen Laborumgebung in einem Temperaturbereich von 20-24 ° C mit 25 cm 2 Kulturflaschen gehalten. </li><li> Kultivieren und Kulturen mit H2G + Leafhopper Medium, eine modifizierte WH2 Honigbiene Medien 10 (Tabelle 1) zu halten in 25 cm 2 Zellkulturflaschen. </li><li> Kulturkolben inkubieren bei 24 ° C mit ~ 53% Luftfeuchtigkeit. </li><li> Verwenden Sie einen umgekehrten Mikroskop bei einer Gesamtvergrößerung (TM) von 100X zu Kultur Wachstum zu überwachen, zB auf eventuelle abnorme Zellwachstum überwachen für eventuelle Verunreinigungen und prüfen Wachstum Fortschritte in der Sackgassetur Oberfläche. </li><li> Führen Sie eine vollständige Mediumwechsel (~ 4 ml Kulturmedium pro Kolben) alle 7 - 10 Tagen, ohne die Kulturfläche zu stören. </li><li> Kulturen passieren, wenn das Kulturfläche von etwa 80% des Zellwachstums (konfluent) unter Verwendung von 0,25% Trypsin enthält, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), um Zellen zu dissoziieren bedeckt. Fügen ~ 2 - 3 ml Trypsin zu jeder Kulturflasche und setzen Kultur (en) für das Enzym für kurze Zeit (5 - 10 min), um eine vollständige Zell-Dissoziation zu erzielen. </li><li> Füge eine gleiche Menge an frischem Medium zu dem Kulturgefäß (en) (~ 2 - 3 ml) auf die Enzymaktivität zu stoppen und übertragen die gesamte Lösung in ein konisches Rohr zum Zentrifugieren. </li><li> Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 4 ° C für 6 min bei 350 x g beträgt. </li><li> Überstand entfernen, ohne das Zellpellet zu stören und fügen ~ 8 ml frisches Medium zu jedem Röhrchen. Sanft homogenisieren Zellen mit einer Pipette. </li><li> Split Kulturen bei einem 1: 2-Verhältnis von 25 cm 2-Kolben (ca. 4 ml Zell solutiauf pro Kolben) und lassen frisch geleitet Kulturen ungestört für 48 Stunden, sodass die Zellen in Suspension zu fest an der Oberfläche des Kolbens verbinden. HINWEIS: Die Kultivierung der Zellen in 48-Well-Gewebekulturplatten mit sterilen mit einer Wachstumsfläche von 1 cm 2 ist ebenfalls möglich, und sie können in der gleichen Weise wie Kulturflaschen mit einer Verringerung des Volumens des Kulturmediums auf ~ 250 ul gehalten werden. </li></ol> 2. Ganzvirus-Extraktion <ol><li> Homogenisieren ganzen Körper des Virus positive H. vitripennis in Phosphatpuffer, pH ~ 7,2, mit 0,02% Natrium-Trihydrat (DETCA) durch Vortexen für ~ 10 Sekunden-Intervallen, bis es keine weitere große Klumpen von Gewebe vorliegen. Extrahieren Virus durch Super Zentrifugation bei 124.500 xg für 4 h bei 4 ° C oder 22.000 × g für 16 h bei 4 ° C ist. Wenn ein Niederschlag bildet an der Spitze, entfernen Sie sie mit einem sterilen Wattestäbchen 11. </li><li> Überstand verwerfen. </li><li> Sammeln Sie die Pellet-undAuflösen mit 5 ml 10 mM Phosphatpuffer (kein DETCA), pH ~ 7,2, die 0,4% Na-Desoxycholsäure und 4% Polyethylenglykol Hexadecylether (Brij 52). <ol><li> Um das Pellet gut mischen, entfernen Sie das Pellet von der Seite der Röhre und zerquetschen, bis in der Lösung, wenn nötig. </li><li> Noch 10 mM Phosphat-Puffer in ~ 5 ml-Schritten zu helfen, das Pellet in Lösung gehen, wenn nötig und kombinieren in 2 Röhren 11. </li></ol></li><li> Zentrifugieren Sie die Lösung bei 300 g für 15 min 11. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und die heiße Lösung durch einen 0,45-um-Filter, und das Filtrat in großen Sammelrohr 11. </li><li> Übertragungs Filtrat einer Dialysemembran mit einer Molekulargewichtstrenngrenze (MWCO) von 3,5 kD, mit kleinen Mengen von 10 mM Phosphatpuffer (pH 7) nicht enthält, wenn nötig DETCA 11. </li><li> Platzieren der Dialysemembran in ein großes Becherglas mit ddH 2 O bei 4 ° C gefüllt. Ändern Sie die ddH2O jede Stunde foder 5 - 6 Stunden, bis sich ein weißer Niederschlag bildet in der Membran 11. </li><li> Sammeln des gereinigten Virus in der Membran und unterziehen die 100% Virus-Lösung zu einer 10-fachen Verdünnungsreihe durch Zugabe von 10 ul der Lösung zu 90 ul ddH 2 O. Anschließend weitere 90 ul ddH2O hinzufügen 10 ul der Verdünnung bis zu einer Verdünnung von 1: 100.000. </li><li> Shop-Virus-Lösung bei -80 ° C. </li></ol> 3. Virusreplikation <ol><li> Samenzellen in 48-Well-Kulturplatten wachsen, bis alle Zeilen Zellwachstum beträgt 80% konfluent (etwa 72 Stunden nach der Pass, wenn Zellen mit einer durchschnittlichen Rate wächst). </li><li> Impfen jede Zeile von Zellen mit der Serien verdünnten Virus einmal das Zellwachstum erreicht Konfluenz, dh eine Zeile einer Verdünnung von 1:10, eine Zeile einer 1: 100 Verdünnung, usw., mit Ausnahme der oberen Reihe. Verwenden Sie die obere Reihe als Kontrolle und fügen Sie 10 ul ddH 2 O in jede Vertiefung als Lautstärkeregler. <ol><li> Um eine Ausgangsbasis erhoben Zellkonzentration für den Vergleich mit experimentellen Zellzahl vor der ersten Impfung aller Brunnen in den Kulturen mit dem Virus zu schaffen, distanzieren und zählen Sie die erste gut jeder Zeile. </li></ol></li><li> Überwachen Kulturplatten alle 24 h nach der Virusimpfung für eine Farbänderung in dem Medium, das eine pH-Veränderung und Änderung in der Zellmorphologie. </li><li> Bild einer Spalte der Testplatte zu jedem Zeitpunkt, mit einem inversen Mikroskop bei 100-facher TM. </li><li> Entfernen Sie alle Medium aus der Spalte, die bei jedem 24-Stunden-Zeitpunkt abgebildet wurde und speichern sie kurzfristig bei -20 ° C für die RNA-Extraktion und Quantifizierung viraler oder langfristig bei -80 ° C. </li><li> Distanzieren Zellen aus den Vertiefungen nach der Entfernung des Mediums, wie zuvor beschrieben, in den Schritten 1.6 - 1.9 mit nur ~ 250 ul 0,25% Trypsin-EDTA und frisches Medium, um die Enzymaktivität und ~ 250 ul frisches Medium zu stoppen zum Resuspendieren der Zell Pellet. </li><li> Fügen Sie 10 ul von 0,4% Trypanblau-Färbung zu jedem Röhrchen mit Zellen zu Zellzahlen nach der Zell Dissoziation für jeden Zeitraum von 24 h über eine Woche durchzuführen. Ermöglichen Fleck für 10 min, bevor Zellzahlen zu sitzen. <ol><li> Führen Zellzahlen innerhalb 1 h der Exposition gegenüber Flecken oder lebensfähige Zellen zu färben beginnt und nicht lebensfähigen Zellen Aufnahme. </li></ol></li><li> Langsam 10 ul der gefärbten Zelllösung zu jeder Seite eines Standard-Hämozytometer unter Verwendung einer Mikropipette. Lassen Sie die Lösung durch Kapillarwirkung aufgenommen werden, um Luftblasen zu vermeiden. </li><li> Zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen (nicht fleckig) Zellen auf beiden Seiten der Zählkammer (das Äquivalent von 4 zählt der 16 Plätze in der Zählkammer). Führen Zellzahlen für jede Vertiefung der Spalte, die entfernt wurde. </li><li> Der Mittelwert der Zellzahlen aus jeder Spalte und verwenden Sie die folgende Formel, um die Gesamtzellzahl-Nummer zu erhalten: (Anzahl der Zellen / 4) x Verdünnungsfaktor = Anzahl der Zellen x 10 <sup&gt; 4 ml. Dies ist die Zelldichte oder die Anzahl der lebensfähigen Zellen in der Kultur. </li></ol> 4. Virus Extraktion aus Zellkultur <ol><li> Entfernen behandelt H. vitripennis Zellen aus Kulturflaschen wie zuvor in den Schritten 1.6 beschrieben - 1.8, mit nur ~ 250 ul von 0,25% Trypsin-EDTA und frisches Medium, um die Enzymaktivität zu stoppen. </li><li> Überstand verwerfen. </li><li> Auszug Virus von Kulturzellen nach dem Protokoll zuvor in Schritten 2.3 - 2.8. </li></ol> 5. RNA-Extraktion <ol><li> Extrahieren von RNA aus Proben, die während jedes Medium eine Woche Virus Versuch unter Verwendung eines Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion für flüssige Proben nach Herstellerprotokoll, gesammelt. </li><li> Speicher extrahierten Proben bei -80 ° C. </li></ol> 6. RT-PCR <ol><li> Virus etablieren Standards für RT-PCR, indem Sie traditionelle PCR unter Verwendung derPrimerpaar HoCV RT-PCR-Primer 1 (vorwärts 5&#39;-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 &#39;, 5&#39;-Reverse ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3&#39;), mit einem Virus zu isolieren, aus ganzen Körper H. vitripennis. </li><li> Gegenstand PCR-Produkts einer Elektrophorese für 60 min in einer 2% igen Agarose-Gel, enthaltend 0,1% Ethidiumbromid-Gel bei 120 V. </li><li> Auszuschneiden die Bands aus dem Gel und reinigt mit einem Gel-Extraktions-Kits nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Pool alle ausgeschnitten und aufgereinigt Produkt weiter zu reinigen und durch Grundethanolfällung. Zugeben und das Fällungsprodukt in etwa 30 ul Tris EDTA (TE), um die Gesamtprobenkonzentration zu erhöhen. </li><li> Quantifizierung der Ebene der cDNA in gepoolten Proben über Spektrophotometrie mit 260/230 Wellenlänge Einstellungen für Nukleinsäure-Nachweis. </li><li> Führen Sie eine zehnfache Verdünnungsreihe des gereinigten Probe von 57 ng / ul bis 57 ag / ul (10 -18). Führen die Verdünnungs ähnlich der beschriebenen in 2,8 Anpassungen für den Unterschied in der Konzentration Anforderungen gestellt. </li><li> Bestimmen Nachweisgrenzen der Verdünnungsreihe, indem qRT-PCR unter Verwendung eines qRT-PCR-Kit mit zuverlässige Quantifizierung von Low-Fülle-Transkripte. HINWEIS: Viral-Konzentrationen von weniger als 5 x 10 -3 Kopien sind nicht nachweisbar. </li><li> Extrahieren von RNA aus Versuchsproben, wie zuvor in Schritt 5.1 beschrieben und quantifiziert unter Verwendung von Spektrophotometrie analysiert. </li><li> Normalisieren alle extrahierten Proben bis 5 ng / ul mit Nuklease freiem Wasser. </li><li> Führen qRT-PCR bei allen Proben, in Dubletten, 25 ul Reaktionen mit Hilfe eines Ein-Schritt-qRT-PCR-Kit mit der Fähigkeit zu einer geringen Kopienzahl spüren wie folgt: 50 ° C zu halten für 10 min; 95 ° C halten für 5 min; 30 Zyklen von 95 ° C für 10 sec, 60 ° C für 30 sec; schmelzen 50-99 ° C für 5 s auf jedem Schritt. <ol><li> Machen Sie den Master-Mix, so dass jeder Reaktionsgemisch enthält 12,5 ul 1x Master-Mix, 1,0 ul (0,3 uM) von Vorwärts-Primer, 1,0 ul (0,3 uM) der Reverse-Primer, 0,25 ul der reversen Transkriptase und variable Mengen an Template auf Basis von Standardisierung Werte. </li><li> Bringen die Gesamtreaktionsvolumen auf 25 ul mit RNase freiem Wasser. </li><li> Gehören fünf Standard-Konzentrationen in jedem PCR-Lauf mit den folgenden Kopienzahl: 5 x 10 -10, 5 x 10 -8, 5 x 10 -6, 5 x 10 -4 und 5 x 10 -2 Exemplaren. Die Schwelle für jeden Durchgang, um nur unter einem Fluoreszenz von -2,5 bis 10x Rauschen während frühen Erwerb zu Beginn jedes Durchlaufs zu verringern. </li></ol></li></ol> 7. konfokale Mikroskopie <ol><li> Wachsen Homalodisca vitripennis Zellen in einem zwölf Well-Platte mit Deckgläschen Mess 18 mm Durchmesser in jede Vertiefung. </li><li> Beimpfen von einer Spalte auf der Platte alle 24 Stunden für einen Zeitraum von vier Tagen, wenn eine Monoschicht erreicht wird. Sicherzustellen, dass jedes cPALTE auch eine Steuer, eine niedrige Virusverdünnung (1:10) gut und eine hohe Virusverdünnung (1: 100.000) gut. Verwenden von Schritt 2.8 erhalten Virus-Lösungen. </li><li> Entfernen Sie alle Medien auf dem fünften Tag und waschen die Zellen zweimal mit 1x PBS (pH 7,4). </li><li> Fixierung der Zellen mit kaltem 4% Paraformaldehyd bei 4 ° C für 30 min. </li><li> Gib 500 ul 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) zu den Zellen und waschen sie für 10 min bei RT auf einem Schüttler bei niedriger Geschwindigkeit. Dreimal Waschen Sie die Zellen. </li><li> Gib 500 ul 0,1% Triton X-100 zu den Zellen, um sie zu permeabilisieren. Lassen Sie sich für 10 min bei RT. </li><li> Wasche die Zellen erneut, wie zuvor in Schritt 7.5 beschrieben. </li><li> Gib 500 ul einer 5% Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung zu den Zellen bei RT blockieren. Lassen Sie sitzen für 2 Stunden und dann zu entfernen. </li><li> Verdünnen Lager Rhodamin rot-Phalloidin (RCP) 1: 250 in 1x PBS mit 5% BSA und 250 ul der Verdünnung auf jeweils gut Färbung für F-Aktin. </li><li> Abdeckplatte aus Aluminium fÖl, um den Farbstoff aus Bleich verhindern und Inkubation Zellen bei 4 ° CO / N. </li><li> Entfernen Sie die RCP nach 12 h Inkubation und ersetzen Sie es mit 250 ul 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) (250 ug / ml) in 1x PBS mit 5% BSA, um die Kerne der Zellen zu färben . </li><li> Inkubieren der Zellen mit DAPI bei RT für 1 Stunde. </li><li> Waschen Zellen dreimal mit 1x PBS wie zuvor in Schritt 7.5 beschrieben. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Deckgläser aus den Vertiefungen und montieren auf Objektträger mit einer Montage Medien mit einer Anti-Fade Reagenz. </li><li> Die Objektträger trocknen in lichtdichten Kästen, bis unter dem konfokalen Mikroskop betrachtet. Ansicht Präparate so bald wie möglich als Farbstoffe schnell verblassen. </li><li> Bild gefärbten Zellen mit einem konfokalen System mit einem Mikroskop, das eine 63X (Öl) Plan-apochromate Objektiv ausgestattet. <ol><li> Stellen Sie die Laserwellenlängen um 543 ± 10 nm Anregung und 575 ± 10 nm Emissions für Rhoadmine rot-conjucated Phalloidin, Und 369 ± 10 nm Anregung und 450 ± 30 nm Emissions für DAPI. </li><li> Identische Verstärkung und Offset-Einstellungen für den Detektor, um alle Bilder zu erhalten. </li><li> Prozessbilder mit Hilfe geeigneter Software für die Bildverarbeitung und Sortierung und Import gewünschten Bilder in eine Bildverwaltungssoftware. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Steigende Besorgnis über den Zustrom von invasiven landwirtschaftlichen Arten haben zu einer erhöhten Nachfrage nach neuen Methoden, um gegen neue Schädlinge und Krankheitserreger zur Wehr zu führen. Ein Schwerpunkt der Krankheitsprävention und-Management umfasst die Verwaltung von Vektoren und Krankheitserreger war das primäre Ziel dieser Studie. Wirtschaft spielen eine wichtige Rolle bei der Entscheidung, diese Art von Erreger zu Biopestizid Vektoren in der Landwirtschaft verwalten, weil die praktische Anwendung...

Die glasartige Flügelscharfschütze (Homalodisca vitripennis Germar 1821) hat als vorherrschende Vektor Xylella fastidiosa (X. fastidiosa) in Nordamerika 1 identifiziert worden, die Erreger der Pierce-Krankheit der Weinrebe (PD). Insektenpopulation Management hat sich schnell zum Mittelpunkt der Forschung werden in Kalifornien und über den Süden der Vereinigten Staaten gegen diese verheerende Problem für den Weinbau Industrie. Ein positiv Sinn, Einzelstrang-RNA-Virus aus der Familie Dicistroviridae, Homalodisca coagulata Virus-01 (HoCV-01) bei Wild H. identifiziert vitripennis Bevölkerung und gezeigt, dass die Sterblichkeit in diesen Bevölkerungsgruppen 2-4 zu erhöhen, bei gleichzeitiger Senkung des Insekts Widerstand gegen Insektizide. Entwicklung von Methoden, um effektiv hinten infiziert H. vitripennis in einer Laborumgebung Erwachsenenalter schwierig gewesen, weil <em&gt; H. vitripennis unterschiedliche Phase-spezifische Ernährungsbedürfnisse, die eine Vielzahl von Wirtspflanzen 5-8 erfordern. Spezifische Ausstattung und hinten Live H. erforderlich vitripennis in den Vereinigten Staaten; Daher ist die Zellkultur kostengünstiger und eine praktikable Alternative sowie zunehmend wichtig für HoCV-01-Erkennung und Replikation 2,9. Während die grundlegenden Methoden zur Festlegung von Zellkulturen von H. vitripennis beschrieben sind diese Verfahren noch nicht für eine kommerzielle Produktion von biologischen Bekämpfungsmittel verwendet worden, wie beispielsweise Viren 2. Das übergeordnete Ziel der folgenden Verfahren ist es, eine hohe Konzentration von HoCV-01 eignet sich für den Einsatz als biologische Bekämpfungsmittel zu produzieren. Virale Replikation erfordert eine lebende Zelle, weshalb erfolgreich zu kultivieren und zu optimieren H. vitripennis Kulturen ist von entscheidender Bedeutung für den Fortschritt der Herstellung eine gewinnbringende Virus.

<table><tbody><tr><td>Corning cell culture flasks</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430168</td><td>Surface area 25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;, canted neck, cap (plug seal)</td></tr><tr><td>Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71</td><td>Olympus</td><td></td><td>Inverted microscope and camera</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4049</td><td>0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA &amp;bull; 4Na per liter of Hanks&amp;prime; Balanced Salt Solution with phenol red</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR multiwell culture plates</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8937</td><td>48 wells (TC treated with lid)</td></tr><tr><td>DETCA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>228680</td><td>Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate</td></tr><tr><td>Corning bottle-top vacuum filter system</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS431206</td><td>Cellulose acetate membrane, pore size 0.45 &amp;mu;m, membrane area 54.5 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;, filter capacity 500 ml</td></tr><tr><td>Brij 52</td><td>Sigma Aldrich</td><td>388831</td><td>Polyethylene glycol hexadecyl ether</td></tr><tr><td>Phosphate buffer solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5244</td><td>Received as 100 mM diluted to 10 mM with sterile water</td></tr><tr><td>TRIzol LS</td><td>Life Technologies</td><td>10296-028</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5304</td><td>For electrophoresis</td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7637</td><td>BioReagent, for molecular biology, powder</td></tr><tr><td>QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect qRT-PCR kit</td><td>Qiagen</td><td>204243</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Reagent grade, crystalline</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368</td><td>Phosphate buffered saline</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine red-conjugated phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>R415</td><td>Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>LSM510 Meta Confocal System</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM Zen 2007 Software</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grace&amp;rsquo;s Insect medium (supplemented, 1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8142</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>L-histidine monohydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8125</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>Medium 199 (10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4530</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>Medium 1066 (1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0422</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Balanced Salts (1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51322C</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>L-Glutamine (100x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G3126</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>MEM, amino acid mix (50x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56419C</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>1 M MgCl solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>Pen-Strep (w/ glutamine)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G6784</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N6261</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46305</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9434</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr></tbody></table>

propagation of homalodisca coagulata virus-01 via homalodisca vitripennis cell culture

Die glasartige Flügelscharfschütze (Homalodisca vitripennis) ist ein hoch vagile und polyphagen Insekten gesamten Südwesten der Vereinigten Staaten gefunden. Diese Insekten sind die vorherrschenden Vektoren Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), eine Xylem-Bakterium, das begrenzt die Erreger der Pierce-Krankheit (PD) der Weinrebe ist. Pierce-Krankheit ist wirtschaftlich schädlich; damit, H. vitripennis haben ein Ziel für Erreger-Management-Strategien geworden. Ein dicistrovirus als Homalodisca coagulata Virus-01 (HoCV-01) identifiziert, mit einer erhöhten Mortalität in Verbindung gebracht H. vitripennis Populationen. Da eine Wirtszelle für HoCV-01-Replikation benötigt, stellt der Zellkultur eine gleichförmige Umgebung für die gezielte Replikation logistisch und Biopestizid Produktion wirtschaftlich wertvoll ist. In dieser Studie wurde ein System für großflächige Ausbreitung von H. vitripennis Zellen durch Gewebekultur entwickelt, providing einen viralen Replikationsmechanismus. HoCV-01 wurde aus den ganzen Körper Insekten extrahiert und verwendet, um kultivierte H. inokulieren vitripennis Zellen auf verschiedenen Ebenen. Das Kulturmedium wurde alle 24 h für 168 h, RNA extrahiert und mit qRT-PCR analysiert entfernt. Die Zellen wurden mit Trypanblau gefärbt und gezählt, um die Überlebensfähigkeit Zelle quantifizieren mittels Lichtmikroskopie. Ganzvirus-Partikel wurden bis zu 96 Stunden nach der Infektion, die das bestimmt zu sein, bevor die Gesamtzellkultur Zusammenbruch aufgetreten Zeitpunkt war extrahiert. Die Zellen wurden auch Fluoreszenzfärbung unterzogen und unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie, um virale Aktivität auf F-Actin-Bindung und Kerne Integrität zu untersuchen. Das Fazit dieser Studie ist, dass H. vitripennis Zellen, die kultiviert und zur Massenproduktion von HoCV-01 auf einen geeigneten Pegel zur Herstellung eines Biopestizids ermöglichen.

Zellwachstums wurde innerhalb von 48 h Durchgang in kleinen und großen Kulturflaschen aus Primärkulturen und setzte Passagen gesehen. Fibroblasten-Wachstum und die Entwicklung wurde auch innerhalb dieses Zeitrahmens beobachtet. Wenn neu ausgesät Kolben wurden vor 48 Stunden gestört, gab es eine sichtbare Rückgang der Zellhaftung, was zu langsameren wachsenden Kulturen und manchmal keine Bindung oder das Wachstum überhaupt. Zellen wurden etwa 80% konfluente innerhalb einer Woche nach der Übergabe und eine Monoschi...

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Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Hier präsentieren wir ein Protokoll zu Homalodisca vitripennis Zellen und HoCV-1 in vitro zu propagieren. Medium wurde von HoCV-1-positiven Kulturen entfernt und RNA extrahiert alle 24 h für 168 Stunden. Zelllebensfähigkeit wurde durch Trypanblau-Färbung quantifiziert. Gesamtvirus-Partikel wurden nach der Infektion extrahiert. Extrahierte RNA wurde durch qRT-PCR quantifiziert.

Ausbreitung von<em&gt; Homalodisca coagulata Virus-01</em&gt; Über<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Zellkultur

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

propagation-homalodisca-coagulata-virus-01-via-homalodisca

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

11.7K Aufrufe.  University of Texas at Tyler.  Hier präsentieren wir ein Protokoll zu Homalodisca vitripennis Zellen und HoCV-1 in vitro zu propagieren. Medium wurde von HoCV-1-positiven Kulturen entfernt und RNA extrahiert alle 24 h für 168 Stunden. Zelllebensfähigkeit wurde durch Trypanblau-Färbung quantifiziert. Gesamtvirus-Partikel wurden nach der Infektion extrahiert. Extrahierte RNA wurde durch qRT-PCR quantifiziert. 

Serie: Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Nachweis von infektiösen Viren aus Field-gesammelt Moskitos von Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Influenza Virus Vermehrung in embryonierten Hühnereiern

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

Eine einfache und effiziente Methode zu konstruieren Mutant Vacciniavirusvektoren

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction analysis. One particular method to achieve this conditional deletion is via the use of the Cre-loxP system. This method involves flanking the gene of interest with loxP sites, which are specific recognition sequences for the Cre recombinase protein. Exposure of the so-called floxed (flanked by loxP site) DNA to this enzyme results in a Cre-mediated recombination event at the loxP sites, and subsequent excision of the intervening gene3. Several different methods exist to administer Cre recombinase to the site of interest. In this video, we demonstrate the use of an adenovirus containing the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) obtained from embryos containing a floxed Rac1 allele1. Our rationale for selecting Rac1 MEFs for our experiments is that clear morphological changes can be seen upon deletion of Rac1, due to alterations in the actin cytoskeleton2,5. 72 hours following viral transduction and Cre expression, cells were stained using the actin dye phalloidin and imaged using confocal laser scanning microscopy. It was observed that MEFs which had been exposed to the adeno-Cre virus appeared contracted and elongated in morphology compared to uninfected cells, consistent with previous reports2,5. The adenovirus method of Cre recombinase delivery is advantageous as the adeno-Cre virus is easily available, and gene deletion via Cre in nearly 100% of the cells can be achieved with optimized adenoviral infection.

In this video we use an adenovirus carrying the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts carrying a floxed Rac1 allele.

Adenovirus-vermittelte genetische Entfernung von Signalmolekülen in kultivierten primären embryonalen Maus-Fibroblasten

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Biologie

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.

Generierung von rekombinanten aviären Herpesvirus Vektoren mit CRISPR/Cas9 gen bearbeiten

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our knowledge of prevention and treatment of viral infection. The fruit fly Drosophila melanogaster has proven to be one of the most efficient and productive model organisms to screen for antiviral factors and investigate virus-host interaction, due to powerful genetic tools and highly conserved innate immune signaling pathways. The procedure described here demonstrates a nano-injection method to establish viral infection and induce systemic antiviral responses in adult flies. The precise control of the viral injection dose in this method enables high experimental reproducibility. Protocols described in this study include the preparation of flies and the virus, the injection method, survival rate analysis, the virus load measurement, and an antiviral pathway assessment. The influence effects of viral infection by the flies' background were mentioned here. This infection method is easy to perform and quantitatively repeatable; it can be applied to screen for host/viral factors involved in virus-host interaction and to dissect the crosstalk between innate immune signaling and other biological pathways in response to viral infection.

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

This protocol describes how to establish viral infection in vivo in Drosophila melanogaster using the nano-injection method and basic techniques to analyze virus-host interaction.

Gründung der Virusinfektion und Analyse von Host-Virus-Wechselwirkung in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious public health issues and suggest the possibility of an epidemic. However, our molecular understanding of the virus is rudimentary, and it is necessary to study the biological properties of its envelope proteins as therapeutic targets and to develop strategies to control infection. We developed a solid viral pseudotyped particle (pp) platform to study avian influenza virus, including the functional analysis of its hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) envelope glycoproteins, the reassortment characteristics of the HAs and NAs, receptors, tropisms, neutralizing antibodies, diagnosis, infectivity, for the purposes of drug development and vaccine design. Here, we describe an experimental procedure to establish pps with the envelope glycoproteins (HA, NA) from two influenza A strains (HAPI H5N1 and 2013 avian H7N9). Their generation is based on the capacity of some viruses, such as murine leukemia virus (MLV), to incorporate envelope glycoproteins into a pp. In addition, we also detail how these pps are quantified with RT-qPCR, and the infectivity detection of native and mismatched virus pps depending on the origin of the HAs and NAs. This system is highly flexible and adaptable and can be used to establish viral pps with envelope glycoproteins that can be incorporated in any other type of enveloped virus. Thus, this viral particle platform can be used to study wild viruses in many research investigations.

This protocol describes an experimental process to produce high-titer infectious viral pseudotyped particles (pp) with envelope glycoproteins from two influenza A strains and how to determine their infectivity. This protocol is highly adaptable to develop pps of any other type of enveloped viruses with different envelope glycoproteins.

Herstellung von hochtiterinfektiösen Influenza-Pseudotyppartikeln mit Hülllykoproteinen aus hoch pathogenen H5N1- und Avian H7N9-Viren

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks

Hepatitis E virus is the leading cause of liver cirrhosis and liver failure with increasing prevalence worldwide. The single-stranded RNA virus is predominantly transmitted by blood transfusions, inadequate sanitary conditions and contaminated food products. To date the off-label drug ribavirin (RBV) is the treatment of choice for many patients. Nonetheless, a specific HEV treatment remains to be identified. So far, the knowledge about the HEV life cycle and pathogenesis has been severely hampered because of the lack of an efficient HEV cell culture system. A robust cell culture system is essential for the study of the viral life cycle which also includes the viral pathogenesis. With the method described here one can produce viral titers of up to 3 x 106 focus forming unit/mL (FFU/mL) of non-enveloped HEV and up to 5 x 104 FFU/mL of enveloped HEV. Using these particles, it is possible to infect a variety of cells of diverse origins including primary cells and human, as well as animal cell lines. The production of infectious HEV particles from plasmids poses an infinite source, which makes this protocol exceedingly efficient.

Described here is an effective method on how to produce high viral titer stocks of hepatitis E virus (HEV) to efficiently infect hepatoma cells. With the presented method, both non-enveloped, as well as enveloped viral particles can be harvested and used for inoculating various cell lines.

Ein Zellkulturmodell zur Herstellung von Hepatitis-E-Virus-Beständen mit hohem Titer

Hepatitis E virus is the leading cause of liver cirrhosis and liver failure with increasing prevalence worldwide. The single-stranded RNA virus is ...

Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two main categories of these new mosquito-associated viruses are &#34;mosquito-borne viruses (MBVs)&#34; and &#34;mosquito-specific viruses (MSVs)&#34;. These novel viruses might be pathogenic to both vertebrates and mosquitoes, or they could just be symbiotic with mosquitoes. Entity viruses are essential to confirm the biological characters of these viruses. Thus, a detailed protocol has been described here for virus isolation and amplification from field-collected mosquitoes. First, the mosquito samples were prepared as supernatants of mosquito homogenates. After centrifugation twice, the supernatants were then inoculated into either mosquito cell line C6/36 or vertebrate cell line BHK-21 for virus amplification. After 7 days, the supernatants were collected as the P1 supernatants and stored at -80 &#176;C. Next, P1 supernatants were passaged twice more in C6/36 or BHK-21 cells while the cell status was being checked daily. When cytopathogenic effect (CPE) on the cells was discovered, these supernatants were collected and used to identify viruses. This protocol serves as the foundation for future research on mosquito-associated viruses, including MBVs and MSVs.

Numerous novel virus-like sequences have been found in mosquitoes due to the extensive use of sequencing technologies. We provide an effective procedure for isolating and amplifying viruses using vertebrate and mosquito cell lines, which might serve as the basis for future studies on mosquito-associated viruses, including mosquito-borne and mosquito-specific viruses.

Mückenassoziierte Virusisolierung aus im Feld gesammelten Stechmücken

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two ...

Cellular Impedance-Based Survival Kinetics Assay to Assess Virus Survival

Source: Labadie, T. et al., <a href="https://app.jove.com/v/61133">Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video describes a cellular impedance-based technique to study the survival kinetics of viruses that induce cytopathic effects. The method measures the electrical impedance of virus-infected adherent cells pre-treated with saline.

Zellulärer impedanzbasierter Überlebenskinetik-Assay zur Beurteilung des Überlebens von Viren

Source: Labadie, T. et al., Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis. J. Vis. Exp. (2021).
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