We would like to thank the Texas Pierce&#8217;s Disease Research and Education Program and USDA-APHIS for their funding support for this project. We would also like to thank Hema Kothari at the University of Texas Health Science Center at Tyler for her assistance with confocal microscopy.

1 세포 배양 참고 : 미국 농무부 농업 연구 서비스 (. 포트 피어스, FL USA)에서 박사 웨인 헌터 연구소에 의해 설립 Homalodisca vitripennis 세포주 초기 섬유 아세포 및 단일 층을 포함하여 혼합 된 세포 단계로 구성된 실험실 주식을 시작하는 데 사용되었다. <ol><li> 이 25cm 배양 플라스크에 20-24 ℃의 온도 범위에서 유지 무균 실험실 환경에서 다음 절차를 수행한다. </li><li> 육성 및 H2G + 매미충 매체, 수정 WH2의 꿀벌 미디어 10 (표 1)를 사용하여 25cm 두 조직 배양 플라스크에 문화를 유지한다. </li><li> 53 %의 습도 ~로 24 ° C에서 배양 플라스크를 품어. </li><li> , 비정상적인 세포 성장을 확인, 예를 들면 문화의 성장을 모니터링 잠재적 인 오염 물질을 모니터링하고 막에 걸쳐 성장 진행 상황을 확인하기 위해 총 배율 100 배의 (TM)에 거꾸로 현미경을 사용하여진짜야면. </li><li> 문화 표면을 방해하지 않고 10 일 - 매 7 완전한 매체 변화 (~ 플라스크 당 4 ㎖의 배양 배지)를 수행합니다. </li><li> 문화 표면 세포를 해리 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 포함하는 0.25 % 트립신을 사용하여 세포 성장 (합류)에 포함 약 80 % 인 경우에 문화를 전달합니다. 각 배양 플라스크에 3 ㎖ 트립신 및 시간의 짧은 시간 동안 배양 효소 (들)를 노출 - ~ 2 추가 - 완전한 세포 분리를 달성하기 위해 (5-10 분). </li><li> 효소 활동을 중지하고 원심 분리를위한 원뿔 튜브에 전체 솔루션을 전송 - 문화 플라스크 (들) (3 ML ~ 2)에 새로운 배지의 동일한 금액을 추가합니다. </li><li> 350 × g으로 6 분 동안 4 ° C에서 원심 분리하여 펠렛 세포. </li><li> 세포 펠렛을 방해하지 않고 상층 액을 제거하고 각 튜브에 ~ 신선한 매체의 8 ML을 추가합니다. 부드럽게 피펫을 사용하여 세포를 균질화. </li><li> 1에서 분할 문화 : 2 비율 25 센티미터이 플라스크 (~ 셀 soluti의 4 ML플라스크 당에) 떠날 갓 통과 현탁 배양에서 세포가 플라스크의 표면에 확실하게 부착 할 수 있도록하기 위해 48 시간 동안 방해받지. NOTE : 1cm 2의 성장면과 48 웰 멸균 조직 배양 플레이트에서 세포 배양이 가능하다 그들이 ~ 250 μL에 배지의 부피의 감소와 함께 배양 플라스크와 동일하게 유지 될 수있다. </li></ol> 2 전체 바이러스 추출 <ol><li> 바이러스 양성 H.의 몸 전체를 균질화 ~ 10 초 간격에 대한 텍싱 0.02 % 나트륨 디 에틸 삼수화물 (DETCA)와 인산염 완충액에서 vitripennis, 산도 ~ 7.2, 아니 현재 조직의 더 큰 덩어리가 없을 때까지. 4 ° C에서 4 시간 또는 4 ° C에서 16 시간 동안 22,000 XG에 대한 124500 XG에서 슈퍼 스피드 원심 분리를 통해 바이러스의 압축을 풉니 다. 상단에 침전물을 형성하는 경우, 멸균 면봉 (11)를 제거합니다. </li><li> 상층 액을 버린다. </li><li> 펠렛을 수집하고0.4 % 나트륨 데 옥시 콜산-4 % 폴리에틸렌 글리콜 데실 에테르 (BRIJ 52)을 함유하는 5 ㎖의 10 mM의 인산 완충액 (전술 DETCA), pH가 7.2 ~ 녹인다. <ol><li> 잘 섞어 펠릿, 튜브 측으로부터 펠릿을 제거하고, 필요한 경우 용액까지 분쇄. </li><li> 펠릿이 필요한 경우 솔루션에 가서 2 튜브 (11)에 결합 할 수 있도록 ~ 5 ㎖의 단위로 10 개 mM의 인산 버퍼를 추가합니다. </li></ol></li><li> 15 분 11 300 XG에 용액을 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 제거하고 0.45 μm의 필터를 통해 솔루션을 전달하고 대규모 수집 관 (11)의 여과를 수집합니다. </li><li> 분자량 투석막에 전송 여액을 10 ㎜의 11 필요한 경우에는 DETCA을 함유하지 않는 인산염 완충액 (pH 7)를 소량 사용하여, 3.5 가와사끼 (MWCO)를 잘라. </li><li> 4 ° C에서 DDH 2 O로 가득 큰 비커에 투석막을 놓습니다. DDH 2 O마다 시간의 F 변경또는 5-6 시간, 멤브레인 (11)의 흰색 침전물이 형성 될 때까지. </li><li> 막 내에서 정제 된 바이러스를 모아 둘 DDH O. 90 μL로 용액 10 μl를 첨가하여 10 배 희석 계열로 100 % 바이러스 용액을 가하지 100000 : 그 후 1의 희석에 도달 할 때까지 DDH 2 O의 또 다른 90 μL로 희석의 10 μl를 추가합니다. </li><li> -80 ° C에서 보관 바이러스 솔루션입니다. </li></ol> 3 바이러스 성 복제 <ol><li> 세포 성장이 (세포가 평균 속도로 성장하는 경우 약 72 시간 후 - 패스) 80 %의 합류 때까지 48 웰 배양 플레이트에서 종자 세포는 모든 행을 성장. </li><li> 세포 성장이 포화 상태에 도달하면 희석시킨 바이러스와 세포의 각 행에 접종, 즉, 1:10 희석 한 행, 하나의 하나의 행 : 위쪽 행 (100)를 제외한 희석 등. 대조군으로 맨 위 행을 사용하여 볼륨 컨트롤로 각 웰에 DDH 2 O의 10 μl를 추가합니다. <ol><li> 종래 바이러스 배양 모든 웰의 초기 접종하여 각 행의 제 1 웰을, 실험 세포 수와 비교 시작 기준선 세포 농도를 확립 해리 및 카운트하기 위해. </li></ol></li><li> 배양 플레이트에게 pH 변화를 나타내는 매체의 모든 색상 변경 및 세포 형태의 변경에 대한 바이러스 접종 후 매 24 시간을 모니터링합니다. </li><li> 100X TM에서 도립 현미경을 이용하여 각 시점에서의 테스트 플레이트의 이미지 한 칼럼. </li><li> 각 24 시간 시점에서 이미지화 된 열에서 모든 매체를 제거하고 -80 ° C에서 RNA 추출 및 바이러스 정량 또는 장기적으로 -20 ° C에 그것을 단기를 저장합니다. </li><li> 셀 PELLE 다시 중단 효소 활성 및 신선한 배지 ~ 250 μl를 중지 0.25 % 트립신 EDTA 및 신선한 배지 만 ~ 250 μl를 사용하여 1.9, - 이전의 단계 1.6에 기재된 바와 같이 매체를 제거한 후 웰로부터 세포를 해리t. </li><li> 일주 이상 각 24 시간 동안 세포 분리 한 후 세포 수를 수행 할 수있는 세포를 포함하는 각각의 튜브에 0.4 %의 트리 판 블루 염색의 10 μl를 추가합니다. 얼룩이 세포 수를 수행하기 전에 10 분 동안 앉아 할 수 있습니다. <ol><li> 얼룩뿐만 아니라 비 가능한 세포 통풍 관을 시작합니다 스테인 노출 또는 가능한 세포의 1 시간 이내에 세포 수를 수행합니다. </li></ol></li><li> 천천히 마이크로 피펫을 사용하여 표준 혈구의 각 측면에 염색 세포 용액 10 μL를 추가한다. 허용 용액을 공기 방울을 방지하기 위해 모세관 현상에 의해 흡수된다. </li><li> 혈구 양쪽 가능한 (착색되지​​ 않은) 셀의 개수 (혈구에서 16 제곱의 4 카운트에 해당)를 카운트. 제거 된 컬럼의 각 웰에 세포 수를 수행합니다. </li><li> 각 열에서 세포 수를 평균 전체 셀 카운트 수 구하는 다음의 공식을 사용 X 희석 인자 (세포 / 4의 평균 수) = X (10)의 셀 수가 <sup는&gt; 4 ML. 이 배양 세포 밀도 또는 생존 세포의 수이다. </li></ol> 세포 배양에서 4 바이러스 추출 <ol><li> 처리 H. 제거 효소 활동을 중지하기 위해 0.25 % 트립신 EDTA와 신선한 매체 만 ~ 250 μl를 사용하여 1.8 - 배양 플라스크에서 vitripennis 세포는 이전 단계 1.6에 설명 된대로. </li><li> 상층 액을 버린다. </li><li> 2.8 - 이전 단계 2.3에 설명 된 프로토콜 다음 배양 세포에서 바이러스의 압축을 풉니 다. </li></ol> 5 RNA 추출 <ol><li> 제조 업체의 프로토콜 당 액체 샘플을 위해 설계된 아니 디늄 티오 시아 네이트 - 페놀 - 클로로포름 추출을 사용하여 각 한 주 바이러스 시험에서 수집 된 매체 샘플에서 RNA를 추출합니다. </li><li> 스토어는 -80 ° C에서 샘플을 추출 하였다. </li></ol> 6 RT-PCR <ol><li> 사용하여 기존의 PCR을 실행하여 RT-PCR을위한 바이러스 성 기준을 설정프라이머 쌍 HoCV RT-PCR 프라이머 1 (정방향 5&#39;-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 &#39;- ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3 5&#39;리버스 &#39;) 바이러스가 몸 전체 H.에서 분리 vitripennis. </li><li> 제목 PCR 생성물을 0.1 % 에티 디움 브로마이드를 함유하는 2 % 아가 로즈 젤에서 120 V에서 60 분간 전기 영동 겔. </li><li> 겔에서 밴드를 절제하고 제조자의 프로토콜에 따라 겔 추출 키트를 사용하여 정제. </li><li> 수영장은 모두 절제 젤 정제 제품 또한 기본 에탄올 침전에 의해 정화. 전체 시료 농도를 증가 트리스 EDTA (TE)의 약 30 μL로 침전 생성물을 용출. </li><li> 핵산 검출 용 230분의 260 파장 설정을 사용하여 분광 광도법을 통해 풀링 된 cDNA 샘플에서의 수준을 정량화. </li><li> 57 NG에 이르기까지 정제 된 시료의 10 배 용액을 희석 시리즈를 수행 / 57 AG / μL (10 -18)에 μL. 유사한 직렬 희석 제가 설명 수행N 농도 조건에서의 차이에 대한 조정이 이루어 2.8. </li><li> 미량의 성적 증명서의 신뢰성 정량화와 Q​​RT-PCR 키트를 사용하여 QRT-PCR을 수행하여 희석 시리즈의 검출 한계를 결정합니다. 참고 : 5 × 10 -3 사본보다 바이러스 농도가 낮은는 검출되지 않습니다. </li><li> 단계 5.1에서 전술 한 바와 같이 실험 샘플에서 RNA를 추출하고 분광 광도계를 사용하여 정량화. </li><li> 클리 무료 물을 사용 μL / 5 NG 모든 추출 된 샘플을 정상화. </li><li> 다음과 같이 25 ㎕의 반응이 낮은 사본 번호를 감지 할 수있는 능력을 한 단계 QRT-PCR 키트를 사용하는 것으로, 중복에, 모든 샘플에 QRT-PCR을 수행 : 50 ° C 10 분 동안 유지; 5 분 동안 95 ° C에서 개최; 10 초, 30 초 동안 60 ° C, 95 ° C의 30주기; 각 단계에서 5 초 동안 99 °의 C - 50에서 녹아. <ol><li> 각각의 반응 혼합물은 1X maste 12.5 μl를 포함하도록 마스터 믹스 만들기R 믹스, 앞으로 프라이머의 1.0 μL (0.3 μM), 역방향 프라이머의 1.0 μL (0.3 μM), 역전사 효소 및 표준화 값을 기반으로 템플릿의 변수 금액의 0.25 μL. </li><li> 의 RNase 무료 물 25 μL에 총 반응 볼륨을 가져와. </li><li> 각 PCR에 다섯 표준 농도는 다음 복사본 번호와 함께 실행 같습니다 × 10 -10 5, 5 × 10-8, 5 × 5 × 10 -4 -6 10, 5 × 10 -2 사본. 각 실행의 시작 부분에 초기 취득시 소음을 줄이기 위해 단지 10 배 -2.5의 형광 아래에 각 실행에 대한 임계 값을 설정합니다. </li></ol></li></ol> 7 공 초점 현미경 <ol><li> 물론 각 직경 18mm를 측정 열두 웰 플레이트 포함 유리 커버 슬립에 Homalodisca vitripennis 세포를 성장. </li><li> 단층이 달성되면, 사일 동안 플레이트에 24 시간마다 하나의 칼럼을 접종한다. 각 C 있는지 확인olumn 잘 컨트롤이 포함 낮은 바이러스 희석 (1시 10분)도 높은 바이러스 성 희석 (1 : 100,000) 잘. 단계 2.8에서 얻은 바이러스 솔루션을 사용합니다. </li><li> 다섯째 날에 모든 미디어를 제거하고 두 번 1X PBS (산도 7.4)로 세포를 씻어. </li><li> 30 분 동안 4 ° C에서 차가운 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정합니다. </li><li> 1X 인산염의 500 μL은 세포에 생리 식염수 (PBS)를 버퍼에 추가하고 저속에서 로커에 RT에서 10 분 동안 씻어. 세포를 세 번 씻으십시오. </li><li> 그들을 Permeabilize 하시려면하는 세포에 0.1 % 트리톤 X-100의 500 μl를 추가합니다. 실온에서 10 분 동안 앉아 보자. </li><li> 세포를 씻고 다시 같은 이전 단계 7.5에 설명. </li><li> RT에서 세포를 차단하기 위해 5 % 소 혈청 알부민 (BSA) 용액 500 μl를 추가. 2 시간 동안 앉아서 다음 제거하자. </li><li> 1X PBS가 5 % BSA를 포함하는 250와 F-액틴에 대한 얼룩에 각 웰에 희석 250 μl를 추가 : 재고 로다 민 레드 - 복합 phalloidin (RCP) 하나를 희석. </li><li> 알루미늄 f를 커버 플레이트오일은 표백에서 염료를 방지하고 4 ° CO / N에서 세포를 배양한다. </li><li> 배양 12 시간 후 RCP를 제거하고 세포의 핵을 염색하기 위해, 5 % BSA를 함유하는 1X PBS에 희석하여 6-diamidino-2-페닐 인돌 (4)의 250 μL &#39;(DAPI) (250 μg / ㎖)로 대체 . </li><li> 1 시간 동안 RT에서 DAPI를 포함하는 세포를 배양한다. </li><li> 이전 단계 7.5에 설명 된대로 1X PBS로 세포를 세 번 씻으십시오. </li><li> 조심스럽게 우물 된 커버를 제거하고 방지 페이드 시약 장착 미디어를 사용하여 슬라이드를 현미경 마운트합니다. </li><li> 공 초점 현미경으로 볼 때까지 슬라이드 박스 차광에서 건조하도록 허용합니다. 염료가 빠르게 사라질 수로보기는 가능한 한 빨리 슬라이드를 준비했다. </li><li> 63X (오일) 계획 - apochromate 렌즈를 포함하는 현미경 장착 공 초점 영상 시스템을 이용하여 염색 된 세포. <ol><li> 543 ± 10 nm의 여기 및 Rhoadmine 레드 conjucated phalloidin 대 575 ± 10 nm의 방출에 레이저 파장을 설정DAPI 대, 및 369 ± 10 nm의 여기 및 450 ± 30 nm의 방출. </li><li> 모든 이미지를 얻기 위해 감지기 동일한 이득과 오프 설정 설정을 사용합니다. </li><li> 화상 처리에 적합한 소프트웨어를 사용하여 이미지를 관리하는 소프트웨어에 정렬 및 수입 원하는 이미지와 이미지 프로세스. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

침략 농업 종의 유입에 대한 상승 우려는 새로운 해충과 병원균에 대한 방어 할 수있는 새로운 방법론에 대한 수요 증가로 이어질했다. 질병 예방과 관리의 초점은 병원체 벡터의 관리를 포함하고이 연구의 주된 목표였다. 경제적 실용화가 큰 영역 위에 있지만 저비용 12에서 대량으로 필요하기 때문에 농업용 병원체 경로를 관리하는 생물 농약이 유형을 생성하는 결정에 중요한 역할을?...

유리 날개의 명사수 (Homalodisca vitripennis Germar 1821)는 북미 1, Xylella fastidiosa (X를 fastidiosa)의 지배적 인 벡터로 포도 ​​나무 (PD)의 피어스 병의 인과 에이전트를 확인되었습니다. 곤충 인구 관리는 빨리 캘리포니아와 미국 남부에서 포도 재배 산업이 파괴 문제를 해결하기위한 연구의 초점이되었다. 가족에 속하는 양의 감지, 단일 가닥 RNA 바이러스는 Dicistroviridae, Homalodisca는 coagulata 바이러스-01 (HoCV-01) 야생 H.에서 발견되었습니다 vitripennis 인구와 살충제로 곤충의 저항을 낮추고, 그 인구 2-4에서 사망률이 증가하는 것으로. 방법의 개발을 효과적으로 후방 H. 감염합니다 실험실 환경에서 성년 vitripennis 때문에 어려웠을 <em&gt; H. vitripennis는 기주 식물 5-8의 다양한 요구 다른 단계 별 영양 필요가있다. 특정 시설 후면 라이브 H.에 필요한 미국에서 vitripennis; 따라서, 세포 배양 물은 더 경제적이고 실용적인 대안뿐만 아니라 HoCV-01 검출 및 복제 2,9 점점 중요하다. H.의 세포 배양을위한 기본적인 방법 확립하면서 vitripennis는 바이러스 2로, 이러한 방법은 아직 생물학적 조절제의 상업 생산에 이용되지 않은, 설명되어 있습니다. 다음 절차의 전체적인 목적은 생물학적 방제 제로서 이용하​​기에 적합한 HoCV-0129의 높은 농도를 생성하는 것이다. 바이러스 성 복제는 왜 성공적으로 H. 육성 및 최적화 된 살아있는 세포를 필요로 vitripennis 문화는 바이러스의 수익성 수준을 생산의 발전에 매우 중요합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="595">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:93px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Corning&#160;cell culture flasks</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS430168</td>
			<td>Surface area 25&#160;cm2, canted neck, cap (plug seal)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Inverted microscope and camera</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td>0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2&#160;g EDTA &#8226; 4Na per liter of Hanks&#8242; Balanced Salt Solution with phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Greiner CELLSTAR&#160;multiwell culture plates</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M8937</td>
			<td>48 wells (TC treated with lid)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">DETCA&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>228680</td>
			<td style="width:167px;">Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Corning&#160;bottle-top vacuum filter system</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS431206</td>
			<td>Cellulose acetate membrane, pore size 0.45&#160;&#956;m, membrane area 54.5&#160;cm2, filter capacity 500&#160;mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Brij 52</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>388831</td>
			<td>Polyethylene glycol hexadecyl ether</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phosphate buffer solution</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P5244</td>
			<td>Recieved as 100mM diluted to 10mM with sterile water</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">TRIzol LS&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Life Technologies</td>
			<td>10296-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A5304</td>
			<td>For electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>E7637</td>
			<td>BioReagent, for molecular biology, powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick</td>
			<td style="width:93px;">Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuantiTect qRT-PCR kit&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Qiagen</td>
			<td>204243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">4% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148&#160;</td>
			<td>Reagent grade, crystalline</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PBS&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P5368</td>
			<td style="width:167px;">Phosphate buffered saline</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Rhodamine red-conjugated phalloidin&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Life Technologies</td>
			<td>R415</td>
			<td>Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DAPI&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">ProLong Gold Antifade Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Life Technologies</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM510 Meta Confocal System&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM Zen 2007 Software</td>
			<td style="width:93px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Grace&#8217;s Insect medium (supplemented, 1X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>G8142</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-histidine monohydrate</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>H8125</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Medium 199 (10X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M4530</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Medium 1066 (1X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C0422</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hank&#8217;s Balanced Salts (1X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>51322C</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-Glutamine (100X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MEM, amino acid mix (50X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>56419C</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1 M MgCl solution</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pen-Strep (w/ Glutamine)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>G6784</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nystatin</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>N6261</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gentamycin</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>46305</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dextrose</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

propagation of homalodisca coagulata virus-01 via homalodisca vitripennis cell culture

유리 날개 사격의 명수 (Homalodisca vitripennis)은 미국 남서부에 걸쳐 발견 매우 vagile 및 잡식성 곤충이다. 이 곤충은 Xylella fastidiosa (X를 fastidiosa)의 주된 벡터, 포도 나무의 피어스 병 (PD)의 인과 에이전트 목부 제한 박테리아입니다. 피어스 병은 경제적 피해이고; 따라서 H. vitripennis 병원체 관리 전략의 대상이되고있다. Homalodisca의 coagulata 바이러스-01 (HoCV-01)로 확인 dicistrovirus는 H.의 사망률 증가와 관련이있다 vitripennis 인구. 숙주 세포는 01-HoCV 복제에 필요하기 때문에, 세포 배양 물은 생물 농약과 물류 생산 경제적 가치가 타겟팅 복제 일정한 환경을 제공한다. 이 연구, H. 대규모 전파 시스템 조직 배양을 통해 vitripennis 세포가 개발 한 P바이러스 복제 메커니즘을 roviding. HoCV-01는 몸 전체의 곤충에서 추출하여 배양 된 H. 접종에 사용 된 다양한 수준에서 vitripennis 세포. 배지는 168 시간, RNA 추출 QRT-PCR 분석을위한 매 24 시간을 제거 하였다. 세포는 트리 판 블루로 염색하고 광학 현미경을 이용하여 세포의 생존 성을 정량화하는 계수 하였다. 항목의 바이러스 입자는 전체 세포 배양 붕괴가 발생하기 전에 것으로 결정된 시점이었다 감염 후 96 시간, 최대 추출 하였다. 세포는 형광 염색을 실시하고 F-액틴 및 첨부 핵 무결성에 바이러스 활성을 조사하기 위해 공 초점 현미경을 사용하여 보여졌다. 이 연구의 결론은 있다는 것이다 H. vitripennis 세포 배양 생물 농약의 생산을 허용하기에 적합한 수준으로 HoCV-01의 대량 생산을 위해 사용 가능하다.

세포 부착과 성장은 차 문화와 계속 통로에서, 크고 작은 문화 플라스크에 통과 48 시간 내 보였다. 섬유 아세포의 성장과 발전은이 시간 내에 관찰되었다. 새로 시드 플라스크 48 시간 전에 교란되었을 때,이, 세포 부착에 보이는 감소했다 때로는 느린 성장 문화와 전혀 첨부 파일 또는 성장을 선도. 세포는 전달의 1 주일 이내에 약 80 %의 합류했고, 10~14일 (그림 1)에서 단일 층을 형성했...

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Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

여기에서 우리는 시험 관내에서 Homalodisca vitripennis 세포와 HoCV-1을 전파하는 프로토콜을 제시한다. 중간 HoCV - 한 긍정적 인 문화에서 제거하고 RNA는 168 시간 동안 매 24 시간을 추출 하였다. 세포 생존은 트리 판 블루 염색에 의해 정량 하였다. 전체 바이러스 입자는 감염 후를 추출 하였다. 추출 된 RNA는 QRT-PCR에 의해 정량 하였다.

의 전파<em&gt; Homalodisca의 coagulata 바이러스-01</em&gt;를 통해<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; 세포 배양

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

propagation-homalodisca-coagulata-virus-01-via-homalodisca

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

11.7K 조회수.  University of Texas at Tyler.  여기에서 우리는 시험 관내에서 Homalodisca vitripennis 세포와 HoCV-1을 전파하는 프로토콜을 제시한다. 중간 HoCV - 한 긍정적 인 문화에서 제거하고 RNA는 168 시간 동안 매 24 시간을 추출 하였다. 세포 생존은 트리 판 블루 염색에 의해 정량 하였다. 전체 바이러스 입자는 감염 후를 추출 하였다. 추출 된 RNA는 QRT-PCR에 의해 정량 하였다. 

비디오: Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

베로 세포 배양 분석하여 필드 수집 모기에서 감염성 바이러스의 검출

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

연구

면역학 및 감염병학

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

인간 백신 닭 계란에 인플루엔자 바이러스 전파

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

감염증에 대한 모델로 Organoids : 헬리코박터 파이로리의 인간의 문화와 쥐 위장 Organoids 및 미세 주입

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies have been proposed and implemented for the identification of new mediators of TCR signaling, which would improve the understanding of T-cell processes, including activation and thymic selection. We describe a screening assay that enables the identification of molecules that influence TCR signaling based on the activation of developing thymocytes. Strong TCR signals cause developing thymocytes to activate apoptotic machinery in a process known as negative selection. Through the application of kinase inhibitors, those with targets that affect TCR signaling are able to override the process of negative selection. The method detailed in this paper can be used to identify inhibitors of canonical kinases with established roles in the TCR signaling pathways and also inhibitors of new kinases yet to be established in the TCR signaling pathways. The screening strategy here can be applied to screens of higher throughput for the identification of novel druggable targets in TCR signaling.

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

This paper uses a flow-cytometry-based assay to screen libraries of chemical inhibitors for the identification of inhibitors and their targets that influence T-cell receptor signaling. The methods described here can also be expanded for high-throughput screenings.

T 세포 수용 체 신호를 통해 화학 억제제 라이브러리의 심사의 중재자의 식별

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for understanding the function of bacterial cells in the natural environment. Because of technological advances, various bacterial cell functions can be revealed at the single-cell level inside a confined space. GVs are spherical micro-sized compartments composed of amphiphilic lipid molecules and can hold various materials, including cells. In this study, a single bacterial cell was encapsulated into 10&#8211;30 &#956;m GVs by the droplet transfer method and the GVs containing bacterial cells were immobilized on a supported membrane on a glass substrate. Our method is useful for observing the real-time growth of single bacteria inside GVs. We cultured Escherichia coli (E. coli) cells as a model inside GVs, but this method can be adapted to other cell types. Our method can be used in the science and industrial fields of microbiology, biology, biotechnology, and synthetic biology.

We demonstrate single-cell culture of bacteria inside giant vesicles (GVs). GVs containing bacterial cells were prepared by the droplet transfer method and were immobilized on a supported membrane on a glass substrate for direct observation of bacterial growth. This approach may also be adaptable to other cells.

거대한 소포 내부의 단세포 수준에서 세균 세포 배양

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection setting. The presented method is meant to isolate EVs away from virions (i.e., HIV-1), allowing for a higher efficiency and yield compared to conventional ultracentrifugation methods. Our protocol contains three steps: EV precipitation, density gradient separation, and particle capture. Downstream assays (i.e., Western blot, and PCR) can be run directly following particle capture. This method is advantageous over other isolation methods (i.e., ultracentrifugation) as it allows for the use of minimal starting volumes. Furthermore, it is more user friendly than alternative EV isolation methods requiring multiple ultracentrifugation steps. However, the presented method is limited in its scope of functional EV assays as it is difficult to elute intact EVs from our particles. Furthermore, this method is tailored towards a strictly research-based setting and would not be commercially viable.

This protocol isolates extracellular vesicles (EVs) away from virions with high efficiency and yield by incorporating EV precipitation, density gradient ultracentrifugation, and particle capture to allow for a streamlined workflow and a reduction of starting volume requirements, resulting in reproducible preparations for use in all EV research.

바이러스로부터 멀리 떨어진 고수율 세포 외 소포 제제의 정제

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

Measurement of Pulse Propagation Velocity, Distensibility and Strain in an Abdominal Aortic Aneurysm Mouse Model

An abdominal aortic aneurysm (AAA) is defined as a localized dilation of the abdominal aorta that exceeds the maximal intraluminal diameter (MILD) by 1.5 times of its original size. Clinical and experimental studies have shown that small aneurysms may rupture, while a subpopulation of large aneurysms may remain stable. Thus, in addition to the measurement of intraluminal diameter of the aorta, knowledge of structural traits of the vessel wall may provide important information to assess the stability of the AAA. Aortic stiffening has recently emerged as a reliable tool to determine early changes in the vascular wall. Pulse propagation velocity (PPV) along with the distensibility and radial strain are highly useful ultrasound-based methods relevant for assessing aortic stiffness. The primary purpose of this protocol is to provide a comprehensive technique for the use of ultrasound imaging system to acquire images and analyze the structural and functional properties of the aorta as determined by MILD, PPV, distensibility and radial strain.

This manuscript describes a detailed protocol for using high frequency ultrasound imaging to measure luminal diameter, pulse propagation velocity, distensibility and radial strain on a mouse model of abdominal aortic aneurysm.

복부 대동맥류 마우스 모델에서 맥박 전파 속도, 감도 및 변형률 측정

An abdominal aortic aneurysm (AAA) is defined as a localized dilation of the abdominal aorta that exceeds the maximal intraluminal diameter (MILD) by 1.5 ...

Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune system during early development. The Zebrafish Mycobacterium marinum (M. marinum) infection model has been well-established in studying host immune response against mycobacterial infection. It has been suggested that different macrophage cell death types will lead to the diverse outcomes of mycobacterial infection. Here we describe a protocol using intravital microscopy to observe macrophage cell death in zebrafish embryos following M. marinum infection. Zebrafish transgenic lines that specifically label macrophages and neutrophils are infected via intramuscular microinjection of fluorescently labeled M. marinum in either the midbrain or the trunk. Infected zebrafish embryos are subsequently mounted on low melting agarose and observed by confocal microscopy in X-Y-Z-T dimensions. Because long-term live imaging requires using low laser power to avoid photobleaching and phototoxicity, a strongly expressing transgenic is highly recommended. This protocol facilitates the visualization of the dynamic processes in vivo, including immune cell migration, host pathogen interaction, and cell death.

This protocol describes a technique for visualizing macrophage behavior and death in embryonic zebrafish during Mycobacterium marinum infection. Steps for the preparation of bacteria, infection of the embryos, and intravital microscopy are included. This technique may be applied to the observation of cellular behavior and death in similar scenarios involving infection or sterile inflammation.

제브라피시 배아에서 사체내 현미경 검사를 통해 진균 감염 시 대식세포 리액세포 사멸 시 시각화

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Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of disease cases each year. E. aedis causes mortality and reduced reproductive fitness in the mosquito vector and has been explored for its potential as a biocontrol agent. The protocol we present for culturing E. aedis is based on its natural infection cycle, which involves both horizontal and vertical transmission at different life stages of the mosquito host. Ae. aegypti mosquitoes are exposed to spores in the larval stage. These infected larvae then mature into adults and transmit the parasite vertically to their offspring. Infected offspring are then used as a source of spores for future horizontal transmission. Culturing E. aedis can be challenging to the uninitiated given the complexities of the parasite&#8217;s life cycle, and this protocol provides detailed guidance and visual aids for clarification.

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

A protocol to culture the microsporidian parasite Edhazardia aedis. The parasite is passaged from one generation of Aedes aegypti mosquitoes to the next via horizontal transfer at the larval stage followed by vertical transmission at the adult stage. Live sporoplasms survive long-term in infected eggs.

Aedes aegypti 모기에서 현미경 포리디안 기생충 에드hazardia aedis의 전파

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...

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