Name: propagation of homalodisca coagulata virus-01 via homalodisca vitripennis cell culture
Uploaded: 2014-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture at JoVE.com

We would like to thank the Texas Pierce&#8217;s Disease Research and Education Program and USDA-APHIS for their funding support for this project. We would also like to thank Hema Kothari at the University of Texas Health Science Center at Tyler for her assistance with confocal microscopy.

Cultura 1. cellulare NOTA: linee cellulari Homalodisca vitripennis stabiliti dal laboratorio Dr. Wayne Hunter presso l&#39;USDA Agricultural Research Service (. Ft Pierce, FL USA) sono stati utilizzati per avviare un magazzino laboratorio composto da fasi cellulari misti inclusi i fibroblasti ei monostrati iniziali. <ol><li> Eseguire le seguenti procedure in un ambiente di laboratorio sterile mantenuta ad una temperatura compresa tra 20-24 ° C con 25 cm 2 fiasche di coltura. </li><li> Coltivare e mantenere le culture in 25 cm 2 fiasche di coltura tissutale utilizzando H2G + Leafhopper medio, una versione modificata del supporto api WH2 10 (Tabella 1). </li><li> Incubare fiasche di coltura a 24 ° C con il ~ 53% di umidità. </li><li> Utilizzare un microscopio invertito a un ingrandimento totale (TM) di 100X per monitorare la crescita della cultura, ad esempio, controllare l&#39;eventuale crescita cellulare anormale, monitorare eventuali contaminanti potenziali, e verificare i progressi di crescita in tutto il culsuperficie tura. </li><li> Eseguire un cambiamento di terreno completo (~ 4 ml di terreno di coltura per bombola) ogni 7 - 10 giorni senza disturbare la superficie cultura. </li><li> Passare culture quando la superficie cultura è circa l&#39;80% coperto da crescita cellulare (confluente) con 0,25% di tripsina contenente acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per dissociare le cellule. Aggiungere ~ 2 - 3 ml di tripsina per ciascun pallone di coltura e di esporre la cultura (s) per l&#39;enzima per brevi periodi di tempo (5-10 minuti) per raggiungere dissociazione cellulare completo. </li><li> Aggiungere una quantità uguale di mezzo fresco al pallone di coltura (s) (~ 2 - 3 ml) per arrestare l&#39;attività enzimatica e trasferire l&#39;intera soluzione in una provetta per centrifuga. </li><li> Cellule pellet per centrifugazione a 4 ° C per 6 min a 350 x g. </li><li> Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet di cellule e aggiungere ~ 8 ml di terreno fresco ad ogni provetta. Omogeneizzare delicatamente cellule utilizzando una pipetta. </li><li> Culture Split in un rapporto 1: 2 per 25 centimetri 2 palloni (~ 4 ml di soluti cellularesu ogni pallone) e lasciare culture appena passati indisturbati per 48 ore per permettere le cellule in sospensione per fissare saldamente alla superficie del pallone. NOTA: La coltivazione di cellule in 48 pozzetti piastre di coltura tissutale sterili con una superficie di crescita di 1 cm 2 è anche possibile e che può essere mantenuta allo stesso modo come fiasche di coltura con una riduzione del volume di terreno di coltura per ~ 250 microlitri. </li></ol> 2 Estrazione Virus intero <ol><li> Omogeneizzare corpi interi di virus H. positivo vitripennis in tampone fosfato, pH ~ 7.2, con 0,02% di sodio triidrato dietilditiocarbamato (DETCA) di vortex per ~ intervalli di 10 sec fino a quando non ci sono più grandi ciuffi di tessuto presente. Estrarre virus via SuperSpeed ​​centrifugazione a 124.500 xg per 4 ore a 4 ° C o 22.000 xg per 16 ore a 4 ° C. Se si forma un precipitato nella parte superiore, rimuoverlo con un tampone di cotone sterile 11. </li><li> Eliminare il surnatante. </li><li> Raccogliere il pellet esciogliere con 5 ml di 10 mM tampone fosfato (senza DETCA), pH ~ 7,2, contenente lo 0,4% di acido Na-deoxycholic e 4% etere di glicole polietilenico esadecile (Brij 52). <ol><li> Mescolare bene il pellet, rimuovere il pellet dal lato del tubo e schiacciare fino in soluzione, se necessario. </li><li> Aggiungere più 10 mM tampone fosfato in ~ incrementi di 5 ml per aiutare il pellet va in soluzione, se necessario, e si combinano in 2 tubi 11. </li></ol></li><li> Centrifugare la soluzione a 300 xg per 15 min 11. </li><li> Rimuovere il surnatante e filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,45 micron, e raccogliere il filtrato in provetta grande collezione 11. </li><li> Trasferimento filtrato ad una membrana di dialisi con un peso molecolare tagliato (MWCO) di 3,5 kD, utilizzando piccole quantità di tampone fosfato 10 mM (pH 7) non contenente DETCA se necessario 11. </li><li> Posizionare la membrana di dialisi in un grande bicchiere pieno di DDH 2 O a 4 ° C. Modificare il DDH 2 O ogni ora fo 5-6 ore, fino a quando un bianco precipitato nella membrana 11. </li><li> Raccogliere il virus purificato dal di dentro la membrana e sottoporre la soluzione virus al 100% per una serie di diluizioni di 10 volte con l&#39;aggiunta di 10 ml di soluzione a 90 ml di DDH 2 O. Successivamente, aggiungere 10 ml della diluizione per altri 90 ml di DDH 2 O fino a raggiungere una diluizione di 1: 100.000. </li><li> Soluzione virus Conservare a -80 ° C. </li></ol> 3 replicazione virale <ol><li> Cellule seme in piastre di coltura 48 pozzetti e crescono tutte le righe fino a quando la crescita cellulare è di 80% confluenti (circa il post-passa 72 ore se le cellule stanno crescendo a un tasso medio). </li><li> Inoculare ciascuna riga di celle con il virus diluito seriale volta la crescita cellulare raggiunge la confluenza, cioè, una riga di una diluizione 1:10, una riga di una diluizione 1: 100, ecc, ad eccezione della fila superiore. Utilizzare la riga superiore come controllo e aggiungere 10 ml di DDH 2 O a ciascun pozzetto come controlli del volume. <ol><li> Al fine di stabilire una concentrazione di partenza del cellulare di base per il confronto con conta di cellule sperimentali, dissociare e contare il primo pozzo di ogni riga prima della inoculazione iniziale di eventuali pozzi nelle culture con il virus. </li></ol></li><li> Monitorare piastre di coltura ogni 24 ore dopo l&#39;inoculazione virale per qualsiasi cambiamento di colore nel terreno che indica un cambiamento di pH e di eventuali modifiche di morfologia cellulare. </li><li> Immagine una colonna della piastra di prova in ogni punto di tempo, utilizzando un microscopio invertito a 100X TM. </li><li> Rimuovere tutti i media dalla colonna che è stato ripreso in ogni punto di tempo di 24 ore e conservarla a breve termine a -20 ° C per l&#39;estrazione dell&#39;RNA e la quantificazione virale o lungo termine a -80 ° C. </li><li> Dissociare le cellule dai pozzetti dopo la rimozione del mezzo come precedentemente descritto nei passaggi 1,6-1,9, utilizzando solo ~ 250 ml di 0,25% tripsina EDTA e mezzo fresco di fermare l&#39;attività enzimatica e ~ 250 ml di mezzo fresco di ri-sospendere la pelle cellat. </li><li> Aggiungere 10 ml di 0,4% trypan blu macchia in ogni provetta contenente le cellule per eseguire la conta delle cellule dopo la dissociazione delle cellule per ogni periodo di 24 ore più di una settimana. Lasciare macchia riposare per 10 minuti prima di eseguire la conta delle cellule. <ol><li> Eseguire la conta delle cellule entro 1 ora di esposizione a macchiare o cellule vitali inizierà ad assorbimento macchia così come le cellule non vitali. </li></ol></li><li> Aggiungere lentamente 10 ml di soluzione di cellule macchiata a ogni lato di un emocitometro standard utilizzando una micropipetta. Lasciare la soluzione da adottare da un&#39;azione capillare per evitare bolle d&#39;aria. </li><li> Contare il numero di (non tinto), le cellule vitali su entrambi i lati del emocitometro (l&#39;equivalente di 4 conteggi delle 16 piazze del emocitometro). Eseguire la conta delle cellule per ciascun pozzetto della colonna che è stato rimosso. </li><li> Calcolare la media dei conteggi di cella da ogni colonna e utilizzare la seguente formula per ottenere il numero totale conta delle cellule: (numero medio di cellule / 4) x fattore di diluizione = numero di cellule x 10 <sup&gt; 4 ml. Questa è la densità cellulare o il numero di cellule vitali in coltura. </li></ol> 4. Virus Estrazione da coltura cellulare <ol><li> Rimuovere trattati H. vitripennis cellule da fiasche di coltura come precedentemente descritto nei passaggi 1,6-1,8, utilizzando solo ~ 250 ml di 0,25% tripsina EDTA e mezzo fresco per fermare l&#39;attività enzimatica. </li><li> Eliminare il surnatante. </li><li> Estratto virus dalle cellule di coltura seguendo il protocollo precedentemente descritto nei passaggi 2,3-2,8. </li></ol> 5. RNA Estrazione <ol><li> Estrarre l&#39;RNA da campioni medie raccolti durante ogni prova di virus di una settimana con un estrazione tiocianato-fenolo-cloroformio guanidina progettato per campioni liquidi per il protocollo del produttore. </li><li> Conservare estratto campioni a -80 ° C. </li></ol> 6 RT-PCR <ol><li> Stabilire norme virali per RT-PCR eseguendo PCR tradizionale con ilcoppia di primer HoCV RT-PCR Primer 1 (forward 5&#39;-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 &#39;, 5&#39;-inversione ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3&#39;) con il virus isolato da tutto il corpo H. vitripennis. </li><li> Oggetto del prodotto PCR per gel elettroforesi per 60 min a 120 V in un gel di agarosio al 2% contenente 0,1% di bromuro di etidio. </li><li> Accise le bande dal gel e purificare utilizzando un kit di estrazione di gel secondo il protocollo del produttore. </li><li> Pool tutti asportato e gel purificato prodotto e purificare ulteriormente per precipitazione di base di etanolo. Eluire il prodotto precipitazioni in circa 30 ml di Tris EDTA (TE) per aumentare la concentrazione complessiva del campione. </li><li> Quantificare il livello di cDNA in campioni aggregati mediante spettrofotometria con 260/230 impostazioni di lunghezza d&#39;onda per il rilevamento degli acidi nucleici. </li><li> Eseguire una serie di diluizioni seriali di dieci volte del campione purificato che vanno da 57 ng / ml a 57 ag / ml (10 -18). Eseguire la diluizione seriale simile a quella descritta in 2.8 con rettifiche apportate per la differenza nei requisiti di concentramento. </li><li> Determinare i limiti di rilevazione delle serie di diluizioni eseguendo qRT-PCR utilizzando un kit qRT-PCR con quantificazione affidabile di trascritti bassa abbondanza. NOTA: le concentrazioni virali inferiori a 5 x 10 -3 copie non sono rilevabili. </li><li> Estrarre l&#39;RNA da campioni sperimentali come descritto in precedenza al punto 5.1 e quantificare con spettrofotometria. </li><li> Normalizza tutti i campioni estratti a 5 ng / ml con acqua priva di nucleasi. </li><li> Eseguire qRT-PCR su tutti i campioni, in duplicati, come le reazioni di 25 microlitri utilizzando un one-step kit qRT-PCR con la capacità di percepire basso numero di copie come segue: 50 ° C premuto per 10 min; 95 ° C in attesa per 5 min; 30 cicli di 95 ° C per 10 sec, 60 ° C per 30 sec; fondere 50-99 ° C per 5 sec su ogni passo. <ol><li> Rendere il master mix in modo che ogni miscela di reazione contiene 12,5 ml di maste 1xmix R, 1,0 ml (0,3 micron) di primer in avanti, 1,0 ml (0,3 micron) di primer reverse, 0,25 ml di trascrittasi inversa e di quantità variabili di modello in base ai valori di normalizzazione. </li><li> Portare il volume totale di reazione a 25 ml con acqua priva di RNasi. </li><li> Includi cinque concentrazioni standard in ogni PCR eseguiti con i seguenti numeri di copie: 5 x 10 -10, 5 x 10 -8, 5 x 10 -6, 5 x 10 -4, e 5 x 10 -2 copie. Impostare la soglia per ogni corsa appena sotto una fluorescenza di 10x -2.5 per ridurre il rumore durante l&#39;acquisizione anticipata all&#39;inizio di ogni esecuzione. </li></ol></li></ol> 7 Microscopia confocale <ol><li> Crescere cellule Homalodisca vitripennis in dodici piatto contenente anche vetrini di misura 18 mm di diametro in ciascun pozzetto. </li><li> Seminare una colonna sul piatto ogni 24 ore per un periodo di quattro giorni, una volta un monostrato è raggiunto. Assicurarsi che ogni column contiene un controllo bene, una diluizione virale bassa (1,10) bene e una diluizione virale elevata (1: 100.000) bene. Utilizzare soluzioni antivirus ottenute dal punto 2.8. </li><li> Rimuovere tutti i supporti il ​​quinto giorno e lavare le cellule due volte con PBS 1x (pH 7,4). </li><li> Fissare le cellule con freddo 4% paraformaldeide a 4 ° C per 30 min. </li><li> Aggiungere 500 ml di 1x tampone fosfato (PBS) per le cellule e lavare per 10 minuti a temperatura ambiente su una sedia a dondolo a bassa velocità. Lavare le cellule tre volte. </li><li> Aggiungere 500 ml di 0,1% Triton X-100 per le celle a permeabilize loro. Lasciate riposare per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule di nuovo come precedentemente descritto al punto 7.5. </li><li> Aggiungere 500 ml di una soluzione al 5% albumina sierica bovina (BSA) per bloccare le cellule a temperatura ambiente. Lasciare riposare per 2 ore e poi rimuovere. </li><li> Diluire magazzino Rhodamine falloidina rosso-coniugato (RCP) 1: 250 in 1x PBS contenente 5% di BSA e aggiungere 250 ml di diluizione per ciascun bene a macchia di F-actina. </li><li> Piastra di copertura in alluminio folio per evitare che il colorante da sbianca e incubare le cellule a 4 ° CO / N. </li><li> Rimuovere la RCP dopo 12 ore di incubazione e sostituirlo con 250 ml di 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (250 mg / ml) diluito in 1x PBS contenente 5% di BSA, a macchiare i nuclei delle cellule . </li><li> Incubare le cellule contenenti DAPI a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Lavare le cellule tre volte con PBS 1x come precedentemente descritto al punto 7.5. </li><li> Rimuovere delicatamente i coprioggetti dai pozzetti e montare per vetrini da microscopio utilizzando un mezzo di montaggio con un reagente anti-sbiadimento. </li><li> Lasciare i vetrini si asciughino in scatole a tenuta di luce fino visti al microscopio confocale. Vedi Vetrini Preparati al più presto come coloranti possono svanire rapidamente. </li><li> Immagine macchiato cellule utilizzando un sistema confocale equipaggiato con un microscopio contenente una lente 63X (olio) piano-apochromate. <ol><li> Impostare le lunghezze d&#39;onda laser a 543 ± 10 nm di eccitazione e 575 ± 10 nm di emissione per Rhoadmine falloidina rosso-conjucated, E 369 ± 10 nm di eccitazione e 450 ± 30 nm di emissione per DAPI. </li><li> Utilizzare guadagno identici e impostazioni partì-per il rilevatore di ottenere tutte le immagini. </li><li> Immagini di processo utilizzando il software appropriato per l&#39;elaborazione delle immagini e di smistamento e immagini di importazione desiderato in un software di gestione delle immagini. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

L&#39;aumento preoccupazioni per quanto riguarda l&#39;afflusso di specie invasive agricole hanno portato ad un aumento della domanda di nuove metodologie per la difesa contro i parassiti e patogeni emergenti. Un focus di prevenzione e gestione della malattia comporta la gestione di vettori patogeni ed era l&#39;obiettivo primario di questo studio. Economia svolgono un ruolo fondamentale nella decisione di produrre questo tipo di biopesticida per gestire vettori di patogeni in agricoltura perché l&#39;applicazione prat...

Il cecchino vitreo-alato (Homalodisca vitripennis Germar 1821) è stata identificata come il vettore predominante di Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), l&#39;agente causale della malattia di Pierce della vite (PD) in Nord America 1. Insetto gestione della popolazione è rapidamente diventato il centro della ricerca per combattere questo problema devastante per il settore della viticoltura in California e in tutto il sud degli Stati Uniti. Un positivo-senso, virus a RNA a singolo filamento appartenente alla famiglia Dicistroviridae, Homalodisca virus-01 coagulata (HoCV-01) è stata identificata in H. selvatici popolazioni vitripennis e dimostrato di aumentare la mortalità in quelle popolazioni 2-4, riducendo al contempo la resistenza degli insetti agli insetticidi. Sviluppo di metodi per efficacemente posteriore infetto H. vitripennis all&#39;età adulta in un ambiente di laboratorio sono stati difficili perché <em&gt; H. vitripennis hanno diverse esigenze nutrizionali specifiche fasi che richiedono una grande varietà di piante ospiti 5-8. Strutture specifiche sono richieste per posteriore H. vivo vitripennis negli Stati Uniti; Pertanto, coltura cellulare è più economico e una possibile alternativa, così come sempre più vitale per HoCV-01 rilevazione e replicazione 2,9. Mentre i metodi di base per stabilire colture cellulari di H. vitripennis sono descritti, questi metodi non sono ancora stati utilizzati per la produzione commerciale di agenti di controllo biologico, come ad esempio i virus 2. L&#39;obiettivo generale delle seguenti procedure è quello di produrre una elevata concentrazione di HoCV-01 adatto per l&#39;utilizzo come agente di controllo biologico. Replicazione virale richiede una cellula vivente, che è il motivo per cui coltiva con successo e l&#39;ottimizzazione H. vitripennis culture è fondamentale per il progresso di produrre livelli redditizi di virus.

<table><tbody><tr><td>Corning cell culture flasks</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430168</td><td>Surface area 25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;, canted neck, cap (plug seal)</td></tr><tr><td>Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71</td><td>Olympus</td><td></td><td>Inverted microscope and camera</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4049</td><td>0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA &amp;bull; 4Na per liter of Hanks&amp;prime; Balanced Salt Solution with phenol red</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR multiwell culture plates</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8937</td><td>48 wells (TC treated with lid)</td></tr><tr><td>DETCA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>228680</td><td>Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate</td></tr><tr><td>Corning bottle-top vacuum filter system</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS431206</td><td>Cellulose acetate membrane, pore size 0.45 &amp;mu;m, membrane area 54.5 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;, filter capacity 500 ml</td></tr><tr><td>Brij 52</td><td>Sigma Aldrich</td><td>388831</td><td>Polyethylene glycol hexadecyl ether</td></tr><tr><td>Phosphate buffer solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5244</td><td>Received as 100 mM diluted to 10 mM with sterile water</td></tr><tr><td>TRIzol LS</td><td>Life Technologies</td><td>10296-028</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5304</td><td>For electrophoresis</td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7637</td><td>BioReagent, for molecular biology, powder</td></tr><tr><td>QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect qRT-PCR kit</td><td>Qiagen</td><td>204243</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Reagent grade, crystalline</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368</td><td>Phosphate buffered saline</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine red-conjugated phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>R415</td><td>Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>LSM510 Meta Confocal System</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM Zen 2007 Software</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grace&amp;rsquo;s Insect medium (supplemented, 1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8142</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>L-histidine monohydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8125</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>Medium 199 (10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4530</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>Medium 1066 (1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0422</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Balanced Salts (1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51322C</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>L-Glutamine (100x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G3126</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>MEM, amino acid mix (50x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56419C</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>1 M MgCl solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>Pen-Strep (w/ glutamine)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G6784</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N6261</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46305</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9434</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr></tbody></table>

propagation of homalodisca coagulata virus-01 via homalodisca vitripennis cell culture

Il cecchino vitreo-alato (Homalodisca vitripennis) è un insetto estremamente polifago vagili e presente in tutto il sud-ovest degli Stati Uniti. Questi insetti sono i vettori predominanti di Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), un batterio xilema limitata che è l&#39;agente causale della malattia di Pierce (PD) della vite. Malattia di Pierce è economicamente dannoso; così, H. vitripennis sono diventati un bersaglio per le strategie di gestione del patogeno. Un dicistrovirus identificato come virus-01 Homalodisca coagulata (HoCV-01) è stata associata a un aumento della mortalità in H. popolazioni vitripennis. Perché una cellula ospite è necessaria per la replica HoCV-01, coltura cellulare fornisce un ambiente uniforme per la replica mirato che è logisticamente ed economicamente importante per la produzione di bio-pesticida. In questo studio, un sistema per la propagazione su larga scala da H. vitripennis cellule tramite coltura tissutale è stato sviluppato, providing un meccanismo di replicazione virale. HoCV-01 è stato estratto da insetti di tutto il corpo e utilizzato per inoculare H. colta vitripennis cellule a diversi livelli. Il terreno di coltura è stato rimosso ogni 24 ore per 168 ore, RNA estratto e analizzato con qRT-PCR. Le cellule sono state colorate con blu trypan e contati per quantificare la capacità di sopravvivenza delle cellule mediante microscopia ottica. Particelle virali intere sono stati estratti fino a 96 ore dopo l&#39;infezione, che è stato il punto di tempo determinato per essere prima totale coltura cellulare crollo si è verificato. Le cellule sono state inoltre sottoposte a colorazione fluorescente e visualizzati mediante microscopia confocale per indagare l&#39;attività virale su attaccamento e nuclei integrità F-actina. La conclusione di questo studio è che H. vitripennis cellule sono in grado di essere colta e utilizzata per la produzione di massa di HoCV-01 a un livello adeguato a consentire la produzione di un biopesticida.

Attaccamento delle cellule e la crescita è stato visto in 48 ore di passaggio in piccole e grandi fiasche di coltura, da colture primarie e continui passaggi. Crescita dei fibroblasti e sviluppo è stata osservata anche in questo lasso di tempo. Quando fiaschi appena seminati sono stati disturbati prima di 48 ore, c&#39;è stato un calo visibile in adesione cellulare, portando a culture crescita più lenti ea volte senza attaccamento o di crescita a tutti. Le cellule sono state circa il 80% confluenti entro una settima...

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Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Qui vi presentiamo un protocollo per propagare le cellule Homalodisca vitripennis e HoCV-1 in vitro. Media è stato rimosso dalla HoCV-1 colture positive e RNA estratto ogni 24 ore per 168 ore. Sopravvivenza cellulare è stata quantificata trypan colorazione blu. Particelle virali intere sono stati estratti dopo l&#39;infezione. RNA estratto è stato quantificato da qRT-PCR.

Propagazione di<em&gt; Virus-01 Homalodisca coagulata</em&gt; Via<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Cell Culture

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

propagation-homalodisca-coagulata-virus-01-via-homalodisca

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

11.7K Views.  University of Texas at Tyler.  Qui vi presentiamo un protocollo per propagare le cellule Homalodisca vitripennis e HoCV-1 in vitro. Media è stato rimosso dalla HoCV-1 colture positive e RNA estratto ogni 24 ore per 168 ore. Sopravvivenza cellulare è stata quantificata trypan colorazione blu. Particelle virali intere sono stati estratti dopo l'infezione. RNA estratto è stato quantificato da qRT-PCR. 

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Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Il rilevamento del virus infettivo da Campo-zanzare raccolte mediante test coltura cellulare Vero

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Influenza Virus Propagazione in embrionate di pollo Uova

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

Un approccio semplice ed efficiente per costruire Mutant vaccinia vettori di virus

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction analysis. One particular method to achieve this conditional deletion is via the use of the Cre-loxP system. This method involves flanking the gene of interest with loxP sites, which are specific recognition sequences for the Cre recombinase protein. Exposure of the so-called floxed (flanked by loxP site) DNA to this enzyme results in a Cre-mediated recombination event at the loxP sites, and subsequent excision of the intervening gene3. Several different methods exist to administer Cre recombinase to the site of interest. In this video, we demonstrate the use of an adenovirus containing the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) obtained from embryos containing a floxed Rac1 allele1. Our rationale for selecting Rac1 MEFs for our experiments is that clear morphological changes can be seen upon deletion of Rac1, due to alterations in the actin cytoskeleton2,5. 72 hours following viral transduction and Cre expression, cells were stained using the actin dye phalloidin and imaged using confocal laser scanning microscopy. It was observed that MEFs which had been exposed to the adeno-Cre virus appeared contracted and elongated in morphology compared to uninfected cells, consistent with previous reports2,5. The adenovirus method of Cre recombinase delivery is advantageous as the adeno-Cre virus is easily available, and gene deletion via Cre in nearly 100% of the cells can be achieved with optimized adenoviral infection.

In this video we use an adenovirus carrying the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts carrying a floxed Rac1 allele.

Adenovirus-mediata rimozione genetica di molecole di segnalazione in fibroblasti di topo coltivate primarie embrionali

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Biologia

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.

Generazione di vettori ricombinanti Herpesvirus aviaria con CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our knowledge of prevention and treatment of viral infection. The fruit fly Drosophila melanogaster has proven to be one of the most efficient and productive model organisms to screen for antiviral factors and investigate virus-host interaction, due to powerful genetic tools and highly conserved innate immune signaling pathways. The procedure described here demonstrates a nano-injection method to establish viral infection and induce systemic antiviral responses in adult flies. The precise control of the viral injection dose in this method enables high experimental reproducibility. Protocols described in this study include the preparation of flies and the virus, the injection method, survival rate analysis, the virus load measurement, and an antiviral pathway assessment. The influence effects of viral infection by the flies' background were mentioned here. This infection method is easy to perform and quantitatively repeatable; it can be applied to screen for host/viral factors involved in virus-host interaction and to dissect the crosstalk between innate immune signaling and other biological pathways in response to viral infection.

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

This protocol describes how to establish viral infection in vivo in Drosophila melanogaster using the nano-injection method and basic techniques to analyze virus-host interaction.

Istituzione dell'infezione virale e analisi dell'interazione ospite-Virus in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious public health issues and suggest the possibility of an epidemic. However, our molecular understanding of the virus is rudimentary, and it is necessary to study the biological properties of its envelope proteins as therapeutic targets and to develop strategies to control infection. We developed a solid viral pseudotyped particle (pp) platform to study avian influenza virus, including the functional analysis of its hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) envelope glycoproteins, the reassortment characteristics of the HAs and NAs, receptors, tropisms, neutralizing antibodies, diagnosis, infectivity, for the purposes of drug development and vaccine design. Here, we describe an experimental procedure to establish pps with the envelope glycoproteins (HA, NA) from two influenza A strains (HAPI H5N1 and 2013 avian H7N9). Their generation is based on the capacity of some viruses, such as murine leukemia virus (MLV), to incorporate envelope glycoproteins into a pp. In addition, we also detail how these pps are quantified with RT-qPCR, and the infectivity detection of native and mismatched virus pps depending on the origin of the HAs and NAs. This system is highly flexible and adaptable and can be used to establish viral pps with envelope glycoproteins that can be incorporated in any other type of enveloped virus. Thus, this viral particle platform can be used to study wild viruses in many research investigations.

This protocol describes an experimental process to produce high-titer infectious viral pseudotyped particles (pp) with envelope glycoproteins from two influenza A strains and how to determine their infectivity. This protocol is highly adaptable to develop pps of any other type of enveloped viruses with different envelope glycoproteins.

Produzione di particelle pseudotioniche di influenza ad alto livello con le legiole di busta dei virus altamente patogeni H5N1 e Avian H7N9

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks

Hepatitis E virus is the leading cause of liver cirrhosis and liver failure with increasing prevalence worldwide. The single-stranded RNA virus is predominantly transmitted by blood transfusions, inadequate sanitary conditions and contaminated food products. To date the off-label drug ribavirin (RBV) is the treatment of choice for many patients. Nonetheless, a specific HEV treatment remains to be identified. So far, the knowledge about the HEV life cycle and pathogenesis has been severely hampered because of the lack of an efficient HEV cell culture system. A robust cell culture system is essential for the study of the viral life cycle which also includes the viral pathogenesis. With the method described here one can produce viral titers of up to 3 x 106 focus forming unit/mL (FFU/mL) of non-enveloped HEV and up to 5 x 104 FFU/mL of enveloped HEV. Using these particles, it is possible to infect a variety of cells of diverse origins including primary cells and human, as well as animal cell lines. The production of infectious HEV particles from plasmids poses an infinite source, which makes this protocol exceedingly efficient.

Described here is an effective method on how to produce high viral titer stocks of hepatitis E virus (HEV) to efficiently infect hepatoma cells. With the presented method, both non-enveloped, as well as enveloped viral particles can be harvested and used for inoculating various cell lines.

Un modello di coltura cellulare per la produzione di titoli di epatite ad alto tire e virus

Hepatitis E virus is the leading cause of liver cirrhosis and liver failure with increasing prevalence worldwide. The single-stranded RNA virus is ...

Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two main categories of these new mosquito-associated viruses are &#34;mosquito-borne viruses (MBVs)&#34; and &#34;mosquito-specific viruses (MSVs)&#34;. These novel viruses might be pathogenic to both vertebrates and mosquitoes, or they could just be symbiotic with mosquitoes. Entity viruses are essential to confirm the biological characters of these viruses. Thus, a detailed protocol has been described here for virus isolation and amplification from field-collected mosquitoes. First, the mosquito samples were prepared as supernatants of mosquito homogenates. After centrifugation twice, the supernatants were then inoculated into either mosquito cell line C6/36 or vertebrate cell line BHK-21 for virus amplification. After 7 days, the supernatants were collected as the P1 supernatants and stored at -80 &#176;C. Next, P1 supernatants were passaged twice more in C6/36 or BHK-21 cells while the cell status was being checked daily. When cytopathogenic effect (CPE) on the cells was discovered, these supernatants were collected and used to identify viruses. This protocol serves as the foundation for future research on mosquito-associated viruses, including MBVs and MSVs.

Numerous novel virus-like sequences have been found in mosquitoes due to the extensive use of sequencing technologies. We provide an effective procedure for isolating and amplifying viruses using vertebrate and mosquito cell lines, which might serve as the basis for future studies on mosquito-associated viruses, including mosquito-borne and mosquito-specific viruses.

Isolamento del virus associato alle zanzare dalle zanzare raccolte sul campo

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two ...

Cellular Impedance-Based Survival Kinetics Assay to Assess Virus Survival

Source: Labadie, T. et al., <a href="https://app.jove.com/v/61133">Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video describes a cellular impedance-based technique to study the survival kinetics of viruses that induce cytopathic effects. The method measures the electrical impedance of virus-infected adherent cells pre-treated with saline.

Saggio cinetico di sopravvivenza basato sull'impedenza cellulare per valutare la sopravvivenza del virus

Source: Labadie, T. et al., Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis. J. Vis. Exp. (2021).
This video describes ...

Propagazione di

Riepilogo

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