We would like to acknowledge David O'Brien for his support with data analysis, and all the members of the Canto-Soler lab for their critical discussions. This work was supported by NIH grants EY004859 and EY022631 (MVCS), Core Grant EY1765, and an unrestricted departmental grant from Research to Prevent Blindness, Inc.

Todos los procedimientos descritos en este trabajo se realizaron de acuerdo a las pautas recomendadas por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión de la Universidad Johns Hopkins. 1. Antes de Tiempo: Preparación de Instrumentos, reactivos y Platos <ol><li> Preparación de los huevos: Incubar huevos de gallina fertilizados White Leghorn a 37,5 ° C y una humedad relativa del 60% durante 5 días en una incubadora de huevos. NOTA: Una incubadora con balanceo de la capacidad puede ser útil para la normalización y la sincronización de desarrollo embrionario, pero oscilante no es estrictamente necesario para el resultado de este protocolo. </li><li> Preparación de plásmido: <ol><li> Diseño plásmido constructo para la sobreexpresión de genes o regulación a la baja (por ejemplo, mediante el uso de la tecnología del RNAi 1,34) según sea necesario. Incluya un gen indicador (por ejemplo, EGFP, RFP o LacZ) en la construcción siempre que sea posible. NOTA: Algunos promotores de uso común, tales como el CMV, pueden llegar a ser silenciada en el tiempo. El promot CAGer (pollo beta-actina promotor con promotor de CMV) es una muy buena alternativa, proporcionando eficiente expresión a largo plazo del gen de interés 35-37. </li><li> Preparar una solución de plásmido a una concentración de 1,5 g / l en PBS estéril. OPCIONAL: Preparar la solución plásmido antes de tiempo y almacenarlo congelado hasta que esté listo para su uso. NOTA: Superior concentraciones de plásmido no dan lugar a un aumento significativo en la eficiencia, mientras que el uso de concentraciones más bajas de plásmidos disminuyen la eficiencia de transfección 1. </li></ol></li><li> Electrodos: <ol><li> Para el uso de ánodos de oro gruesa punta del electrodo (véase la Tabla de Materiales Específicos / Equipo). Limpie con etanol al 70%. NOTA: Aislamiento del oro punta de electrodo, dejando aproximadamente 0,5 mm expuestos, es aconsejable minimizar la fuga de la corriente eléctrica. Información para material aislante se puede encontrar en la Tabla de materiales específicos. </li><li> Hacer un cátodo de un cuadrado de 2,5 mm bfilamento de buey, de 4,5 mm de ancho (normalmente utilizado en extractores micropipeta). Con la ayuda de unas pinzas, deshacer la caja cuadrada y enderezar filamento en una tira larga. Luego, bajo microscopio de disección y usando una regla como guía, doblar el filamento en una forma cuadrada &#39;U&#39; 3 mm de largo en la base y 2 mm de alto en un lado, con el otro lado de la longitud restante del filamento (Figura 1 , C - D). Con unas pinzas, sumerja el electrodo en etanol al 96% y la llama para esterilizar. A continuación, conecte un cable eléctrico con una pequeña pinza de conexión para el brazo del electrodo más largo. </li></ol></li><li> Cámara electroporación de configuración: <ol><li> Preparar la cámara de electroporación mediante la reducción de la tapa de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril y la colocación de ella, lado plano hacia abajo, a una placa de Petri de 100 mm usando cinta (Figura 1E). NOTA: Otros recipiente en forma de un pozo de tamaño similar funcionaría; sin embargo, un tubo de microcentrífuga de tapa es fácilmente accesible y autoclavable. El biendebe ser lo suficientemente para alojar un electrodo de ojo de pollo y el cátodo grande, pero no tan grande como para resultar en una pérdida de solución de plásmido. </li></ol></li></ol> 2. Ex Procedimiento electroporación in ovo <ol><li> Preparación de los instrumentos: <ol><li> Esterilizar las herramientas de micro-disección (2 pares de grandes pinzas Moloney curvos para la apertura de las cáscaras de huevo y sacando embriones, 2 pares de punta fina curvas pinzas Dumont para la eliminación de RPE, un par de Bonn dentado pinzas para quitar la lente y vítreo) por inmersión de la consejos en etanol al 96% y en llamas. Alcance la disección Limpie con trapos mojados en etanol al 70%. Calentar una botella de solución salina equilibrada estéril calcio-magnesio-libre de Hank (CMF-HBSS) en un baño de agua a 37 ° C. Rellene 100 mm placas de Petri estériles a 3/4 de su capacidad con una cálida CMF-HBSS. </li><li> Coloque la cámara de electroporación bajo otro microscopio de disección limpia y llena con 120 l de solución de plásmido. Conectar los electrodos al aparato de electroporación, haciendoSeguro electrodo de medida está conectado al polo negativo y el oro con punta de electrodo al polo positivo. </li></ol></li><li> Embrión Colección: <ol><li> Limpie los huevos limpiando conchas con toallitas húmedas en etanol al 70%. Mantener procedimiento estéril durante todo el resto del protocolo para evitar llevar la contaminación en los cultivos. El uso de grandes pinzas Moloney curvas abrir cuidadosamente un agujero en la cáscara del huevo golpeando suavemente en la punta redondeada de un huevo (más de la cámara de aire) y luego agarre y sacando trozos de concha. </li><li> Con otro par de pinzas quitar las membranas y recoger embriones por sacar con pala fuera del huevo (con cuidado de no dañar el embrión). Colóquelo en un plato con CMF-HBSS. NOTA: Recoger la mayor cantidad embriones como sea necesario para obtener el número deseado de vasos de la retina para la electroporación como se especifica en 2.4.4 </li><li> PASO CRÍTICO: Etapa de los embriones de acuerdo a Hamburger y Hamilton 38. NOTA: Para obtener embriones óptimos de eficienciadebe ser en la etapa 27 (Figura 2A). </li><li> La eutanasia a los embriones por decapitación utilizando fórceps Moloney. </li></ol></li><li> La obtención de Copas de la retina: <ol><li> Usando pinzas Dumont finas, enuclear cuidado de los ojos y la transferencia a un nuevo plato CMF-HBSS. </li><li> A partir de la parte posterior de cada ojo, cerca de la cabeza del nervio óptico y utilizando dos pinzas Dumont finas, introducir un consejo de cada par de pinzas entre la retina neural y RPE y cuidadosamente diseccionar el EPR ser cauteloso para no dañar el neuronal retina (Figura 2B). NOTA: La falta de Ca 2+ y Mg 2+ en la solución ayudará a la RPE desprenda de la retina neural más fácilmente. </li></ol></li><li> Electroporación: <ol><li> Establecer parámetros de electroporador para entregar 5 pulsos cuadrados de 15 voltios, 50 mseg de duración y 950 intervalo de milisegundos. Place &#39;U&#39; en forma de electrodo negativo dentro de la cámara de electroporación (microcentrífuga tapa de llenadoed con 120 l de solución que contiene el plásmido). </li><li> Usando pinzas Dumont curvas transferir una taza de la retina a la cámara de electroporación (por sacar con pala, no presionar), y lo colocan en el interior del electrodo en forma de &#39;U&#39;, con la parte posterior de la retina hacia la parte inferior del electrodo y la lente hacia arriba ( Figura 2D). </li><li> Coloque el ánodo de modo que toque la parte anterior del ojo, al lado de la lente, y el uso de pedal de pie del electroporador entregar los pulsos eléctricos. </li><li> Transferencia de la taza de la retina a electroporación a una nueva placa de Petri con CMF-HBSS y repita el procedimiento de electroporación con cada uno de los vasos de la retina restantes. NOTA: Hasta 6 tazas de la retina puede ser a electroporación con la misma solución plásmido sin una disminución significativa en la eficiencia de la transfección. </li><li> Retire el objetivo y el cuerpo vítreo de cada vaso de la retina a electroporación sujetando con pinzas dentadas de Bonn y tirando suavemente a través de tque por alumno apertura mientras mantiene el ojo en su lugar con el dorso de las pinzas Dumont curvas. </li><li> Proceder a la disociación y la cultura de las células de la retina electroporación siguientes procedimientos estándar. NOTA: Para un protocolo detallado en la disociación y la cultura de células de la retina de pollo se refieren a Vergara y Canto-Soler, 2012, la disposición 4 21 En este protocolo, las células se sembraron a baja densidad en placas de 6 pocillos polyornithine recubiertos o 35. platos -mm (6 x 10 5 células / 35 mm de diámetro, así o plato). El medio utilizado es medio 199 con penicilina / glutamina, 10% de suero de ternera fetal (FCS), y ácido linoleico-BSA a 100 mg / ml. Los cultivos se mantienen en un humidificado 37 ° C incubadora con 5% de CO 2. Usando este procedimiento, 5 - 6 x 10 6 células típicamente se pueden obtener por cada etapa 27 del ojo a electroporación. NOTA: Idealmente, no más de 3 horas debe pasar entre recogida de embriones y de las planchas de células, para garantizar una buena supervivencia celulary minimizar el estrés. Un tiempo típico para la observación y el análisis adicional es después de 4 días de cultivo, ya que en este punto que las células han logrado una buena diferenciación morfológica y molecular y la supervivencia sigue siendo alta. </li></ol></li></ol>

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	<li>Vergara, M. N., Gutierrez, C., O'Brien, D. R., Canto-Soler, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+electroporation+of+retinal+cells:+a+novel,+high+efficiency+method+for+functional+studies+in+primary+retinal+cultures.">Ex vivo electroporation of retinal cells: a novel, high efficiency method for functional studies in primary retinal cultures.</a> Exp Eye Res. 109, 40-50 (2013).</li><li>Chalmel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-derived+Cone+Viability+Factor-2+is+a+novel+bifunctional-thioredoxin-like+protein+with+therapeutic+potential.">Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential.</a> BMC Mol Biol. 8, 74 (2007).</li><li>Goureau, O., Regnier-Ricard, F., Desire, L., Courtois, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+nitric+oxide+in+photoreceptor+survival+in+embryonic+chick+retinal+cell+culture.">Role of nitric oxide in photoreceptor survival in embryonic chick retinal cell culture.</a> J Neurosci Res. 55 (4), 423-431 (1999).</li><li>Hewitt, A. T., Lindsey, J. D., Carbott, D., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+survival-promoting+activity+in+interphotoreceptor+matrix+preparations:+characterization+and+partial+purification.">Photoreceptor survival-promoting activity in interphotoreceptor matrix preparations: characterization and partial purification.</a> Exp Eye Res. 50 (1), 79-88 (1990).</li><li>Leveillard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+rod-derived+cone+viability+factor.">Identification and characterization of rod-derived cone viability factor.</a> Nat Genet. 36, 755-759 (2004).</li><li>Lorentz, O., Sahel, J., Mohand-Said, S., Leveillard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cone+survival:+identification+of+RdCVF.">Cone survival: identification of RdCVF.</a> Adv Exp Med Biol. 572, 315-319 (2006).</li><li>Nakamura, M., Singh, D. P., Kubo, E., Chylack Jr, L. T., Shinohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LEDGF:+survival+of+embryonic+chick+retinal+photoreceptor+cells.">LEDGF: survival of embryonic chick retinal photoreceptor cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (5), 1168-1175 (2000).</li><li>Paes-de-Carvalho, R., Maia, G. A., Ferreira, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+regulates+the+survival+of+avian+retinal+neurons+and+photoreceptors+in+culture.">Adenosine regulates the survival of avian retinal neurons and photoreceptors in culture.</a> Neurochem Res. 28 (10), 1583-1590 (2003).</li><li>Stenkamp, D. L., Gregory, J. K., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoid+effects+in+purified+cultures+of+chick+embryo+retina+neurons+and+photoreceptors.">Retinoid effects in purified cultures of chick embryo retina neurons and photoreceptors.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (8), 2425-2436 (1993).</li><li>Fuhrmann, S., Kirsch, M., Hofmann, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+neurotrophic+factor+promotes+chick+photoreceptor+development+in+vitro.">Ciliary neurotrophic factor promotes chick photoreceptor development in vitro.</a> Development. 121 (8), 2695-2706 (1995).</li><li>Toy, J., Norton, J. S., Jibodh, S. R., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+homeobox+genes+on+the+differentiation+of+photoreceptor+and+nonphotoreceptor+neurons.">Effects of homeobox genes on the differentiation of photoreceptor and nonphotoreceptor neurons.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (11), 3522-3529 (2002).</li><li>Yan, R. T., He, L., Wang, S. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-photoreceptor+activity+of+chick+neurogenin1.">Pro-photoreceptor activity of chick neurogenin1.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (12), 5567-5576 (2009).</li><li>Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neurite+growth+in+purified+retina+neuronal+cultures:+Effects+of+PNPF,+a+substratum-bound,+neurite-promoting+factor.">Regulation of neurite growth in purified retina neuronal cultures: Effects of PNPF, a substratum-bound, neurite-promoting factor.</a> J Neurosci Res. 8 (2-3), 165-177 (1982).</li><li>Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+retinal+cell+differentiation+in+the+chick+embryo.">A model of retinal cell differentiation in the chick embryo.</a> Prog Retin Eye Res. 19 (5), 529-557 (2000).</li><li>Adler, R., Hatlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+and+differentiation+of+embryonic+retinal+cells+after+terminal+mitosis.">Plasticity and differentiation of embryonic retinal cells after terminal mitosis.</a> Science. 243 (4889), 391-393 (1989).</li><li>Adler, R., Lindsey, J. D., Elsner, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+cone-like+properties+by+chick+embryo+neural+retina+cells+in+glial-free+monolayer+cultures.">Expression of cone-like properties by chick embryo neural retina cells in glial-free monolayer cultures.</a> J Cell Biol. 99 (3), 1173-1178 (1984).</li><li>Adler, R., Magistretti, P. J., Hyndman, A. G., Shoemaker, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+cytochemical+identification+of+neuronal+and+non-neuronal+cells+in+chick+embryo+retina+cultures.">Purification and cytochemical identification of neuronal and non-neuronal cells in chick embryo retina cultures.</a> Dev Neurosci. 5 (1), 27-39 (1982).</li><li>Belecky-Adams, T., Cook, B., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlations+between+terminal+mitosis+and+differentiated+fate+of+retinal+precursor+cells+in+vivo+and+in+vitro:+analysis+with+the+'window-labeling'+technique.">Correlations between terminal mitosis and differentiated fate of retinal precursor cells in vivo and in vitro: analysis with the 'window-labeling' technique.</a> Dev Biol. 178 (2), 304-315 (1996).</li><li>Hyndman, A. G., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+retina+development+in+vitro.+Effects+of+tissue+extracts+on+cell+survival+and+neuritic+development+in+purified+neuronal+cultures.">Neural retina development in vitro. Effects of tissue extracts on cell survival and neuritic development in purified neuronal cultures.</a> Dev Neurosci. 5 (1), 40-53 (1982).</li><li>Politi, L. E., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+enriched+populations+of+cultured+photoreceptor+cells.">Generation of enriched populations of cultured photoreceptor cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 27 (5), 656-665 (1986).</li><li>Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rediscovering+the+chick+embryo+as+a+model+to+study+retinal+development.">Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development.</a> Neural Dev. 7, 22 (2012).</li><li>Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+cellular+types+in+the+retina.">Determination of cellular types in the retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1677-1682 (1993).</li><li>Repka, A., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+retinal+precursor+cells+born+in+vitro.">Differentiation of retinal precursor cells born in vitro.</a> Dev Biol. 153 (2), 242-249 (1992).</li><li>Morris, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+in+a+receptor+mosaic+demonstrated+in+the+chick+from+the+frequencies,+spacing+and+arrangement+of+the+types+of+retinal+receptor.">Symmetry in a receptor mosaic demonstrated in the chick from the frequencies, spacing and arrangement of the types of retinal receptor.</a> J Comp Neurol. 140 (3), 359-398 (1970).</li><li>Li, H., Chan, S. T. H., Tang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+rat+brain+cells+by+electroporation.">Transfection of rat brain cells by electroporation.</a> J Neurosci Methods. 75 (1), 29-32 (1997).</li><li>Martinez, C. Y., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+primary+central+and+peripheral+nervous+system+neurons+by+electroporation.">Transfection of primary central and peripheral nervous system neurons by electroporation.</a> Methods Cell Biol. 71, 339-351 (2003).</li><li>Boatright, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+5'+flanking+regions+of+IRBP+and+arrestin+have+promoter+activity+in+primary+embryonic+chicken+retina+cell+cultures.">The 5' flanking regions of IRBP and arrestin have promoter activity in primary embryonic chicken retina cell cultures.</a> Exp Eye Res. 64 (2), 269-277 (1997).</li><li>Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+phosphate+transfection+of+DNA+into+neurons+in+primary+culture.">Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture.</a> Curr Protoc Neurosci. Chapter 3, Unit 3.11 (2001).</li><li>Kumar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bZIP+transcription+factor+Nrl+stimulates+rhodopsin+promoter+activity+in+primary+retinal+cell+cultures.">The bZIP transcription factor Nrl stimulates rhodopsin promoter activity in primary retinal cell cultures.</a> J Biol Chem. 271 (47), 29612-29618 (1996).</li><li>Toy, J., Bradford, R. L., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-mediated+gene+transfection+into+chick+embryo+retinal+cells+in+ovo+and+in+vitro.">Lipid-mediated gene transfection into chick embryo retinal cells in ovo and in vitro.</a> J Neurosci Methods. 104 (1), 1-8 (2000).</li><li>Werner, M., Madreperla, S., Lieberman, P., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+transfected+genes+by+differentiated,+postmitotic+neurons+and+photoreceptors+in+primary+cell+cultures.">Expression of transfected genes by differentiated, postmitotic neurons and photoreceptors in primary cell cultures.</a> J Neurosci Res. 25 (1), 50-57 (1990).</li><li>Yuan, L., Kawada, M., Havlioglu, N., Tang, H., Wu, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+PRPF31+inhibit+pre-mRNA+splicing+of+rhodopsin+gene+and+cause+apoptosis+of+retinal+cells.">Mutations in PRPF31 inhibit pre-mRNA splicing of rhodopsin gene and cause apoptosis of retinal cells.</a> J Neurosci. 25 (3), 748-757 (2005).</li><li>Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RCAS+vector+system.">The RCAS vector system.</a> Folia Biol (Praha). 50 (3-4), 107-119 (2004).</li><li>Das, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+system+for+RNA+interference+in+the+chicken+using+a+modified+microRNA+operon.">A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon.</a> Dev Biol. 294 (2), 554-563 (2006).</li><li>Nguyen, A. T., Dow, A. C., Kupiec-Weglinski, J., Busuttil, R. W., Lipshutz, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+gene+promoters+for+liver+expression+by+hydrodynamic+gene+transfer.">Evaluation of gene promoters for liver expression by hydrodynamic gene transfer.</a> J Surg Res. 148 (1), 60-66 (2008).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CMV-beta-actin+promoter+directs+higher+expression+from+an+adeno-associated+viral+vector+in+the+liver+than+the+cytomegalovirus+or+elongation+factor+1+alpha+promoter+and+results+in+therapeutic+levels+of+human+factor+X+in+mice.">CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice.</a> Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).</li><li>You, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hybrid+promoter-containing+vector+for+direct+cloning+and+enhanced+expression+of+PCR-amplified+ORFs+in+mammalian+cells.">A hybrid promoter-containing vector for direct cloning and enhanced expression of PCR-amplified ORFs in mammalian cells.</a> Mol Biol Rep. 37 (6), 2757-2765 (2009).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests or other conflicts of interest.

El paso más crítico para el éxito de este protocolo es la selección de la etapa apropiada de los embriones. En publicaciones anteriores, se da una serie de etapas embrionarias de estas culturas, por lo general definido por los días del día de incubación o embrionarias (ED); por lo que se suele suponer que el uso de ED 5 de ED 6 embriones producirá resultados equivalentes. Sin embargo, hemos encontrado que en el escenario 27 (ED 5), la eficiencia de transfección será de alrededor de 22% de la población total d...

Cultivos de células disociadas de retinas de embriones de pollo se han utilizado ampliamente para estudiar diversos aspectos de la biología de las células fotorreceptoras, incluyendo su supervivencia 2-9 diferenciación 10-12, el crecimiento de neuritas 13, y más. Las ventajas de este sistema, desarrollado en la década de 1980 por Rubén Adler y colaboradores y perfeccionadas por él y para otros grupos de 14-20, residen en las características intrínsecas de la chica como un modelo animal 21. El gran tamaño del ojo polluelo, incluso en las etapas embrionarias, proporciona grandes cantidades de material para cultivos. Por otra parte, cuando los cultivos se realizan con el día embrionario (ED) 5 - 6 retinas, el 55 - 80% de sus células progenitoras diferenciar como fotorreceptores 14,15,18,22,23, y desde aproximadamente el 86% de los fotorreceptores en este animal son conos 24, estas culturas son especialmente adecuados para estudios centrados en este tipo de células. Recientemente hemos desaped y caracterizado una técnica sencilla que permite una alta eficiencia plásmido transfección de las células en estos cultivos, ampliando así la utilidad de este sistema, facilitando estudios missexpression genética 1. El desarrollo de esta técnica se deriva de un vacío en la literatura científica de métodos que proporcionen un nivel aceptable de la transfección para permitir el estudio de la función génica en una célula de manera autónoma. Esto es en parte debido a cultivos neuronales primarios son notoriamente difíciles de transfectar 25,26. Algunas de las técnicas más comúnmente utilizadas previamente disponibles para este propósito incluyen métodos de transfección químicos tales como lipofección o calcio transfección mediada por fosfato, que se traducen en una mayor eficacia en el orden de 3-5% y puede ejercer una toxicidad considerable, 27-32. A pesar de que el uso de plásmidos con un sistema reportero enzimática puede eludir el problema de la pobre eficiencia de la transfección mediante la amplificación de la señal, no lo hacendiscriminar los efectos específicos de la célula, y sus resultados se basan en una población de células pequeñas que pueden no ser representativos del conjunto. Otro método ampliamente utilizado en el pollo, infección por el virus RCAS, sólo es aplicable a las células en proliferación y por lo tanto no es adecuado para este sistema de cultivo primario de la retina 33. En el protocolo actual ojos de embriones de pollo se enucleados en la etapa 27 (ED 5), se retira el epitelio pigmentado de la retina (RPE), y la copa de la retina se coloca en una cámara de electroporación llena con una solución que contiene el plásmido y electroporación utilizando a medida electrodos, seguido por la disociación de la retina y de cultivo utilizando técnicas estándar 21. Después de la optimización de este procedimiento hemos sido capaces de alcanzar consistentemente las eficacias de transfección en el orden del 22% del número total de células en cultivo y 25% dentro de la población de los fotorreceptores solo, sin comprometer las características de supervivencia y diferenciación de lasculturas 1. Aquí proporcionamos un protocolo detallado que describa todos los pasos importantes de este procedimiento a fin de garantizar el éxito y la reproducibilidad de esta técnica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ECM 830 Electro Square Porator</td>
			<td>BTX/ Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip</td>
			<td>BTX/ Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0115 model 512</td>
			<td>Gold tipped electrode used as anode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyimide Tubing</td>
			<td>Vention Medical</td>
			<td>custom made</td>
			<td>Internal Diameter: 0.5mm / wall thickness: 0.15-0.2mm. Used for insulating gold tiped electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5mm square box filament, 4.5mm wide</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>FB245B</td>
			<td>Used to make cathode electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco - Life Technologies</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moloney forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-8254</td>
			<td>Serrated; Slight Curve; 4.5&#34; Length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont tweezers 5/45</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5058</td>
			<td>Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn micro forceps, 1x2 teeth</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5172</td>
			<td>Tying Platform; 1X2 Teeth, 0.12mm Teeth; 3.75&#34; Length; .3mm Tip Width</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient gene transfer in chick retinas for primary cell culture studies: an ex-ovo electroporation approach

Los cultivos de fotorreceptores enriquecido cono derivados de las retinas de embriones de pollo se han convertido en una herramienta indispensable para los investigadores de todo el mundo que estudian la biología de las neuronas de la retina, en particular los fotorreceptores. Las aplicaciones de este sistema van más allá de la investigación básica, ya que se pueden adaptar fácilmente a las tecnologías de alto rendimiento para el desarrollo de fármacos. Sin embargo, la manipulación genética de fotorreceptores de la retina en estos cultivos ha demostrado ser muy difícil, que presenta una importante limitación a la utilidad del sistema. Recientemente hemos desarrollado y validado un ex ovo técnica de electroporación plásmido que aumenta la tasa de transfección de células de la retina en estos cultivos por cinco veces en comparación con otros protocolos disponibles en la actualidad 1. En este método los ojos de embriones de pollo se enucleados en la etapa 27, se retira el RPE, y la copa de la retina se coloca en una solución que contiene el plásmido y se electroporó usando Custom- de fácil construcciónelectrodos hechos. Las retinas son entonces disocian y se cultivan utilizando procedimientos estándar. Esta técnica se puede aplicar a los estudios de sobreexpresión, así como a la regulación a la baja de la expresión génica, por ejemplo, mediante el uso de la tecnología del RNAi plásmido impulsado, comúnmente la consecución de la expresión del transgén en 25% de la población de los fotorreceptores. El formato de vídeo de la presente publicación hará que esta tecnología de fácil acceso para los investigadores en el campo, lo que permite el estudio de la función de genes en cultivos de retina primarios. También hemos incluido una explicación detallada de los pasos críticos de este procedimiento para un resultado exitoso y reproducibilidad.

Aquí presentamos un protocolo sencillo para el plásmido transfección en vasos de la retina de pollo enucleados para el cultivo celular disociada subsiguiente. La transfección se consigue mediante electroporación utilizando fácil de hacer electrodos personalizados (Figuras 1 - 2). Los parámetros descritos en este protocolo se han optimizado para obtener eficiencias de transfección que oscilan entre el 20 y el 27% (con un promedio de 22%) (Figura 3D). Tenga en cue...

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Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Cultivos de células de la retina de embriones de pollo constituyen herramientas valiosas para el estudio de la biología de los fotorreceptores. Hemos desarrollado una técnica de transferencia de genes eficiente, basado en ex ovo plásmido electroporación de las retinas antes del cultivo. Esta técnica aumenta considerablemente la eficiencia de transfección a través de protocolos disponibles en la actualidad, lo que hace posible la manipulación genética para este sistema.

Transferencia génica eficaz en polluelo retinas para estudios de cultivo celular primario: Un<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Enfoque electroporación

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

efficient-gene-transfer-chick-retinas-for-primary-cell-culture

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

8.1K vistas.  The Johns Hopkins University School of Medicine.  Cultivos de células de la retina de embriones de pollo constituyen herramientas valiosas para el estudio de la biología de los fotorreceptores. Hemos desarrollado una técnica de transferencia de genes eficiente, basado en ex ovo plásmido electroporación de las retinas antes del cultivo. Esta técnica aumenta considerablemente la eficiencia de transfección a través de protocolos disponibles en la actualidad, lo que hace posible la manipulación genética p...