We would like to acknowledge David O'Brien for his support with data analysis, and all the members of the Canto-Soler lab for their critical discussions. This work was supported by NIH grants EY004859 and EY022631 (MVCS), Core Grant EY1765, and an unrestricted departmental grant from Research to Prevent Blindness, Inc.

Alle in dieser Arbeit beschriebenen Verfahren wurden nach den von der Animal Care und Verwenden Ausschuss empfahl der Johns Hopkins University Richtlinien durchgeführt. 1. Ahead of Time: Herstellung von Instrumenten, Reagenzien und Geschirr <ol><li> Herstellung der Eier: Inkubieren befruchteten White Leghorn Hühnereiern bei 37,5 ° C und 60% relativer Luftfeuchtigkeit für 5 Tage in einem Brutkasten. HINWEIS: Ein Inkubator mit Schaukelkapazität kann hilfreich für die Standardisierung und die Synchronisierung der Embryonalentwicklung, aber Schaukel ist für den Ausgang dieses Protokoll unbedingt erforderlich. </li><li> Plasmidpräparation: <ol><li> Design Plasmidkonstrukt zur Gen-Überexpression oder Herunterregulierung (zum Beispiel durch die Verwendung von RNAi-Technik 1,34) je nach Bedarf. Fügen Sie ein Reporter-Gen (wie EGFP, RFP oder LacZ) in dem Konstrukt, wann immer möglich. HINWEIS: Einige häufig verwendete Promotoren, wie CMV, kann nach der Zeit zum Schweigen gebracht zu werden. Die CAG promotER (Huhn-beta-Aktin-Promotor CMV-Enhancer) ist eine sehr gute Alternative, eine effiziente langfristige Expression des Gens von Interesse 35-37. </li><li> Vorbereitung einer Plasmid-Lösung bei einer Konzentration von 1,5 ug / ul in sterilem PBS. OPTIONAL: Bereiten Plasmid-Lösung vor der Zeit und bewahren Sie sie eingefroren, bis gebrauchsfertig. HINWEIS: Höhere Plasmid-Konzentrationen nicht zu einer signifikanten Steigerung der Effizienz führen, wohingegen mit niedrigeren Plasmid-Konzentrationen senken die Transfektionseffizienz 1. </li></ol></li><li> Elektroden: <ol><li> Für die Anode Verwendung einer dicken Gold gekippt Elektrode (siehe Tabelle spezifischer Materialien / Ausrüstung). Wischen Sie mit 70% Ethanol. HINWEIS: Isolierung des Gold gekippt Elektrode, so dass etwa 0,5 mm ausgesetzt sind, ist es ratsam, um ein Auslaufen des elektrischen Stroms zu minimieren. Informationen für Isoliermaterial kann in Tabelle spezifischer Materialien gefunden werden. </li><li> Machen Sie eine Kathode aus einem 2,5 mm Quadrat box Filament, 4,5 mm breit (in der Regel in der Mikropipette Abzieher verwendet). Mit Hilfe einer Pinzette, lösen Sie die quadratische Box und strecken Filaments in einem langen Streifen. Klicken Sie dann unter Dissektionsmikroskop und mit einem Lineal als Führung, biegen Sie das Filament in eine quadratische U-Form 3 mm lang an der Basis und 2 mm hoch auf einer Seite, mit der anderen Seite die verbleibende Länge des Fadens (Abbildung 1 , C - D). Mit einer Pinzette, tauchen Sie die Elektrode in 96% Ethanol und Flamm zu sterilisieren. Bringen Sie dann eine elektrische Leitung mit einer kleinen Krokodilklemme mit dem längeren Arm der Elektrode. </li></ol></li><li> Elektroporationskammer Setup: <ol><li> Vorbereitung der Elektroporation Kammer durch Schneiden des Deckels einer sterilen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und Befestigen darauf flachen Seite nach unten auf eine 100 mm Petrischale mit Klebeband (1E). Hinweis: andere Behälter in Form eines gut ähnlicher Größe funktionieren würde; ist jedoch ein Mikrozentrifugenröhrchen Deckel leicht zugänglich und autoklavierbar. Der Brunnenmuss groß genug sein, um ein Küken Auge und Kathodenelektrode Haus, aber nicht so groß sein, daß sie zu einer Verschwendung von Plasmid-Lösung führen. </li></ol></li></ol> 2. Ex ovo Elektroporation Ordnung <ol><li> Vorbereitung des Instruments: <ol><li> Sterilisieren Mikrodissektion Werkzeuge (2 Paar große gebogene Moloney Zange zum Öffnen von Eierschalen und Aushöhlungen Embryonen, 2 Paar Feinspitze gekrümmt Dumont Pinzetten zum Entfernen von RPE, ein Paar Bonn gezahnten Pinzette zur Entfernung von Linse und Glas) durch Eintauchen des Tipps in 96% Ethanol und flammenden. Saubere Dissektion Umfang mit Tüchern in 70% Ethanol getaucht. Warm eine Flasche sterile Calcium-Magnesium-freien Hanks Balanced Salt Solution (CMF-HBSS) in einem 37 ° C Wasserbad. Füllen 100 mm sterile Petrischalen bis zu 3/4 mit warmen CMF-HBSS. </li><li> Zeigen Elektroporationskammer unter einem anderen sauberen Dissektionsmikroskop füllen und mit 120 ul von Plasmid-Lösung. Verbinden Elektroden Elektroporationseinrichtung, so dasssicher maßgeschneiderte Elektrode ist mit dem negativen Pol verbunden und Gold gekippt Elektrode an den positiven Pol. </li></ol></li><li> Embryo-Kollektion: <ol><li> Reinigen Sie die Eier durch Abwischen Muscheln mit Tüchern in 70% Ethanol benetzt. Pflegen sterile Verfahren für den Rest des Protokolls zu vermeiden, tragen Verschmutzung in die Kulturen. Verwenden von großen gekrümmten Moloney Zange ein Loch in der Eierschale vorsichtig öffnen durch leichtes Antippen auf der abgerundeten Spitze von einem Ei (über der Luftkammer) und dann Greifen und Herausziehen Schalenstücke. </li><li> Mit einer anderen Pinzette entfernen, Membranen und sammeln Embryos durch Schöpfen sie aus dem Ei (darauf achten, daß der Embryo schädigen). Legen Sie sie in eine Schüssel mit CMF-HBSS. HINWEIS: Sammeln Sie so viele Embryonen wie nötig, um die gewünschte Anzahl von Netzhaut-Tassen für Elektroporation zu erhalten, wie in 2.4.4 festgelegt </li><li> Entscheidender Schritt: Stufe werden die Embryonen nach Hamburger und Hamilton 38. WICHTIG: Um eine optimale Effizienz Embryonen zu erhaltenmuss im Stadium 27 (2A) zu sein. </li><li> Euthanize die Embryonen durch Enthauptung mit Moloney Pinzette. </li></ol></li><li> Beziehen Retinal Cups: <ol><li> Mit feinen Dumont Pinzetten vorsichtig entkernen die Augen und Transfer zu einem neuen CMF-HBSS Gericht. </li><li> Ausgehend von dem hinteren Teil jedes Auge, in der Nähe des Sehnervenkopfes und unter Verwendung von zwei feinen Dumont Pinzetten, präsentieren eine Spitze jedes Pinzette zwischen der neuronalen Netzhaut und RPE und sorgfältig sezieren die RPE vorsichtig zu sein, um nicht die Nervenschäden Netzhaut (2B). HINWEIS: Der Mangel an Ca 2+ und Mg 2+ in der Lösung wird die RPE Herauslösen aus dem neuronalen Netzhaut leichter. </li></ol></li><li> Elektroporation: <ol><li> Parameter Elektroporator eingestellt bis 5 Rechteckimpulse von 15 Volt, 50 ms Dauer und 950 ms-Intervall zu liefern. Platz U-förmige negative Elektrode im Inneren Elektroporationskammer (Mikrozentrifugendeckel filled mit 120 ul von Plasmid-enthaltenden Lösung). </li><li> Verwendung gekrümmt Dumont Pinzetten Übertragung einer Netzhautbecher an die Elektroporation Kammer (mit einer Schöpfkelle, nicht drücken), und legen Sie sie im Inneren des U-förmigen Elektrode, mit dem hinteren Teil der Netzhaut in Richtung der Unterseite der Elektrode und dem Objektiv nach oben ( 2D). </li><li> Legen Sie die Anode, so dass sie den vorderen Teil des Auges berührt, neben dem Objektiv, und mit Hilfe der Elektroporator die Fußpedal den gewünschten elektrischen Impulsen. </li><li> Übertragen elektroporiert retinalen Bechers an eine neue Petrischale mit CMF-HBSS und wiederholen Elektroporationsverfahren mit jedem der übrigen Netzhautschalen. HINWEIS: Bis zu 6 retinalen Becher können mit dem gleichen Plasmid Lösung ohne signifikante Einbußen der Transfektionseffizienz elektroporiert werden. </li><li> Entfernen Sie die Linse und Glaskörper jeder Elektroporation Netzhautbecher durch Greifen sie mit Bonn Zahnzange und leichtes Ziehen durch ter Öffnung Schüler weitergegeben, während das Auge an Ort und Stelle mit der Rückseite der gekrümmten Dumont Pinzetten halten. </li><li> Fahren Sie mit der Dissoziation und Kultur der Elektroporation Netzhautzellen nach Standardverfahren. HINWEIS: Für eine detaillierte Protokoll auf der Dissoziation und Kultur der Küken Netzhautzellen beziehen sich auf Vergara und Canto-Soler, 2012 Weitere Datei 4 21 In diesem Protokoll werden die Zellen bei geringer Dichte auf Polyornithin beschichteten 6-Well-Platten oder 35 ausgesät. -mm Gerichte (6 x 10 5 Zellen / 35 mm-Durchmesser gut oder Schale). Das verwendete Medium ist Medium 199 mit Penicillin / Glutamin, 10% fötalem Kälberserum (FCS) und Linolsäure-BSA bei 100 &amp; mgr; g / ml. Die Kulturen werden in einem befeuchteten Inkubator bei 37ºC mit 5% CO 2 gehalten. Mit dieser Vorgehensweise 5 - kann 6 x 10 6 Zellen in der Regel pro jeder Stufe 27 elektroporiert Auge erhalten werden. HINWEIS: Im Idealfall sollte nicht mehr als 3 Stunden zwischen Embryo-Entnahmeeinheiten und Zellbeschichtung übergeben, um eine gute Zelle Überleben zu sichernund minimieren Stress. Ein typisches Timing für Beobachtung und weiteren Analyse ist nach 4 Tagen in Kultur, da an dieser Stelle die Zellen guten morphologischen und molekularen Differenzierung erreicht und das Überleben ist immer noch hoch. </li></ol></li></ol>

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	<li>Vergara, M. N., Gutierrez, C., O'Brien, D. R., Canto-Soler, M. 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The authors declare that they have no competing financial interests or other conflicts of interest.

Der kritischste Schritt für den Erfolg dieses Protokolls ist die Auswahl des geeigneten Stadium der Embryonen. In früheren Veröffentlichungen wird ein Bereich von Embryonalstadien für diesen Kulturen gegeben, die typischerweise von den Tagen Inkubation oder embryonale Tage (ED) definiert sind; somit ist es in der Regel davon ausgegangen, dass die Verwendung von ED 5 bis ED 6 Embryonen zu vergleichbaren Ergebnissen führen. Wir haben jedoch gefunden, dass auf der Bühne 27 (ED &amp; sub5;), wird die Transfektionseffi...

Dissoziierten Zellkulturen von embryonalen Hühnernetzhaut wurden allgemein verwendet, um verschiedene Aspekte der Photorezeptor Zellbiologie, einschließlich deren Überleben 2-9, Differenzierung 10-12, Neuritenwachstum 13 und mehr zu studieren. Die Vorteile dieses Systems, in den 1980er Jahren von Ruben Adler und Mitarbeiter entwickelt und von seinem und anderen Gruppen 14-20, perfektioniert liegen in den intrinsischen Eigenschaften des Kükens als Tiermodell 21. Die Größe des Hühnerauge, auch bei embryonalen Stadien, bietet große Mengen an Material für Kulturen. Außerdem, wenn Kulturen mit embryonalen Tag (ED) durchgeführt 5 - 6 Retinae, 55 - 80% ihrer Vorläuferzellen zu differenzieren, wie Photorezeptoren, 14,15,18,22,23, und da etwa 86% der Photorezeptoren in diesem Tier sind Kegel 24 sind diese Kulturen besonders geeignet für die Studien, die sich auf dieser Zelltyp. Wir haben vor kurzem developed und dadurch eine einfache Technik, die für hocheffiziente Plasmid Transfektion der Zellen in diesen Kulturen ermöglicht, wodurch die Erweiterung der Nützlichkeit dieses Systems durch Erleichterung genetische Studien missexpression 1. Die Entwicklung dieser Technik ergab sich aus einem Hohlraum in der wissenschaftlichen Literatur von Methoden, die ein akzeptables Niveau der Transfektion bereitstellen würde, um für die Untersuchung der Gen-Funktion in einer Zelle autonom zu ermöglichen. Dies ist zum Teil, weil primären neuronalen Kulturen sind notorisch schwer zu transfizieren 25,26. Einige der am häufigsten verwendeten Techniken, die zuvor für diesen Zweck zur Verfügung enthalten chemische Transfektionsverfahren wie Lipofektion oder Calciumphosphat-vermittelte Transfektion, die in Wirkungsgrade in der Grßenordnung von 3-5% führen und kann beträchtliche Toxizität 27-32 auszuüben. Obwohl die Verwendung von Plasmiden mit einem enzymatischen Reporter-Systems kann das Problem der schlechten Transfektionseffizienz durch Verstärken des Signals zu umgehen, sie nichtdiskriminieren zellspezifische Wirkungen, und ihre Ergebnisse werden auf einer kleinen Zellpopulation, die nicht repräsentativ für die gesamte erweisen. Eine andere weit verbreitete Methode in der Küken, RCAS Virus-Infektion, ist nur auf proliferierende Zellen anwendbar und somit nicht für diese primäre Netzhautkultursystem 33 geeignet ist. Im aktuellen Protokoll embryonalen Hühneraugen werden in Stadium 27 (ED &amp; sub5;), der retinalen Pigmentepithel (RPE) wird entfernt, und das Netzhautbecher in einer Elektroporationsküvette Kammer mit einem Plasmid enthaltenden Lösung gefüllt war enukleiert und Elektroporation mit maßgeschneiderten Elektroden, gefolgt von retinalen Dissoziation und Kultur unter Verwendung von Standardtechniken 21. Nach der Optimierung dieses Verfahrens waren wir, ohne die Überlebensrate und Differenzierungsmerkmale der Lage zu Transfektionseffizienzen erzielen durchweg in der Größenordnung von 22% der Gesamtzahl der Zellen in der Kultur und 25% innerhalb der Photorezeptorpopulation AlleinKulturen 1. Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll umreißt alle wichtigen Schritte dieses Verfahrens, um den Erfolg und die Reproduzierbarkeit dieser Technik zu gewährleisten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ECM 830 Electro Square Porator</td>
			<td>BTX/ Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip</td>
			<td>BTX/ Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0115 model 512</td>
			<td>Gold tipped electrode used as anode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyimide Tubing</td>
			<td>Vention Medical</td>
			<td>custom made</td>
			<td>Internal Diameter: 0.5mm / wall thickness: 0.15-0.2mm. Used for insulating gold tiped electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5mm square box filament, 4.5mm wide</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>FB245B</td>
			<td>Used to make cathode electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco - Life Technologies</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moloney forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-8254</td>
			<td>Serrated; Slight Curve; 4.5&#34; Length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont tweezers 5/45</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5058</td>
			<td>Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn micro forceps, 1x2 teeth</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5172</td>
			<td>Tying Platform; 1X2 Teeth, 0.12mm Teeth; 3.75&#34; Length; .3mm Tip Width</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient gene transfer in chick retinas for primary cell culture studies: an ex-ovo electroporation approach

Die Kegelphotorezeptor-angereicherten Kulturen von embryonalen Hühnernetzhaut abgeleitet sind zu einem unverzichtbaren Werkzeug für Forscher auf der ganzen Welt das Studium der Biologie der Netzhautneuronen, insbesondere Photorezeptoren. Die Anwendungen dieses Systems gehen über die Grundlagenforschung, da sie leicht zu Hochdurchsatztechnologien zur Wirkstoffentwicklung angepasst werden. Jedoch genetische Manipulation von retinalen Photorezeptoren in diesen Kulturen hat sich als sehr schwierig, sie eine erhebliche Einschränkung für die Nützlichkeit des Systems. Wir haben vor kurzem entwickelt und validiert eine ex ovo Plasmid Elektroporationstechnik die die Rate der Transfektion von Retinazellen in diesen Kulturen erhöht durch das Fünffache im Vergleich zu anderen gegenwärtig verfügbaren Protokolle 1. Bei diesem Verfahren embryonalen Hühneraugen an Stufe 27 ausgeschält, die RPE wird entfernt, und das Netzhautbecher wird in einem Plasmid-haltigen Lösung gegeben und elektroporiert Verwendung einfach aufgebaut Kundenhergestellten Elektroden. Die Netzhaut werden dann dissoziiert und kultiviert Verwendung von Standardverfahren. Diese Technik kann durch die Verwendung von Plasmid-driven RNAi-Technologie zu Expressionsstudien sowie zu der Herunterregulierung der Genexpression verwendet werden, zum Beispiel, allgemein erzielen die Transgen-Expression in 25% der Photorezeptorpopulation. Das Videoformat der vorliegenden Veröffentlichung wird diese Technologie leicht zugänglich für Forscher auf dem Gebiet zu machen, so dass die Untersuchung von Gen-Funktion in der primären Netzhautkulturen. Wir haben auch detaillierte Erläuterungen der kritischen Schritte dieses Verfahrens für ein erfolgreiches Ergebnis und Reproduzierbarkeit.

Hier präsentieren wir ein einfaches Protokoll für Plasmidtransfektion in entkernte Küken Netzhautbecher für nachfolgende dissoziierten Zellkultur. Transfektion durch Elektroporation unter Verwendung einfach individuelle Elektroden (- 2 Die Zahlen 1) Nutzen erzielt. Die in diesem Protokoll beschriebenen Parameter optimiert wurden Transfektionseffizienzen zwischen 20 und 27% (mit einem Durchschnitt von 22%) (Figur 3D) Bereich zu erhalten. Bemerken, dass bei den oben genannten Gründen...

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Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonale Küken Netzhautzellkulturen stellen wertvolle Werkzeuge für das Studium der Photorezeptorbiologie. Wir haben ein effizientes Gentransfertechnik, die auf ex ovo Elektroporation von Plasmid der Netzhaut vor der Kultur entwickelt. Diese Technik wesentlich erhöht Transfektionseffizienzen über derzeit verfügbaren Protokolle, was die genetische Manipulation möglich für dieses System.

Effizienten Gentransfer in Küken Netzhäute für primäre Zellkulturstudien: Eine<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Elektroporation Ansatz

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

efficient-gene-transfer-chick-retinas-for-primary-cell-culture

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

8.1K Aufrufe.  The Johns Hopkins University School of Medicine.  Embryonale Küken Netzhautzellkulturen stellen wertvolle Werkzeuge für das Studium der Photorezeptorbiologie. Wir haben ein effizientes Gentransfertechnik, die auf ex ovo Elektroporation von Plasmid der Netzhaut vor der Kultur entwickelt. Diese Technik wesentlich erhöht Transfektionseffizienzen über derzeit verfügbaren Protokolle, was die genetische Manipulation möglich für dieses System. 