We would like to acknowledge David O'Brien for his support with data analysis, and all the members of the Canto-Soler lab for their critical discussions. This work was supported by NIH grants EY004859 and EY022631 (MVCS), Core Grant EY1765, and an unrestricted departmental grant from Research to Prevent Blindness, Inc.

כל הנהלים שתוארו בעבודה זו בוצעו על פי ההנחיות המומלצת על ידי הטיפול בבעלי החיים ושימוש הוועדה באוניברסיטת ג&#39;ונס הופקינס. 1. לפני זמן: הכנת מכשירים, ריאגנטים ומנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת הביצים: ביצי דגירה עוף הלבן ליבורנו מופרה ב37.5 מעלות צלזיוס ו -60% לחות יחסית במשך 5 ימים בחממת ביצה. הערה: חממה עם הנדנדה קיבולת עשויה להיות מועיל לתקנון וסנכרון התפתחות עוברית, אבל הנדנדה היא לא הכרחי לתוצאה של פרוטוקול זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלסמיד הכנה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלסמיד העיצוב לבנות לביטוי יתר של גן או downregulation (למשל באמצעות השימוש בטכנולוגית RNAi 1,34) לפי צורך. כולל גן כתב (כגון EGFP, RFP או LacZ) במבנה בכל הזדמנות אפשרית. הערה: חלק יזמים נפוצים כגון CMV, יכולים להיות מושתקים לאחר הזמן. Promot CAGאה (בטא-אקטין עוף עם אמרגן משפר CMV) הוא אלטרנטיבה טובה מאוד, מתן ביטוי לטווח ארוך יעיל של הגן של העניין 35-37. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון פלסמיד בריכוז של 1.5 מיקרוגרם / μl בPBS סטרילי. אופציונאלי: הכן פתרון פלסמיד מראש ולאחסן אותו קפוא עד מוכן לשימוש. הערה: ריכוזים גבוהות פלסמיד לא לגרום לעלייה משמעותית ביעילות, ואילו שימוש בריכוזים נמוכים פלסמיד להוריד את יעילות transfection 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרודות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשימוש האנודה זהב עבה הטה אלקטרודה (ראה טבלה של חומרים / ציוד ספציפי). נקה עם אתנול 70%. הערה: בידוד של הזהב הטה אלקטרודה, עוזב כ 0.5 מ&quot;מ החשוף, מומלץ למזעור זליגה של הזרם החשמלי. ניתן למצוא מידע על חומר בידוד בטבלה של חומרים ספציפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך קתודה מב מרובע 2.5 מ&quot;מנימה שור, רחבה 4.5 מ&quot;מ (משמשת בדרך כלל במושכי micropipette). בעזרת מלקחיים, לבטל את התיבה מרובעת וליישר נימה לתוך רצועה ארוכה. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ לנתיחה ובאמצעות סרגל כמדריך, לכופף את החוט לצורת ריבוע &#39;U&#39; ארוכה 3 מ&quot;מ בבסיס ו -2 מ&quot;מ גבוה בצד אחד, עם צד האורך הנותר של חוט הלהט (איור 1 האחר , C - D). בעזרת מלקחיים, לטבול את האלקטרודה ב 96% אתנול ולהבה לעקר. לאחר מכן לצרף את יתרון חשמלי עם קליפ תנין קטן לזרוע הארוכה של האלקטרודה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנת Electroporation הלשכה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין את חדר electroporation על ידי חיתוך את המכסה של צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר סטרילי והדביק אותו בצד, שטוח למטה, לקלטת באמצעות 100 מ&quot;מ צלחת פטרי (איור 1E). הערה: מיכל אחר בצורה של גם של גודל דומה יעבוד; עם זאת, מכסה צינור microcentrifuge נגיש בקלות וautoclavable. הבארחייב להיות גדול מספיק כדי לאכלס אלקטרודה העין חומוס והקתודה, אבל לא כל כך גדול כמו לגרום לבזבוז של פתרון פלסמיד. </li></ol></li></ol> 2. אקס אוב Electroporation נוהל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של מכשירים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר כלים מיקרו לנתיחה (2 זוגות מלקחיים מעוקלים מולוני הגדולים לפתיחת קליפות ביצים וגורפים את עוברים, 2 זוגות עדין קצה המעוקל פינצטה דומון להסרת הרשתית, זוג אחד של בון שיניים מלקחיים לעדשת הסרת וזגוגית) על ידי הטבילה טיפים ב 96% אתנול ולוהט. היקף נתיחה נקי באמצעות מגבונים טבולים באתנול 70%. לחמם בקבוק של תמיסת מלח מאוזנת של האנק סידן-מגנזיום ללא סטרילי (CMF-HBSS) באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. מלא 100 מ&quot;מ צלחות פטרי סטרילית ל3/4 מלא עם CMF-HBSS החם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח תא electroporation תחת מיקרוסקופ לנתיחה אחר נקי ומלא עם 120 μl של פתרון פלסמיד. חבר אלקטרודות למנגנון electroporation, מה שהופך אתאלקטרודה מחוייט בטוחה מחוברת לקוטב השלילי וזהב הטה אלקטרודה לקוטב החיובי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוסף עובר: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את הביצים על ידי מנגב פגזים עם מגבונים הרטוב באתנול 70%. לשמור על הליך סטרילי בכל שאר הפרוטוקול להתחמק מביצוע זיהום לתרבויות. בעזרת מלקחיים מעוקלים מולוני גדולים לפתוח בזהירות חור בקליפת הביצה בעדינות על ידי הקשה על הקצה המעוגל של ביצה (מעל תא האוויר) ולאחר מכן מרתק ומושכים את חתיכות קליפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם עוד זוג מלקחיים להסיר קרומים ולאסוף עובר על ידי גורף מתוך הביצה זה (נזהר שלא לפגוע בעובר). מניחים אותו בצלחת עם CMF-HBSS. הערה: איסוף עובר לפי צורך כדי לקבל את המספר הרצוי של כוסות רשתית לelectroporation כמפורט ב2.4.4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב קריטי: שלב העוברים על פי המבורגר והמילטון 38. הערה: לקבלת עוברי יעילות אופטימליותחייב להיות בשלב 27 (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העוברים על ידי עריפת ראש באמצעות מלקחיים מולוני. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבלת כוסות רשתית: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פינצטה דומון בסדר, enucleate בזהירות את העיניים ולהעביר לצלחת CMF-HBSS חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מהחלק האחורי של כל עין, קרובה לראש עצב הראייה, ובאמצעות שתי פינצטה דומון בסדר, להציג קצה אחד של כל פינצטה בין הרשתית העצבית ורשתית ובזהירות לנתח את הרשתית להיות זהירה כדי לא לגרום נזק לעצבים רשתית (איור 2). הערה: חוסר Ca 2 + וMg 2 + בפתרון יעזור לי הרשתית להתנתק מהרשתית העצבית בקלות רבה יותר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electroporation: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת הפרמטרים של electroporator לספק 5 פולסים מרובעים של 15 וולט, 50 משך msec, ומרווח 950 אלפיות שני. מקום &#39;U&#39; בצורת האלקטרודה שלילית בתוך תא electroporation (מילוי המכסה microcentrifugeאד עם 120 μl של פתרון המכיל פלסמיד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פינצטה דומון המעוקל באמצעות העברת כוס רשתית אחד לתא electroporation (על ידי גורף, לא לחיצה), ולמקם אותו בתוך האלקטרודה בצורה &#39;U&#39;, עם החלק האחורי של הרשתית לכיוון החלק התחתון של האלקטרודה ואת העדשה כלפי מעלה ( איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את האנודה, כך שהוא נוגע בחלק הקדמי של העין, בסמוך לעדשה, ובאמצעות דוושת הרגל של electroporator לספק פולסים חשמליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את כוס רשתית electroporated לצלחת פטרי חדשה עם CMF-HBSS וחזור על הליך electroporation עם כל אחד מכוסות הרשתית שנותרו. הערה: עד 6 כוסות רשתית ניתן electroporated עם אותו פתרון פלסמיד ללא ירידה משמעותית ביעילות transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העדשה וגוף הזגוגי של כל כוס רשתית electroporated על ידי אחיזתם עם מלקחיים שיני בון ומשייכתו בעדינות באמצעות tהוא תלמיד פתיחה תוך החזקת עין במקום בגב פינצטה דומון המעוקל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לניתוק והתרבות של התאים ברשתית electroporated הבאים נהלים סטנדרטיים. הערה: לפרוטוקול מפורט על הניתוק והתרבות של תאים ברשתית חומוס מתייחס לVergara וקנטו-סולר, 2012, קובץ נוסף 4 21 בפרוטוקול זה התאים הם זורעים בצפיפות נמוכה על 6 צלחות היטב מצופה polyornithine או 35. מנות -mm (6 x 10 5 תאים / 35 מ&quot;מ בקוטר טוב או צלחת). הבינוני משמש הוא בינוני 199 עם פניצילין / גלוטמין, 10% בסרום עגל עוברי (FCS), והחומצה לינולאית-BSA ב 100 מיקרוגרם / מיליליטר. התרבויות נשמרות בחממה 37 ° C humidified עם 5% CO 2. באמצעות הליך זה, 5 - יכול בדרך כלל לקבל 6 x 10 6 תאים לכל עין electroporated שלב 27. הערה: באופן אידיאלי, לא יותר מ 3 שעות צריכה לעבור בין אוסף עובר וציפוי תא, כדי להבטיח את הישרדות תא טובהולמזער את המתח. תזמון אופייני להתבוננות וניתוח נוסף הוא אחרי 4 ימים בתרבות, מאחר שבשלב זה התאים השיגו בידול מורפולוגיים ומולקולרי טוב וההישרדות היא עדיין גבוהה. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Vergara, M. N., Gutierrez, C., O'Brien, D. R., Canto-Soler, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+electroporation+of+retinal+cells:+a+novel,+high+efficiency+method+for+functional+studies+in+primary+retinal+cultures.">Ex vivo electroporation of retinal cells: a novel, high efficiency method for functional studies in primary retinal cultures.</a> Exp Eye Res. 109, 40-50 (2013).</li><li>Chalmel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-derived+Cone+Viability+Factor-2+is+a+novel+bifunctional-thioredoxin-like+protein+with+therapeutic+potential.">Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential.</a> BMC Mol Biol. 8, 74 (2007).</li><li>Goureau, O., Regnier-Ricard, F., Desire, L., Courtois, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+nitric+oxide+in+photoreceptor+survival+in+embryonic+chick+retinal+cell+culture.">Role of nitric oxide in photoreceptor survival in embryonic chick retinal cell culture.</a> J Neurosci Res. 55 (4), 423-431 (1999).</li><li>Hewitt, A. T., Lindsey, J. D., Carbott, D., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+survival-promoting+activity+in+interphotoreceptor+matrix+preparations:+characterization+and+partial+purification.">Photoreceptor survival-promoting activity in interphotoreceptor matrix preparations: characterization and partial purification.</a> Exp Eye Res. 50 (1), 79-88 (1990).</li><li>Leveillard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+rod-derived+cone+viability+factor.">Identification and characterization of rod-derived cone viability factor.</a> Nat Genet. 36, 755-759 (2004).</li><li>Lorentz, O., Sahel, J., Mohand-Said, S., Leveillard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cone+survival:+identification+of+RdCVF.">Cone survival: identification of RdCVF.</a> Adv Exp Med Biol. 572, 315-319 (2006).</li><li>Nakamura, M., Singh, D. P., Kubo, E., Chylack Jr, L. T., Shinohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LEDGF:+survival+of+embryonic+chick+retinal+photoreceptor+cells.">LEDGF: survival of embryonic chick retinal photoreceptor cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (5), 1168-1175 (2000).</li><li>Paes-de-Carvalho, R., Maia, G. A., Ferreira, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+regulates+the+survival+of+avian+retinal+neurons+and+photoreceptors+in+culture.">Adenosine regulates the survival of avian retinal neurons and photoreceptors in culture.</a> Neurochem Res. 28 (10), 1583-1590 (2003).</li><li>Stenkamp, D. L., Gregory, J. K., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoid+effects+in+purified+cultures+of+chick+embryo+retina+neurons+and+photoreceptors.">Retinoid effects in purified cultures of chick embryo retina neurons and photoreceptors.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (8), 2425-2436 (1993).</li><li>Fuhrmann, S., Kirsch, M., Hofmann, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+neurotrophic+factor+promotes+chick+photoreceptor+development+in+vitro.">Ciliary neurotrophic factor promotes chick photoreceptor development in vitro.</a> Development. 121 (8), 2695-2706 (1995).</li><li>Toy, J., Norton, J. S., Jibodh, S. R., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+homeobox+genes+on+the+differentiation+of+photoreceptor+and+nonphotoreceptor+neurons.">Effects of homeobox genes on the differentiation of photoreceptor and nonphotoreceptor neurons.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (11), 3522-3529 (2002).</li><li>Yan, R. T., He, L., Wang, S. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-photoreceptor+activity+of+chick+neurogenin1.">Pro-photoreceptor activity of chick neurogenin1.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (12), 5567-5576 (2009).</li><li>Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neurite+growth+in+purified+retina+neuronal+cultures:+Effects+of+PNPF,+a+substratum-bound,+neurite-promoting+factor.">Regulation of neurite growth in purified retina neuronal cultures: Effects of PNPF, a substratum-bound, neurite-promoting factor.</a> J Neurosci Res. 8 (2-3), 165-177 (1982).</li><li>Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+retinal+cell+differentiation+in+the+chick+embryo.">A model of retinal cell differentiation in the chick embryo.</a> Prog Retin Eye Res. 19 (5), 529-557 (2000).</li><li>Adler, R., Hatlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+and+differentiation+of+embryonic+retinal+cells+after+terminal+mitosis.">Plasticity and differentiation of embryonic retinal cells after terminal mitosis.</a> Science. 243 (4889), 391-393 (1989).</li><li>Adler, R., Lindsey, J. D., Elsner, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+cone-like+properties+by+chick+embryo+neural+retina+cells+in+glial-free+monolayer+cultures.">Expression of cone-like properties by chick embryo neural retina cells in glial-free monolayer cultures.</a> J Cell Biol. 99 (3), 1173-1178 (1984).</li><li>Adler, R., Magistretti, P. J., Hyndman, A. G., Shoemaker, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+cytochemical+identification+of+neuronal+and+non-neuronal+cells+in+chick+embryo+retina+cultures.">Purification and cytochemical identification of neuronal and non-neuronal cells in chick embryo retina cultures.</a> Dev Neurosci. 5 (1), 27-39 (1982).</li><li>Belecky-Adams, T., Cook, B., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlations+between+terminal+mitosis+and+differentiated+fate+of+retinal+precursor+cells+in+vivo+and+in+vitro:+analysis+with+the+'window-labeling'+technique.">Correlations between terminal mitosis and differentiated fate of retinal precursor cells in vivo and in vitro: analysis with the 'window-labeling' technique.</a> Dev Biol. 178 (2), 304-315 (1996).</li><li>Hyndman, A. G., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+retina+development+in+vitro.+Effects+of+tissue+extracts+on+cell+survival+and+neuritic+development+in+purified+neuronal+cultures.">Neural retina development in vitro. Effects of tissue extracts on cell survival and neuritic development in purified neuronal cultures.</a> Dev Neurosci. 5 (1), 40-53 (1982).</li><li>Politi, L. E., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+enriched+populations+of+cultured+photoreceptor+cells.">Generation of enriched populations of cultured photoreceptor cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 27 (5), 656-665 (1986).</li><li>Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rediscovering+the+chick+embryo+as+a+model+to+study+retinal+development.">Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development.</a> Neural Dev. 7, 22 (2012).</li><li>Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+cellular+types+in+the+retina.">Determination of cellular types in the retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1677-1682 (1993).</li><li>Repka, A., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+retinal+precursor+cells+born+in+vitro.">Differentiation of retinal precursor cells born in vitro.</a> Dev Biol. 153 (2), 242-249 (1992).</li><li>Morris, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+in+a+receptor+mosaic+demonstrated+in+the+chick+from+the+frequencies,+spacing+and+arrangement+of+the+types+of+retinal+receptor.">Symmetry in a receptor mosaic demonstrated in the chick from the frequencies, spacing and arrangement of the types of retinal receptor.</a> J Comp Neurol. 140 (3), 359-398 (1970).</li><li>Li, H., Chan, S. T. H., Tang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+rat+brain+cells+by+electroporation.">Transfection of rat brain cells by electroporation.</a> J Neurosci Methods. 75 (1), 29-32 (1997).</li><li>Martinez, C. Y., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+primary+central+and+peripheral+nervous+system+neurons+by+electroporation.">Transfection of primary central and peripheral nervous system neurons by electroporation.</a> Methods Cell Biol. 71, 339-351 (2003).</li><li>Boatright, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+5'+flanking+regions+of+IRBP+and+arrestin+have+promoter+activity+in+primary+embryonic+chicken+retina+cell+cultures.">The 5' flanking regions of IRBP and arrestin have promoter activity in primary embryonic chicken retina cell cultures.</a> Exp Eye Res. 64 (2), 269-277 (1997).</li><li>Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+phosphate+transfection+of+DNA+into+neurons+in+primary+culture.">Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture.</a> Curr Protoc Neurosci. Chapter 3, Unit 3.11 (2001).</li><li>Kumar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bZIP+transcription+factor+Nrl+stimulates+rhodopsin+promoter+activity+in+primary+retinal+cell+cultures.">The bZIP transcription factor Nrl stimulates rhodopsin promoter activity in primary retinal cell cultures.</a> J Biol Chem. 271 (47), 29612-29618 (1996).</li><li>Toy, J., Bradford, R. L., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-mediated+gene+transfection+into+chick+embryo+retinal+cells+in+ovo+and+in+vitro.">Lipid-mediated gene transfection into chick embryo retinal cells in ovo and in vitro.</a> J Neurosci Methods. 104 (1), 1-8 (2000).</li><li>Werner, M., Madreperla, S., Lieberman, P., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+transfected+genes+by+differentiated,+postmitotic+neurons+and+photoreceptors+in+primary+cell+cultures.">Expression of transfected genes by differentiated, postmitotic neurons and photoreceptors in primary cell cultures.</a> J Neurosci Res. 25 (1), 50-57 (1990).</li><li>Yuan, L., Kawada, M., Havlioglu, N., Tang, H., Wu, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+PRPF31+inhibit+pre-mRNA+splicing+of+rhodopsin+gene+and+cause+apoptosis+of+retinal+cells.">Mutations in PRPF31 inhibit pre-mRNA splicing of rhodopsin gene and cause apoptosis of retinal cells.</a> J Neurosci. 25 (3), 748-757 (2005).</li><li>Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RCAS+vector+system.">The RCAS vector system.</a> Folia Biol (Praha). 50 (3-4), 107-119 (2004).</li><li>Das, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+system+for+RNA+interference+in+the+chicken+using+a+modified+microRNA+operon.">A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon.</a> Dev Biol. 294 (2), 554-563 (2006).</li><li>Nguyen, A. T., Dow, A. C., Kupiec-Weglinski, J., Busuttil, R. W., Lipshutz, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+gene+promoters+for+liver+expression+by+hydrodynamic+gene+transfer.">Evaluation of gene promoters for liver expression by hydrodynamic gene transfer.</a> J Surg Res. 148 (1), 60-66 (2008).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CMV-beta-actin+promoter+directs+higher+expression+from+an+adeno-associated+viral+vector+in+the+liver+than+the+cytomegalovirus+or+elongation+factor+1+alpha+promoter+and+results+in+therapeutic+levels+of+human+factor+X+in+mice.">CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice.</a> Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).</li><li>You, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hybrid+promoter-containing+vector+for+direct+cloning+and+enhanced+expression+of+PCR-amplified+ORFs+in+mammalian+cells.">A hybrid promoter-containing vector for direct cloning and enhanced expression of PCR-amplified ORFs in mammalian cells.</a> Mol Biol Rep. 37 (6), 2757-2765 (2009).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests or other conflicts of interest.

השלב הקריטי ביותר להצלחה של פרוטוקול זה הוא בחירת השלב המתאים של העוברים. בפרסומים קודמים, מגוון של שלבים עובריים ניתן לתרבויות אלה, מוגדרים בדרך כלל על ידי הימים של ימי דגירה או עוברי (ED); כך זה בדרך כלל להניח כי השימוש בED 5 לED 6 עוברים יניבו תוצאות שווה ערך. עם זאת מצאנו...

תרביות תאים ניתקות מרשתית חומוס העוברית היו בשימוש נרחב ללמוד היבטים שונים של ביולוגיה של תא קולטי האור, כולל ההישרדות שלהם 2-9, בידול 10-12, תולדת neurite 13, ועוד. היתרונות של מערכת זו, שפותחו בשנת 1980 על ידי ראובן אדלר ומשתפי פעולה ושוכללו על ידי הקבוצות האחרות שלו ו14-20, מתגוררים במאפיינים הפנימיים של החומוס כמודל חיה 21. הגודל הגדול של העין החומוס, אפילו בשלבים עובריים, מספק כמויות גדולות של חומר לתרבויות. יתר על כן, כאשר תרבויות מבוצעות באמצעות יום עוברי (ED) 5 - 6 רשתית, 55 - 80% מהתאים שלהם להבחין בקולטני אור 14,15,18,22,23, ומאז כ 86% מהקולטניים האור בבעלי חיים זה הם קונוסים 24, תרבויות אלה מתאימים במיוחד למחקרים המתמקדים בסוג תא זה. יש לנו לאחרונה developed ומתאפיין בטכניקה פשוטה שמאפשרת לtransfection פלסמיד יעילות גבוהה של התאים בתרבויות אלה, ובכך להרחיב את השימושיות של מערכת זו על ידי הקלת מחקרים הגנטי missexpression 1. הפיתוח של טכניקה זו נבע מחלל בשיטות שיספקו רמה מקובלת של transfection כדי לאפשר לחקר תפקוד הגן באופן אוטונומי תא הספרות המדעית. זה בין שאר משום שתרבויות עצביות עיקריות הן ידוע לשמצה קשה transfect 25,26. כמה הטכניקות הנפוצות ביותר הזמינות בעבר למטרה זו כללו שיטות כימיות transfection כגון transfection תיווך פוספט lipofection או סידן, אשר תוצאת היעילות בצו של 3-5% ויכולים להפעיל רעילות ניכרת 27-32. למרות שהשימוש בפלסמידים עם מערכת כתב האנזימטית יכולים לעקוף את הבעיה של יעילות transfection עניה על ידי הגברת האות, הם לאלהפלות השפעות תא ספציפי, והתוצאות שלהם מבוססות על אוכלוסיית תאים קטנה שלא יכול להיות נציג של כל. שיטה נפוצה נוספת בחומוס, זיהום בנגיף RCAS, חל רק על תאים מתרבים ולכן לא מתאימה למערכת זו עיקרי רשתית התרבות 33. בפרוטוקול הנוכחי enucleated עיני חומוס עוברי בשלב 27 (ED 5), האפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) הוסר, וכוס הרשתית ממוקמת בתא electroporation המלא עם פתרון המכיל פלסמיד וelectroporated באמצעות מחוייט אלקטרודות, ואחרי ניתוק רשתית ותרבות תוך שימוש בטכניקות סטנדרטית 21. לאחר אופטימיזציה הליך זה הצלחנו להשיג יעילות transfection באופן עקבי על מנת של 22% מהמספר הכולל של תאים בתרבית ו -25% בקרב אוכלוסיית קולטי האור לבד, מבלי להתפשר על מאפייני הישרדות ובידול שלתרבויות 1. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט המתאר את כל השלבים החשובים של הליך זה על מנת להבטיח את הצלחת ושחזור של טכניקה זו.

<table><tbody><tr><td>ECM 830 Electro Square Porator</td><td>BTX/ Harvard Apparatus</td><td>45-0052</td><td></td></tr><tr><td>Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip</td><td>BTX/ Harvard Apparatus</td><td>45-0115 model 512</td><td>Gold tipped electrode used as anode</td></tr><tr><td>Polyimide Tubing</td><td>Vention Medical</td><td>custom made</td><td>Internal Diameter: 0.5 mm/wall thickness: 0.15 - 0.2 mm. Used for insulating gold tiped electrode</td></tr><tr><td>2.5 mm square box filament, 4.5 mm wide</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>FB245B</td><td>Used to make cathode electrode</td></tr><tr><td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td><td>Gibco - Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Moloney forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-8254</td><td>Serrated; Slight Curve; 4.5&quot; Length</td></tr><tr><td>Dumont tweezers 5/45</td><td>Roboz</td><td>RS-5058</td><td>Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length</td></tr><tr><td>Bonn micro forceps, 1x2 teeth</td><td>Roboz</td><td>RS-5172</td><td>Tying Platform; 1x2 Teeth, 0.12 mm Teeth; 3.75&quot; Length; 0.3 mm Tip Width</td></tr></tbody></table>

efficient gene transfer in chick retinas for primary cell culture studies: an ex-ovo electroporation approach

התרבויות מועשרות קולטי האור קונוס נגזרות מרשתית חומוס עוברית הפכו לכלי הכרחי עבור חוקרים ברחבי העולם לומדים את הביולוגיה של תאי עצב ברשתית, במיוחד קולטני אור. היישומים של מערכת זו ללכת מעבר למחקר בסיסי, כפי שהם יכולים בקלות להיות מותאמים לטכנולוגיות תפוקה גבוהות לפיתוח תרופות. עם זאת, מניפולציה גנטית של קולטני האור ברשתית בתרבויות אלה הוכיחה להיות מאוד מאתגרים, שהתחזה הגבלה חשובה התועלת של המערכת. פיתחנו לאחרונה ומאומתים לשעבר אוב טכניקת electroporation פלסמיד שמגבירה את קצב transfection של תאי רשתית בתרבויות אלה על ידי פי חמש בהשוואה לפרוטוקולים זמינים כעת אחרים 1. בשיטה זו enucleated עיני חומוס עוברי בשלב 27, הרשתית מוסרת, וכוס הרשתית ממוקמת בפתרון המכיל פלסמיד וElectroporated באמצעות מנהג נבנה בקלותאלקטרודות עשויות. אז הרשתית הם ניתקו ותרבותיים באמצעות נהלים סטנדרטיים. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על מחקרי ביטוי יתר כמו גם לdownregulation של ביטוי גנים, למשל באמצעות השימוש בטכנולוגית RNAi מונע פלסמיד, בדרך כלל השגת ביטוי transgene ב -25% מאוכלוסיית קולטי האור. הווידאו בפורמט של הפרסום הנוכחי יהפוך את הטכנולוגיה הזו בקלות נגישה לחוקרים בתחום, המאפשר חקר תפקוד גן בתרבויות רשתית עיקריות. גם יש לנו כלל הסברים מפורטים של השלבים הקריטיים של הליך זה לתוצאה ושחזור מוצלח.

כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט לtransfection פלסמיד לכוסות רשתית חומוס enucleated לתרבית תאים ניתק שלאחר מכן. Transfection מושגת על ידי שימוש בelectroporation קל לעשות אלקטרודות מותאמות אישית (איורים 1 - 2). הפרמטרים שתוארו בפרוטוקול זה כבר מותאם להשגת יעילות transfection שנע בין 20 ל 27% (עם ממ...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach at JoVE.com

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

תרביות תאים עובריים חומוס רשתית מהוות כלים חשובים למחקר של ביולוגיה קולטי האור. פיתחנו טכניקת העברה יעילה של גנים המבוססת על לשעבר אוב electroporation פלסמיד של הרשתית לפני התרבות. טכניקה זו במידה ניכרת מגבירה את יעילות transfection על פרוטוקולים זמינים כרגע, מה שהופך את המניפולציה גנטית אפשרית למערכת זו.

העברה יעילה ג&#39;ין בצ&#39;יק הרשתיות לסלולריים יסודי לימודי תרבות:<em&gt; אקס-אוב</em&gt; גישת Electroporation

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

efficient-gene-transfer-chick-retinas-for-primary-cell-culture

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

8.1K Views.  The Johns Hopkins University School of Medicine.  תרביות תאים עובריים חומוס רשתית מהוות כלים חשובים למחקר של ביולוגיה קולטי האור. פיתחנו טכניקת העברה יעילה של גנים המבוססת על לשעבר אוב electroporation פלסמיד של הרשתית לפני התרבות. טכניקה זו במידה ניכרת מגבירה את יעילות transfection על פרוטוקולים ...

Video: Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג&#39;ין העברה על ידי Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental manipulations in ovo/in vivo makes the chicken embryonic retina a versatile and very efficient experimental model. Although the chicken retina is easy to target in ovo by intraocular injections or electroporation, the effective and exact concentration of the reagents within the retina may be difficult to fully control. This may be due to variations of the exact injection site, leakage from the eye or uneven diffusion of the substances. Furthermore, the frequency of malformations and mortality after invasive manipulations such as electroporation is rather high.
This protocol describes an ex ovo technique for culturing whole retinal explants from chicken embryos and provides a method for controlled exposure of the retina to reagents. The protocol describes how to dissect, experimentally manipulate, and culture whole retinal explants from chicken embryos. The explants can be cultured for approximately 24 hr and be subjected to different manipulations such as electroporation. The major advantages are that the experiment is not dependent on the survival of the embryo and that the concentration of the introduced reagent can be varied and controlled in order to determine and optimize the effective concentration. Furthermore, the technique is rapid, cheap and together with its high experimental success rate, it ensures reproducible results. It should be emphasized that it serves as an excellent complement to experiments performed in ovo.

This protocol describes a method to dissect, experimentally manipulate and culture whole retinal explants from chicken embryos. The explant cultures are useful when high success rate, efficacy and reproducibility are needed to test the effects of plasmids for electroporation and/or reagent substances, i.e., enzymatic inhibitors.

Explants רשתית שלם מעוף עוברים לטיפולי Electroporation וכימיים מגיב

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Neuroscience

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

ב electroporation לג&#39;ימי של המוח התיכון צ&#39;יק לחקר תפקוד הגן בהתפתחות Neuron דופאמין

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell differentiation, axon guidance, retinotopic organization and synapse formation[1]. One drawback is the inability to efficiently and reliably manipulate gene expression in RGCs in vivo, especially in the otherwise accessible murine visual pathways. Transgenic mice can be used to manipulate gene expression, but this approach is often expensive, time consuming, and can produce unwanted side effects. In chick, in ovo electroporation is used to manipulate gene expression in RGCs for examining retina and RGC development. Although similar electroporation techniques have been developed in neonatal mouse pups[2], adult rats[3], and embryonic murine retinae in vitro[4], none of these strategies allow full characterization of RGC development and axon projections in vivo. To this end, we have developed two applications of electroporation, one in utero and the other ex vivo, to specifically target embryonic murine RGCs[5, 6]. 
With in utero retinal electroporation, we can misexpress or downregulate specific genes in RGCs and follow their axon projections through the visual pathways in vivo, allowing examination of guidance decisions at intermediate targets, such as the optic chiasm, or at target regions, such as the lateral geniculate nucleus. Perturbing gene expression in a subset of RGCs in an otherwise wild-type background facilitates an understanding of gene function throughout the retinal pathway. Additionally, we have developed a companion technique for analyzing RGC axon growth in vitro. We electroporate embryonic heads ex vivo, collect and incubate the whole retina, then prepare explants from these retinae several days later. Retinal explants can be used in a variety of in vitro assays in order to examine the response of electroporated RGC axons to guidance cues or other factors. In sum, this set of techniques enhances our ability to misexpress or downregulate genes in RGCs and should greatly aid studies examining RGC development and axon projections.

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Here we present two techniques for manipulating gene expression in murine retinal ganglion cells (RGCs) by in utero and ex vivo electroporation. These techniques enable one to examine how alterations in gene expression affect RGC development, axon guidance, and functional properties.

ב electroporation ברחם לשעבר vivo על ביטוי גנים בתאים עכבר גנגליון רשתית

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Biology

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

ויזואליזציה של נדידת תאים העוסקות ב Tectum אופטיים לפתח הבחורה

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Single Cell Transfection in Chick Embryos

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a thorough analysis of the fates of single cells under normal and experimental conditions. To this end, transfection methods that target single progenitors are a prerequisite. We describe here a technically straightforward method for transfecting single cells in chicken tissues in-ovo, allowing reliable lineage tracing as well as genetic manipulation. Specific tissue domains are targeted within the somite or neural tube, and DNA is injected directly into the epithelium of interest, resulting in sporadic transfection of single cells. Using reporters, clonal populations may consequently be traced for up to three days, and behavior of genetically manipulated clonal populations can be compared with that of controls. This method takes advantage of the accessibility of the chick embryo along with emerging tools for genetic manipulation. We compare and discuss its advantages over the widely-used electroporation method, and possible applications and use in additional in-vivo models are also suggested. We advocate the use of this method as a significant addition and complement for existing lineage tracing and genetic interference tools.

Using fine tip micropipettes we inject plasmid DNA into subdomains of chicken somites or neural tubes. The concentration of the plasmid is adjusted to generate single transfected cells. We then allow the cells to develop into clonal populations.

תא יחיד transfection בעוברים צ&#39;יק

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is comparatively very easy to manipulate the chick embryonic retina using recombinant DNA/RNA technology. Electroporation of DNA/RNA constructs into the embryonic retina have a great advantage to study gene regulation in retinal stem/progenitor cells during retinal development. Different type of assays such as reporter gene assay, gene over-expression, gene knock down (shRNA) etc. can be performed using the electroporation technique. This video demonstrates targeted retinal injection and in ovo electroporation into the embryonic chick retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). Here we show a rapid and convenient in ovo electroporation technique whereby a plasmid DNA that expresses green fluorescent protein (GFP) as a marker is directly delivered into the chick embryonic subretinal space and followed by electric pulses to facilitate DNA uptake by retinal stem/progenitor cells. The new method of retinal injection and electroporation at E4 allows the visualization of all retinal cell types, including the late-born neurons1, which has been difficult with the conventional method of injection and electroporation at E1.52.

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

The overall goal of this video is to show how to perform targeted retinal injection and in ovo electroporation of DNA/RNA constructs into the chick embryonic retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). This technique is very useful to study gene expression, gene regulation, and morphological change in developing chick retina.

ב electroporation לג&#39;ימי ברשתית צ&#39;יק עובריים

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is ...

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

The chicken embryo provides an excellent model system for studying gene function and regulation during embryonic development. In ovo electroporation is a powerful method to over-express exogenous genes or down-regulate endogenous genes in vivo in chicken embryos1. Different structures such as DNA plasmids encoding genes2-4, small interfering RNA (siRNA) plasmids5, small synthetic RNA oligos6, and morpholino antisense oligonucleotides7 can be easily transfected into chicken embryos by electroporation. However, the application of in ovo electroporation is limited to embryos at early incubation stages (younger than stage HH20 - according to Hamburg and Hamilton)8 and there are some disadvantages for its application in embryos at later stages (older than stage HH22 - approximately 3.5 days of development). For example, the vitelline membrane at later stages is usually stuck to the shall membrane and opening a window in the shell causes rupture of the vessels, resulting in death of the embryos; older embryos are covered by vitelline and allantoic vessels, where it is difficult to access and manipulate the embryos; older embryos move vigorously and is difficult to control the orientation through a relatively small window in the shell.
In this protocol we demonstrate an ex ovo electroporation method for gene transfer into chicken embryos at late stages (older than stage HH22). For ex ovo electroporation, embryos are cultured in Petri dishes9 and the vitelline and allantoic vessels are widely spread. Under these conditions, the older chicken embryos are easily accessed and manipulated. Therefore, this method overcomes the disadvantages of in ovo electroporation applied to the older chicken embryos. Using this method, plasmids can be easily transfected into different parts of the older chicken embryos10-12.

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

A method of gene transfer into chicken embryos at later incubation stages (older than Hamburger and Hamilton stage (HH) 22) is described. This method overcomes disadvantages of in ovo electroporation applied to older chicken embryos and is a useful technique to study gene function and regulation at older developmental stages.

ין העברת לעוברי עוף מבוגרים יותר על ידי<em&gt; לג&#39;ימי לשעבר</em&gt; Electroporation

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...

Loss-of-Function Approach in the Embryonic Chick Retina by Using Tol2 Transposon-Mediated Transgenic Expression of Artificial microRNAs

The chick retina has long been an important model system in developmental neurobiology, with advantages including its large size, rapid development, and accessibility for visualization and experimental manipulations. However, its major technical limitation had been the lack of robust loss-of-function approaches for gene function analyses. This protocol describes a methodology of gene silencing in the developing chick retina that involves transgenic expression of artificial microRNAs (miRNAs) by using the Tol2 transposon system. In this approach, a Tol2 transposon plasmid that contains an expression cassette for the EmGFP (emerald green fluorescent protein) marker and artificial pre-miRNA sequences against a target gene is introduced into the embryonic chick retina with a Tol2 transposase expression construct by in ovo electroporation. In the transfected retinal cells, the transposase catalyzes the excision of the expression cassette from the transposon vector and its integration into host chromosomes, leading to the stable expression of miRNAs and the EmGFP protein. In our previous study, we have demonstrated that the expression of Nel, a glycoprotein that exerts multiple functions in neural development, can be significantly suppressed in the developing chick retina by using this technique. Our results indicate that this methodology induces a stable and robust suppression of gene expression and thus provides an efficient loss-of-function approach for studies of retinal development.

We have developed a novel loss-of-function approach that involves the introduction and genomic integration of artificial micro-RNA sequences into chick embryos by using in ovo electroporation and the Tol2 transposon system. This technique provides a robust and stable gene knockdown methodology for studies of gene function during development.

גישת אובדן תפקוד ברשתית הגוזל העוברי באמצעות ביטוי טרנסגני בתיווך Tol2 של מיקרו-רנ"א מלאכותי

The chick retina has long been an important model system in developmental neurobiology, with advantages including its large size, rapid development, and ...

העברה יעילה ג'ין בצ'יק הרשתיות לסלולריים יסודי לימודי תרבות:

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג'ין העברה על ידי Electroporation

Explants רשתית שלם מעוף עוברים לטיפולי Electroporation וכימיים מגיב

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

ב electroporation לג'ימי של המוח התיכון צ'יק לחקר תפקוד הגן בהתפתחות Neuron דופאמין

ב electroporation ברחם לשעבר vivo על ביטוי גנים בתאים עכבר גנגליון רשתית

ויזואליזציה של נדידת תאים העוסקות ב Tectum אופטיים לפתח הבחורה

תא יחיד transfection בעוברים צ'יק

ב electroporation לג'ימי ברשתית צ'יק עובריים

ין העברת לעוברי עוף מבוגרים יותר על ידי

גישת אובדן תפקוד ברשתית הגוזל העוברי באמצעות ביטוי טרנסגני בתיווך Tol2 של מיקרו-רנ"א מלאכותי