Die Hepatitis-E-Virusforschung wurde durch das Fehlen eines effizienten Zellkultursystems behindert. Unsere Techniken überwinden diese Einschränkungen und ebnen den Weg für die Entwicklung von Arzneimitteln und die Entwicklung von Impfstoffen. Mit diesem Protokoll sind wir in der Lage, infektiöse High Titerviren von HEV-Partikeln ohne Hülle und Hüllkurve zu produzieren, was die Infektion einer Vielzahl von Zellen erleichtert.
Die Ausführung dieses Protokolls erfordert den Zugriff auf eine BSA-2-Einrichtung und Erfahrung mit grundlegenden Zellkulturtechniken. Um die Plasmid-DNA linearisieren, mischen Sie 10 Mikrogramm der Schablonen-DNA mit 10 Mikroliter Puffer und zwei Mikroliter des Micrococcus luteus-Restriktionsenzyms und passen Sie das Endvolumen auf 100 Mikroliter mit Wasser an. Dann inkubieren Sie die Lösung für eine Stunde bei 37 Grad Celsius und bestätigen Sie die Linearisierung des Plasmids durch Agarose-Gel-Elektrophorese nach Standardprotokollen.
Nach der Dna-Isolierung und Linearisierung von Plasmid kann der Erfolg der Linearisierung durch den Vergleich der nicht verdauten Plasmid-DNA mit der verdauten Plasmid-DNA durch Gelelektrophorese bestätigt werden. Mischen Sie für die In-vitro-Transkription der gereinigten, in voller Länge von Hepatitis E-Virus-DNA in voller Länge zwei Mikrogramm der linearisierten DNA-Schablone mit den entsprechenden Reagenzien und verwenden Sie kernfreies Wasser, um das Endvolumen der Lösung auf 100 Mikroliter zu bringen. Nach gründlichem Mischen die Lösung zwei Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Nach zwei Stunden weitere zwei Mikroliter T7-RNA-Polymerase in die Röhre geben. Dann mischen Sie die Reaktion und inkubieren Sie die Röhre bei 37 Grad Celsius für weitere zwei Stunden. Am Ende der Inkubation die erste DNA-Schablone mit 7,5 Mikroliter DNAs mit gründlicher Mischung verdauen und 30 Minuten lang für 37 Grad Celsius inkubieren.
Nach der Extraktion die RNA-Integrität und Ausbeute durch Agarose-Gel-Elektrophorese nach Standardprotokollen sorgfältig überprüfen. Bei niedriger RNA-Ababscheidung sind eher unterschiedliche Bänder als ein verschwommener Abstrich zu beobachten. Einige Schritte erfordern eine schnelle Ausführung und damit eine gründliche Vorbereitung.
Achten Sie auch besonders auf die RNA-Integrität und Zelllebensfähigkeit. Um menschliche Leberkrebszellen auf die Zellkultur-abgeleitete Hepatitis-E-Virusproduktion vorzubereiten, säen Sie die Zellen in 20 Millilitern vollständiger DMEM auf eine 15 Zentimeter kollagenbeschichtete Kulturschale und brüten bei 37 Grad Celsius, bis sie 90 % Konfluenz erreichen. Am Ende der Kultur waschen Sie die Zellen mit 10 MilliliterPBS, bevor Sie sie von der Zellkulturplatte mit drei Millilitern von 0,05%Trypsin-EDTA bei 37 Grad Celsius lösen.
Setzen Sie die abgetrennten Zellen in 10 Milliliter n. CHR. zurück und übertragen Sie die Zellen zum Zählen in ein 50 Milliliter konisches Rohr. Fünfmal 10 auf die sechs Zellen in ein neues 50-Milliliter-Rohr geben und die Zellen zweimal mit 35 MilliliterPBS pro Waschgang waschen. Nach der zweiten Wäsche die Zellen auf Eis legen, ohne den Überstand zu entfernen.
Für die Elektroporation der Zielzellen, ergänzen 384 Mikroliter Cytomix mit zwei Millimolar ATP und fünf Millimolar Glutathion, anschließend auf Eis bis zur weiteren Verwendung lagern. Ersetzen Sie den Überstand sorgfältig durch die gesamten 400 Mikroliter Lösung. Fügen Sie den Zellen fünf Mikrogramm gereinigter viraler genomischer RNA hinzu und übertragen Sie die Zellsuspension für die Elektroporation bei 975 Mikrofarad und 270 Volt für 20 Millisekunden auf eine Vier-Millimeter-Küvette.
Nach der Elektroporation verwenden Sie eine Pasteur Pipette, um die Zellen so schnell wie möglich in 11 Milliliter komplettes DMEM zu übertragen und 10 Milliliter der elektropoierten Zellen in eine 10-Zentimeter-Kulturschale zu geben, die mit Kollagen beschichtet ist. Als nächstes fügen Sie 1,3 mal 10 zu den fünften Zellen in 300 Mikroliter Medium gleichmäßig auf einen Deckel schlupf in einem Brunnen einer kollagenbeschichteten 24 Mikrotiterplatte und legen Sie die Platte und Schale in der Zellkultur-Inkubator für 24 Stunden. Am nächsten Tag den Überstand in der Schale durch 10 Milliliter frisches DMEM ersetzen und das Gericht für weitere sechs Tage in den Zellkultur-Inkubator zurückgeben.
Am fünften bis siebten Tag führen Sie je nach Zelldichte eine immunfluoreszierende Färbung der Transfektionskontrolle durch, um die Berechnung der Anzahl der Zellen zu ermöglichen, die das Zielprotein von Interesse ausdrücken, normalisiert auf die Gesamtzahl der Zellen. Erfolgreiche Elektroporation kann durch immunfluoreszierende Färbung der Transfektionskontrolle überwacht werden. Die Transfektionseffizienz sollte 40%A-Replikationsmangel mutant überschreiten kann als negative Kontrolle dienen, um die Spezifität der Färbung zu bestätigen.
Um extrazelluläre Zellkultur-abgeleitete Hepatitis-E-Viruspartikel zu ernten, filtern Sie am sechsten Tag den Überstand durch ein 0,45 Mikroliter-Netz, um Zellablagerungen zu entfernen und das geerntete extrazelluläre Zellkultur-abgeleitete Hepatitis-E-Virus bei vier Grad Celsius zu speichern. Für die intrazelluläre Zellkultur-abgeleitete Hepatitis-E-Virus-Partikelernte, waschen Zellen mit PBS und lösen Sie die Zellen mit 1,5 Milliliter von 0,05%Trypsin-EDTA bei 37 Grad Celsius. Wenn sich die Zellen gelöst haben, stoppen Sie die Reaktion mit 8,5 Milliliter DMEM und übertragen Sie die Zellsuspension zur Zentrifugation in ein 50-Milliliter-Rohr.
Fügen Sie 1,6 Milliliter DMEM-Gesamtmedium pro Elektroporation zu einzelnen zwei Milliliter-Reaktionsröhren hinzu und verwenden Sie 800 Mikroliter des Mediums, um die Zellen wieder aufzuhängen, wodurch die Zellen in die Röhren übertragen werden. Die Zellen in flüssigem Stickstoff einfrieren und anschließend die Zellen dreimal auf Eis auftauen, bevor die resultierenden Lysate 10 Minuten lang bei 10.000 mal g zentrifugiert werden. Dann die Überräube in neue Schläuche übertragen, ohne die Zellschuttpellets für minus 80 Grad Celsius Lagerung zu stören.
Um die Titter der neu produzierten intra- und extrazellulären Hepatitis-E-Virusbestände zu bewerten, samen Sie zweimal 10 bis 10 bis vier Zellen pro 100 Mikroliter MEM pro Brunnen in die 60 Mittelbrunnen einer kollagenbeschichteten 96-Well-Mikrotiterplatte und füllen die äußersten Brunnen mit 100 MikroliterN PBS pro Brunnen. Nach 24 Stunden bei 37 Grad Celsius 50 Mikroliter extrazellulärer Viruspartikelüberstand in die erste Zellreihe geben. Nach gründlicher Vermischung den Brunneninhalt sechsmal bei einer ein- bis drei Konzentration pro Brunnen durch Übertragung von 50 MikroliterN Überstand von der vorherigen in die nächste Zellreihe in Doppeltarbeit bis zur letzten Zellreihe verdünnen.
Um die Zellen mit intrazellulären Zellkultur-abgeleiteten Hepatitis-E-Viruspartikeln zu infizieren, fügen Sie 25 Mikroliter des intrazellulären Viruspartikelüberstandins in die obere Zellreihe ein und mischen Sie sich gut, bevor sie die Zellen sechsmal im Verhältnis eins zu fünf mit 25 Mikroliterverdünnung in Duplikat verdünnen. Legen Sie die Platte dann sieben Tage lang im Zellkultur-Inkubator auf, bevor Sie die immunfluoreszierende Färbung gemäß dem Protokoll im Manuskript erhalten. Nach inkubations- und Immunfärbung können die Platten mittels Immunfluoreszenzmikroskopie analysiert werden.
Nach der Immunfärbung kann der endliche Titer der intra- und extrazellulären Partikel mit der entsprechenden Formel wie angegeben berechnet werden. Nach der Zielzellinfektion mit zellkulturabgeleiteten E-Viruspartikeln durch serielle Verdünnung sind von den Zellkulturen, die mit den nicht umhüllten intrazellulären Hepatitis-E-Viruspartikeln infiziert sind, Tistern zwischen einem mal 10 bis zum fünften und dreimal 10 bis zu den sechs Fokusbildenden Einheiten pro Milliliter zu erwarten. In Kulturen, die mit umhüllten extrazellulären Zellkulturen infiziert sind, werden Tiellen zwischen einem Mal 10 bis zur Sekunde und ein mal 10 bis zum vierten Fokus bildende Einheiten pro Milliliter erwartet.
Darüber hinaus ist das Verhältnis zwischen Genomkopien und nicht umhüllten intrazellulären virusischen Partikeln in der Regel niedriger als bei extrazellulären Zellkulturen, die von Hepatitis-E-Virusinfizierten beobachtet wurden, was auf eine höhere spezifische Infektiosität der nicht umhüllten Hepatitis-E-Virusarten hindeutet. Die Produktion von viralen Partikeln und die Infektion mit Zielzellen erfordern einen vollständigen viralen Lebenszyklus und können neue Einblicke in Virus-Host-Interaktionen liefern. Dieses Protokoll kann geändert werden, um Replikationskinetik durchzuführen oder Partikel zu erzeugen, die in Infektionstests verwendet werden können.
Der größte Teil unserer Forschung hängt derzeit von infektiösen Partikeln ab, sowohl im umhüllten als auch im nicht umhüllten HEV. Und Artikel, die unsere Techniken verwenden, werden derzeit veröffentlicht.
