Diese Arbeit wurde von einem kanadischen Institutes of Health Research Phase 1-Kliniker Scientist Award (AG) und einen Betriebskostenzuschuss aus dem Krebsforschungsgesellschaft (AG) unterstützt. Die Autoren danken Dr. John Dick für seine Unterstützung dieses Projektes.

Eine schematische Übersicht des Protokolls ist in Fig. 1 dargestellt. 1. Die Verarbeitung der Menschen HCC Proben Erhalten primären humanen HCC Proben mit schriftlicher Zustimmung des Patienten und mit Zustimmung der institutionellen Forschungsethik Bord. Diese Protokolle wurden an unserer Hochschule mit Zustimmung des University Health Network Research Ethics Board im Einklang mit allen institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für die menschliche Wohlfahrt durchgeführt. Sammeln Sie frische HCC Proben so schnell wie möglich nach der Operation einmal geeignete Proben für klinische Zwecke entnommen. Idealerweise sollte dies innerhalb von 30 Minuten nach der Entnahme des Gewebes aus dem Patienten zu nehmen. Wie in Fig. 2 dargestellt, ist eine Probe von mindestens 1 cm 3 aus der Peripherie des Tumors erhalten optimal, da der zentrale Teil des Tumors Nekrose sein.Tumoren, die keine Behandlung vor der Resektion, wie Bestrahlung, Chemotherapie oder Ablation erhalten haben, um die Möglichkeit, dass die Tumorzellen lebensfähig sind, zu maximieren, bevorzugt. Griff primären menschlichen Geweben in Übereinstimmung mit Standard-Protokolle für persönliche Schutz biologisches Material. Führen Sie alle Labor Manipulationen von Tumorgewebe und Zellpräparate in einer Klasse II Biosicherheitswerkbank unter aseptischen Bedingungen. <ol><li> Legen Sie die neue HCC Probe in 10-25 ml Serum-freiem Dulbecco modifiziertem Eagle Medium / Ham &#39;s F12 bei 4 ° C und übertragen auf Eis ins Labor für die sofortige Verarbeitung und Herstellung von Gewebefragmente und / oder Zellen für xenografting in Mäuse. </li><li> Mit einer sterilen Pinzette, legen Sie das Tumorprobe in einem 100 mm x 20 mm Petrischale oder andere geeignete sterile Arbeitsfläche. Teilen Sie die Tumorprobe in Fragmente von etwa 2-3 mm 3 mit einem chirurgischen Skalpell No.10. An dieser Stelle betrachten Snap-Gefrier-oder Formalin-Fixierung some Tumorfragmente für andere Versuche oder Analysen erforderlich. </li><li> Für xenografting von Tumorfragmenten, setzen einige der HCC-Fragmenten in einen oder mehrere Mikrozentrifugenröhrchen mit Matrigel genug, damit die Fragmente untergetaucht bleiben. Bewahren Sie diese Röhrchen auf Eis. </li><li> Zur Herstellung eines Tumorzellsuspension, verwenden die chirurgische Skalpell, um die verbleibenden HCC Gewebe Hackfleisch so viel wie möglich zu mischen und mit 5-10 ml DMEM-F12 in einem 50 ml konischen Röhrchen in Abhängigkeit vom Volumen des zerkleinerten Gewebes. </li><li> Hinzufügen Collagenase Typ IV und Dispase II in Endkonzentrationen von 200 Einheiten / ml bzw. 0,8 Einheiten / ml. Pipettieren Sie die Mischung auf und ab und mit einer 25 ml Pipette. </li><li> Abdichten des Rohres und Inkubation der Mischung aus Schritt 1.6 bei 37 ° C in einer 5% Kohlendioxid-Inkubator für 30-60 min in Abhängigkeit von der Weichheit des Tumorgewebes. Pipettieren Sie die Mischung nach oben und unten ein paar Mal alle 10 min, um die Fortschritte der enzymatischen Verdauung zu beurteilen. </li><li> Nach digestion abgeschlossen ist, passieren die Tumor-Lösung durch einen 100 um Zellsieb. Brei vorsichtig das verbleibende Gewebe auf der Zell Sieb mit einer 25-ml-Pipettenspitze, die maximale Anzahl von Tumorzellen ermöglichen, passieren. Sammeln Sie die angespannte Zellsuspension in einem 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Zentrifugieren der Tumorzellsuspension bei 1.200 Upm für 5 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Den Überstand vorsichtig dekantieren. Je nach Größe des Pellets, fügen Sie 2-5 ml eiskaltem 1x roten Blutkörperchen (RBC) Lysepuffer und sanft Pipette auf und ab, um das Pellet zu resuspendieren. Halten auf Eis für 5 min. </li><li> Hinzufügen DMEM-F12 auf ein Gesamtvolumen von 15 ml und zentrifugiert bei 1000 Upm für 5 Minuten bei 4 ° C zum Auswaschen des RBC-Lyse-Puffer. </li><li> Dekantieren Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren RBC freie Tumorzellpellet in DMEM-F12. </li><li> Zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit Trypanblau-Ausschluss entweder manuell oder mit einem automatisierten Zellzähler. </li><li> Centrifuge Tumorzelle Aliquots, die das gewünschte number von Zellen für die Injektion, wie oben beschrieben, zu resuspendieren die resultierende Zellpellet in 30 ul eiskaltem Matrigel und auf Eis aufbewahren. </li></ol> Optional: Nach Schritt 1.11, führen wir routine humanen CD45 +-Zellen (Leukozyten) von der Haupttumorzellsuspension und / oder zu reinigen Gruppen von Tumorzellen unter Verwendung von Durchflusszytometrie oder immunmagnetische Kügelchen. Detaillierte Protokolle für diese Verfahren sind von den Herstellern der entsprechenden Antikörper, Perlen und Durchflusszytometer beschrieben. Anmerkung: Die oben beschriebene Protokoll kann auch verwendet werden, um menschliche Tumor-Xenotransplantate von Mäusen, um serielle Transplantation durchführen geerntet verarbeiten, Ersetzen des Xenotransplantatgewebe für die primären humanen HCC-Gewebe in Schritt 1.1. In diesem Fall wird nach Schritt 1.11, führen wir routineInfiltrations murine Zellen aus der Zellsuspension unter Verwendung eines Antikörpers gegen Maus-Histokompatibilitäts-Antigen H2k. 2.Xenografting Führen Sie alle Tierverfahren in Übereinstimmung mit Protokollen, die von der institutionellen Tierpflege Ausschuss genehmigt. Die hier beschriebenen Verfahren sind unter einem bestimmten Tier Verwenden Protokolls durch die University Health Network Animal Care Ausschuss nach und die Einhaltung aller relevanten rechtlichen und institutionellen Agenturen, Vorschriften und Richtlinien zugelassen ist abgeschlossen. Ausrüstung für die Lieferung von Lungen flüchtigen Anästhetika, um kleine Tiere sollten nach Standardverfahren der Tierhaltung und Forschungsinstitut genutzt werden. Führen Sie alle chirurgischen Eingriffen unter aseptischen Bedingungen und sterile Instrumente in einer Klasse II Biosicherheitswerkbank. Nutzen nicht-übergewichtigen Diabetiker schwerer kombinierter Immundefizienz (NOD / SCID) oder NOD / SCID / Interleukin-2-Rezeptor-gamma-Kette null (NSG) Stämme von Mäusen beiderlei Geschlechts bei 6-8 Wochen alt (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) 9,10. DieseMäuse müssen untergebracht und gehalten werden, in einer Anlage, in der Lage, pathogenfreien Bedingungen für immundefizienten Tieren. Mäuse Vorbereitung für die Operation in einer Kammer, Zuführen von 5% (v / v) eingeatmet Isofluran in 1 l / min Sauerstoff. Aufrechterhaltung einer Narkose, bis ein Verlust der Hornhaut-und Zehenreflex im Tier (en). Für die subkutane xenografting, rasieren eine oder mehrere kleine Bereiche auf dem Rücken des Tieres (n) und reinigen die Haut mit 70% Ethanol. Für intrahepatischen xenografting, rasieren ventralen Thorax und Abdomen des Tieres (n) von den Achselhöhlen bis in die Leistengegend und reinigen die Haut mit 70% Ethanol. 2.1 Die subkutane Implantation von Tumorfragmenten <ol><li> Setzen Sie den narkotisierten Maus anfällig, die Aufrechterhaltung inhalative Isofluran Anästhesie (2% (v / v) in 1 l / min O 2) mit einem Mundstück. Bewerben Reiß Gel auf die Augen des Tieres von traumatischen Verletzungen zu schützen. </li><li> Sterilisieren Sie die Rücken rasierte Fläche (n) mit Betadinechirurgischen Scheuer von 70% Ethanol, gefolgt und schließlich mit Povidon-Jod-Lösung. </li><li> Machen Sie einen 5 mm Hautschnitt unter Verwendung von sterilen scharfen Schere. </li><li> Legen Sie eine stumpfe Schere geschlossen sanft in den subkutanen Raum und verbreiten vorsichtig, um eine Tasche groß genug, um einen Tumor zu entwickeln Fragment zubringen. </li><li> Legen Sie die Tumor-Fragment in Schritt 1.3 in das subkutane Tasche mit sterilen feinen Pinzette vorbereitet. </li><li> Schließen Sie den Hautschnitt mit Nähten oder Klammern. </li><li> Bereitzustellen postoperativen Versorgung der Maus, wie nachstehend beschrieben. </li></ol> 2.2 Die subkutane Injektion von Tumorzellen <ol><li> Bereiten Sie das Tier wie in den Schritten 2.1.1 und 2.1.2 beschrieben. </li><li> Laden der Suspension der Tumorzellen in Matrigel in Schritt 1.13 in einer Insulinspritze mit einer 29 G 1/2 in Nadel hergestellt. </li><li> Legen Sie die Nadel in den subkutanen Raum und entladen Sie den Inhalt der Spritze. Vorschieben der Nadel mehrere Millimeter entlang der subkutanen Ebene weg from die Haut Einstichstelle verhindert eine Leckage des Tumorzellsuspension aus der Punktionsstelle nach dem Herausziehen der Nadel. </li><li> Bereitzustellen postoperativen Versorgung der Maus, wie nachstehend beschrieben. </li></ol> 2.3 Intrahepatische Implantation von Tumorfragmenten <ol><li> Verwendung einer 27 G 1/2 in Nadel auf eine 1 ml Spritze verabreichen 350 ul steriler physiologischer Kochsalzlösung subkutan in den Rücken des Halses des betäubten Tieres für intraoperative Flüssigkeitsverluste auszugleichen. Für Analgesie zu verabreichen 350 ul steriler normaler Salzlösung, enthaltend Buprenorphin (0,1 mg / kg) subkutan in die Flanke der Tiere unter Verwendung einer 27 G Nadel 1/2-in an einer 1 ml-Spritze. </li><li> Platzieren Sie die Maus in Rückenlage auf einem vorgewärmten Pad mit Nase und Mund innerhalb des Mundstücks positioniert, um Wartung zu liefern inhalative Isofluran Anästhesie (2% (v / v) in 1 l / min O 2). </li><li> Verlängern Sie die Gliedmaßen und sichern Sie sie mit Klebeband an der Bedienoberfläche, um die Exposition zu optimierendas ventrale Abdomen und Thorax. </li><li> Führen Sie das Verfahren unter einem Vergrößerungslampe, um die Visualisierung zu optimieren. </li><li> Sterilisieren der rasierten Haut auf der ventralen Abdomen und des Thorax mit Betadine chirurgischen Scheuer gefolgt von 70% igem Ethanol und schließlich mit Povidon-Jod-Lösung. </li><li> Mit einer sterilen scharfen Schere, einen Quer bilateralen subkostalen Hautschnitt und teilen die Muskelschichten, um die Bauchhöhle geben, um eine ausreichende Belichtung der gesamten Leber zu ermöglichen. </li><li> Legen Sie einen Stich in der Haut über dem Schwertfortsatz und sichern Sie es mit dem Mundstück mit Klebeband, um eine bessere Belichtung der Leber und der umgebenden Strukturen zu ermöglichen. </li><li> Verwenden Sie zwei Wattestäbchen neben und hinter der Leber, um es zu stabilisieren. </li><li> Einen Einschnitt von 3 mm in der Länge und Tiefe auf der Oberfläche der Leber unter Verwendung einer sterilen Skalpellklinge Nr. 10. </li><li> Unmittelbar gelten Surgicel und sanften Druck auf der Einschnittstelle zur Blutstillung zu erreichen, nach 60-90 sec entfernenund fahren nur, wenn vollständige Blutstillung erreicht worden ist. </li><li> Legen Sie eine Tumor Fragment Schritt 1.3 in die Leber Schnitt mit sterilen feinen Pinzette oder mit einem 18-G-Nadel. </li><li> Eine kleine Stück Surgicel über die Leber Einschnitt, um eine Verschiebung des Tumors Fragment zu verhindern und sicherzustellen Fortsetzung Blutstillung. </li><li> Schließen Sie den Schnitt mit Nähten oder Klammern. </li><li> Geben postoperative Betreuung, wie unten beschrieben </li></ol> 2.4 Intrahepatische Implantation von Tumorzellen durch direkte Injektion in die Leber <ol><li> Bereiten Sie die Maus wie in den Schritten 2.3.1 bis 2.3.7 oben beschrieben. </li><li> Laden der Tumorzellsuspension (hergestellt in Schritt 1.13) in einer Insulinspritze mit einer 29 G 1/2 in der Nadel. </li><li> Mit Hilfe eines Baumwollspitze Applikator stabilisiert die Leber, legen Sie die Insulin-Spritzennadel in die Leber und vorab die Spitze einige Millimeter über der Einstichstelle entlang einer subkapsuläre-Ebene. </li><li> Vorsichtig den Inhalt der Spritze und t entladenHenne entfernen Sie die Nadel aus der Leber. </li><li> Platz Surgicel über der Einstichstelle und sanften Druck mit einem Wattestäbchen, um ein Auslaufen der Tumorzellsuspension zu verhindern und die komplette Blutstillung zu erreichen. </li><li> Schließen Sie den Schnitt mit Nähten oder Klammern und bieten Nachsorge wie unten beschrieben. </li></ol> 2,5 Intrahepatische Xenografting von Tumorzellen über Injektion in die Milz <ol><li> Bereiten Sie die Maus wie in den Schritten 2.3.1 bis 2.3.5 oben beschrieben. </li><li> Mit einer sterilen scharfen Schere, stellen eine 1 cm links subkostalen Einschnitt in die Bauchhöhle gelangen. </li><li> Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um den Magen kranial und zur rechten Seite des Tieres, um die Milz aussetzen reflektieren. </li><li> Durch den Umgang mit den umliegenden Fettgewebe mit sterilen feinen atraumatischen Pinzette, liefern die Milz in den Schnitt und setzen Sie ein Wattestäbchen hinter der Milz, um es zu stabilisieren. </li><li> Mit 5-0 Seidenfaden, Orteine lose Vor-gebundenen Knoten rund um die Milz über dem unteren Pol. </li><li> Laden der Tumorzellsuspension (hergestellt in Schritt 1.13) in einer Insulinspritze mit einer 29 G 1/2 in der Nadel. </li><li> Legen Sie die Insulin-Spritzennadel in den unteren Pol der Milz und voran es über das Niveau des Vor-lose gebundenen Knoten. </li><li> Langsam Entladen der Inhalt der Spritze, entfernen Sie die Nadel aus der Milz, und ziehen Sie die Knoten, um ein Auslaufen der injizierten Tumorzellsuspension zu verhindern. </li><li> Ersetzen Sie die Milz in die Bauchhöhle. </li><li> Schließen Sie den Schnitt mit Nähten oder Klammern und bieten Nachsorge wie unten beschrieben. </li></ol> 2.6 Teilhepatektomie zu Intrahepatische Verpflanzung von menschlichen Tumorgewebe Erleichterung <ol><li> Bereiten Sie die Maus wie in den Schritten 2.3.1 bis 2.3.7 beschrieben. </li><li> Mit sterilen scharfen Schere, teilen Sie die Lig. falciforme zur mittleren Leberlappen angebracht. </li><li> Mit einem Wattestäbchen, mobilisierender linke Leberlappen und die Position einer losen Pre-gebundenen Knoten von 5-0 Seidenfaden um den linken Leberlappen. Schieben Sie den lockeren Knoten so nah wie möglich in Richtung der bilio-Gefäßstiel des linken Lappens und ziehen Sie den Knoten. </li><li> Verbrauchsteuern die linke Lappen distal der Ligatur mit sterilen Schere, so dass eine kleine Baumstumpf, um ein Rutschen des Knotens und die anschließende Blutung zu verhindern. </li><li> Verwendung einer ähnlichen Technik, zu ligieren und zu resezieren die Mehrheit der Mittellappen der Leber, die Gallenblase zu vermeiden. </li><li> Verwenden Surgicel und sanften Druck mit einem Wattestäbchen an den Schnittflächen des Leberparenchyms, komplette Blutstillung zu erreichen. </li><li> Für intrahepatischen xenografting Fragment eines Tumors oder Tumorzellen, fahren Sie mit Schritte 2.3.8 bis 2.3.11 oder 2.4.2 auf 2.4.5 wie oben beschrieben. </li><li> Für intrahepatischen xenografting von Tumorzellen über Milz-Injektion, nutzen Wattestäbchen sanft spiegeln den Magen kranial und zur rechten Seite des Tieres, exposing der Milz. Fahren Sie mit Schritt 2.5.4 bis 2.5.9 wie oben beschrieben. </li><li> Schließen Sie den Schnitt mit Nähten oder Klammern und bieten Nachsorge wie unten beschrieben. </li></ol> 2.7 Postoperative Behandlung <ol><li> Entfernen Sie die Maus von der Inhalationsanästhesie Mundstück. </li><li> Platzieren Sie die Maus in einem Käfig unter einer Wärmelampe für ca. 20 Minuten, bis aus der Narkose erholt und voll mobilisiert. </li><li> Wiederholen Sie die Buprenorphin-Dosis alle 8 bis 12 Stunden während der ersten 2-3 Tage nach der Operation. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Wir haben eine Reihe von Techniken beschrieben, um subkutane und intrahepatische menschlichen HCC-Xenotransplantaten in immundefizienten Mäusen, die mit einer Vielzahl von experimentellen Fragen und Assays angewandt werden können herzustellen. Während subkutane Xenotransplantate wurden allgemein verwendet, um verschiedene Aspekte der Biologie HCC zu untersuchen, werden intra-Xenotransplantaten in der Literatur kaum beschrieben. Darüber hinaus haben die meisten Studien, die den Einsatz von Fremdtransplantaten diese v...

Das Leberzellkarzinom (HCC) ist die fünfthäufigste Krebserkrankung weltweit und der am schnellsten zunehmenden Krebstodesursache in Nordamerika. Die häufigste Risikofaktor für HCC ist Leberzirrhose, am häufigsten auftretenden durch chronische Virushepatitis, Alkoholmissbrauch, Autoimmunerkrankungen oder erbliche Stoffwechselstörungen ein. Trotz der schweren Krankheitslast durch HCC auf Populationen weltweit verhängt wird die Pathophysiologie der HCC relativ schlecht im Vergleich zu anderen häufigen Krebsarten wie Darm-, Brust-, oder Prostatakrebs zu verstehen. Beispielsweise spezifische molekulare und zelluläre Ereignisse Antriebs Tumorigenese bleiben klar definiert werden 2. Wie die meisten anderen soliden epithelialen Tumoren wurden genomische Ansätze Heterogenität der Aberrationen mit HCC 3 zugeordnet enthüllt. Eine Reihe von Studien haben ungeordneten Aktivität einer Vielzahl von Signalwegen im Zellproliferation beteiligt sur ergabÜberleben, Differenzierung und Angiogenese 4. Darüber hinaus bleibt die Rolle der Krebsstammzellen in HCC Pathobiologie geklärt werden 5. Mit einer begrenzten Verständnis der Pathophysiologie HCC hat das Rüstzeug von wirksamen Therapien für HCC blieb auch relativ begrenzt. Frühstadium Patienten mit Tumoren auf die Leber beschränkt sind kurative Therapie mit Tumorablation oder chirurgische Resektion, wenn Wiederholung ist üblich. Bei Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung, Chemotherapie und Bestrahlung sind von begrenzter Wirksamkeit und sind vor allem für Krankheitskontrolle mit palliativer Absicht 6 verwendet. Hohe Qualität in-vivo-Versuchsmodellen menschlicher HCC damit eine wertvolle Plattform für die dringend benötigte Grundlagenforschung in der Pathophysiologie des menschlichen HCC sowie zur Bewertung von Therapien. Verglichen mit der Verwendung von Zell-Linien oder hoch definiert Mausmodellen Xenotransplantate primary menschlichen Tumoren in immungeschwächten Mäusen haben als wertvolle Instrumente für solche Studien entstanden, da sie in der Lage, rekapituliert die menschliche Krankheit mit hoher Wiedergabetreue, während auch die Erfassung der Heterogenität, die innerhalb und zwischen verschiedenen Patienten 7,8 vorhanden ist, sind. Zu diesem Zweck haben wir eine Vielzahl von Methoden, um menschliche HCC Xenografts in immundefizienten Mäusen zu etablieren entwickelt. Während die Mehrheit der veröffentlichten Studien mit HCC Xenografts beschreiben die Verwendung von etablierten menschlichen HCC Zelllinien zu diesem Zweck haben wir uns auf die Optimierung unserer Tests zur Heterotransplantate aus primären HCC Proben sofort nach der chirurgischen Resektion von Patienten erhalten generieren konzentriert. Verschiedene Techniken können xenografting für verschiedene Forschungsanwendungen erforderlich. Zum Beispiel sind subkutane Xenografts aus Tumor-Fragmente erzeugt schnell erzeugt werden, leicht zu überwachen, und kann mehr für die lokale Verwaltung neuartiger Therapeutika mit bequemen angemessen seinÜberwachung von Tumorantwort. Intrahepatischen Xenotransplantate kann für Studien in Bezug auf die Rolle der Lebermikro in HCC Biologie relevanter. Xenotransplantate aus Tumorzellsuspensionen erzeugt sind für die Identifizierung und Charakterisierung von Tumor-initiierende Zellen-Untergruppen oder für Experimente in vitro-Manipulationen von Tumorzellen vor der Xenotransplantation erfordern erforderlich. Damit haben wir entwickelt und validiert die folgenden Protokolle zur subkutanen oder intra-Heterotransplantate aus Zellsuspensionen oder Tumorfragmente aus primären humanen HCC Proben abgeleitet etablieren.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Mod. Eagle Medium/Ham's F12 50/50 Mix x1(DMEM-F12)</td>
			<td>WISENT Bioproducts</td>
			<td>319-075-CL</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase TypeIV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Becton-Dickinson Biosciences</td>
			<td>354234</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % Buffered Formalin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9 % Saline Solution (NaCl), sterile</td>
			<td>House Brand</td>
			<td>1011-L8001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine surgical scrub</td>
			<td>Purdue Pharma</td>
			<td>NPN 00158313</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LORIS 10% PVP-I Solution</td>
			<td>LERNA Pharma Inc.</td>
			<td>109-09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (Temegesic) NR 0.3 mg/ml</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic</td>
			<td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td>
			<td>M60302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tear-Gel</td>
			<td>Novartis Pharmaceuticals</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen section compound</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95057-838</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold, Tissue -Tek</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4566</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Glide Needle 18G 1 &frac12;</td>
			<td>Becton-Dickinson Biosciences</td>
			<td>305196</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Glide Needle 27G &frac12;</td>
			<td>Becton-Dickinson Biosciences</td>
			<td>305109</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe, 3/10 cc U-100, 29G&frac12;</td>
			<td>Becton-Dickinson Biosciences</td>
			<td>309301</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade No.10</td>
			<td>Feather Safety Razor Co.</td>
			<td>08-916-5A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5-0 Soft silk surgical suture, 3/8" taper point needle</td>
			<td>Syneture</td>
			<td>VS-880</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transpore surgical tape</td>
			<td>3M Health care</td>
			<td>1577-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton applicator</td>
			<td>Medpro</td>
			<td>018-425</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgicel, oxidized regenerated cellulose</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>1951</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 100 &mu;m nylon</td>
			<td>Becton-Dickinson Biosciences</td>
			<td>352360</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnification lighting with mobile base</td>
			<td>Benson medical Industries Inc.</td>
			<td>model: RLM-CLT-120V</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish sterile 100x20 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>821474</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forcep, 1x2 teeth, 4-1/2"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A10-302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson dressing forcep 4-3/4"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A10-220</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye dressing forcep, serrated, straight, 4"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A19-560</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Hemostatic Forceps, curved, 3-1/2"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A12-142</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor, curved, 4-1/4"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A8-690</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor, straight, 4-1/2"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A8-684</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olsen-Hegan needle driver, 5-1/2"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A17-228</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice

In-vivo-Versuchsmodellen des hepatozellulären Karzinoms (HCC), der die menschliche Krankheit rekapitulieren eine wertvolle Plattform für die Erforschung der Krankheit Pathophysiologie und für die präklinische Evaluierung neuer Therapien. Wir stellen eine Vielzahl von Methoden zur subkutanen oder orthotopen HCC menschlichen Xenotransplantaten in immundefizienten Mäusen, die in einer Vielzahl von Forschungsanwendungen verwendet werden, erzeugen könnte. Mit einem Fokus auf der Verwendung von Primärtumorgewebe von Patienten, die sich chirurgischen Resektion als Ausgangspunkt beschreiben wir die Herstellung von Zellsuspensionen oder Tumorfragmente für xenografting. Wir beschreiben spezielle Techniken, um diese Gewebe i) subkutane Xenotransplantat oder ii) intrahepatisch, entweder durch direkte Implantation von Tumorzellen oder Fragmente in der Leber, oder indirekt durch Injektion von Zellen in der Milz der Maus. Wir beschreiben auch die Verwendung von partiellen Resektion des nativen Mausleber bei der xenografting als Strategie zurinduzieren einen Zustand der aktiven Leberregeneration in der Empfängermaus, die die intra-Transplantation von primären humanen Tumorzellen erleichtern können. Die erwarteten Ergebnisse dieser Techniken dargestellt. Die beschriebenen Protokolle wurden mit primären humanen HCC Proben und Heterotransplantate, die in der Regel weniger robust durchzuführen als die etablierten menschlichen HCC Zelllinien, die weit verbreitet sind und in der Literatur häufig zitiert validiert. Im Vergleich zu Zelllinien diskutieren wir Faktoren, die auf die relativ geringe Chance primären HCC Anwachsen der Xenotransplantation Modelle beitragen und kommentieren technischen Fragen, die die Kinetik der Xenograft Wachstum beeinflussen können. Wir empfehlen auch Methoden, die eingesetzt werden, sollten sicherstellen, dass Heterotransplantate erhalten genau ähneln Mutter HCC Gewebe werden.

Fig. 3 zeigt das typische Aussehen einer subkutanen humanen HCC Xenotransplantat und die entsprechende histologische Erscheinung des Tumors. Die Entwicklung und das Wachstum der subkutanen Heterotransplantate können leicht durch tägliche Prüfung der Empfängermäuse überwacht werden. Das Zeitintervall zwischen xenografting und die Entwicklung eines Tumors kann stark in Abhängigkeit von der Art des Gewebes (Fragment gegen Tumor-Zellsuspension), Gewebequelle (primäre Patientenprobe, agierte Xenograf...

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Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

Menschen Tumorxenotransplantaten in immundefizienten Mäusen sind wertvolle Werkzeuge, um Krebsbiologie zu studieren. Spezifische Protokolle subkutane und intra-Heterotransplantate aus menschlichen Leberzellkarzinom-Zellen oder Tumorfragmente zu erzeugen, werden beschrieben. Leberregeneration nach partieller Hepatektomie in Empfängermäuse induziert wird, als eine Strategie, um intra-Transplantation zu erleichtern präsentiert.

Generierung von subkutanen und Intrahepatische Menschenleberzellkarzinom Xenografts in immundefizienten Mäusen

In  vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate  the human disease provide a valuable platform for research into disease  ...

generation-subcutaneous-intrahepatic-human-hepatocellular-carcinoma

Research

JoVE Journal

Medicine

35.7K Aufrufe.  University Health Network.  Menschen Tumorxenotransplantaten in immundefizienten Mäusen sind wertvolle Werkzeuge, um Krebsbiologie zu studieren. Spezifische Protokolle subkutane und intra-Heterotransplantate aus menschlichen Leberzellkarzinom-Zellen oder Tumorfragmente zu erzeugen, werden beschrieben. Leberregeneration nach partieller Hepatektomie in Empfängermäuse induziert wird, als eine Strategie, um intra-Transplantation zu erleichtern präsentiert. 

Serie: Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J Mice

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular through transplantation of stromal cells and epithelial cells in the mammary gland of mice. Current transplantation models often involve the use of immunocompromised mice due to the different genetic backgrounds of stromal cells and epithelial cells. Extracellular matrices are often used to embed the two different cell types for consistent cell-cell interactions, but involve the use of Matrigel or rat tail collagen, which are immunogenic substrates. The lack of functional T cells from immunocompromised mice prevents accurate assessment of stromal cells on mammary tumor progression in vivo, with important implications on drug development and efficacy. Moreover, immunocompromised mice are costly, hard to breed and require special care conditions. To overcome these obstacles, we have developed an approach to orthotopically transplant stromal cell and epithelial cells into mice from the same genetic background to induce consistent tumor formation. This system involves harvesting normal, carcinoma associated fibroblasts, PyVmT mammary carcinoma cells and collagen from donor C57BL/6J mice. The cells are then embedded in collagen and transplanted in the inguinal mammary glands of female C57BL/6J mice. Transplantation of PyVmT cells alone form palpable tumors 30-40 days post transplantation. Endpoint analysis at 60 days indicates that co-transplantation with fibroblasts enhances mammary tumor growth compared to PyVmT cells transplanted alone. While cells and matrix from C57BL/6J mice were used in these studies, the isolation of cells and matrix and transplantation approach may be applied towards mice from different genetic backgrounds demonstrating versatility. In summary, this system may be used to investigate molecular interactions between stromal cells and epithelial cells, and overcomes critical limitations in immunocompromised mouse models.

In this report, we demonstrate a system to isolate and culture donor cells from the mouse mammary gland, and orthotopically transplant these cells in recipient mice to analyze stromal: epithelial interactions during mammary tumor development.

Mammary Transplantation von Stromazellen und Carcinoma Cells in C57BL/6J-Mäuse

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular ...

Forschung

Medizin

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

Experimentelle Erzeugung von Karzinom-assoziierte Fibroblasten (CAF) von menschlichen Brustkrebszellen Fibroblasten

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy and/or cytotoxic chemotherapy. To induce bladder cancer, C57BL/6 mice (MUC1.Tg and wild type) were treated orally with the carcinogen N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine (OH-BBN) at 3.0 mg/day, 5 days/week for 12 weeks. To assess the effects of OH-BBN on serum cytokine profile during tumor development, whole blood was collected via submandibular bleeds prior to treatment and every four weeks. In addition, a MUC1-targeted peptide vaccine and placebo were administered to groups of mice weekly for eight weeks. Multiplex fluorometric microbead immunoanalyses of serum cytokines during tumor development and following vaccination were performed. At termination, interferon gamma (IFN-&#947;)/interleukin-4 (IL-4) ELISpot analysis for MUC1 specific T-cell immune response and histopathological evaluations of tumor type and grade were performed. The results showed that: (1) the incidence of bladder cancer in both MUC1.Tg and wild type mice was 67%; (2) transitional cell carcinomas (TCC) developed at a 2:1 ratio compared to squamous cell carcinomas (SCC); (3) inflammatory cytokines increased with time during tumor development; and (4) administration of the peptide vaccine induces a Th1-polarized serum cytokine profile and a MUC1 specific T-cell response. All tumors in MUC1.Tg mice were positive for MUC1 expression, and half of all tumors in MUC1.Tg and wild type mice were invasive. In conclusion, using a team approach through the coordination of the efforts of pharmacologists, immunologists, pathologists and molecular biologists, we have developed an immune intact transgenic mouse model of bladder cancer that expresses hMUC1.

An N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced bladder cancer model was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic mice for the purpose of testing MUC1-directed immunotherapy. After administering a MUC1-targeted peptide vaccine, a cytotoxic T lymphocyte response to MUC1 was confirmed by measuring serum cytokine levels and T-cell specific activity.

Induktion von Invasive Transitional Handy Blasenkarzinom in Immune intakte menschliche MUC1 transgenen Mäusen: Ein Modell für Immuntherapie Entwicklung

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy ...

Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live animal &#8211;&#160;particularly in sites with unique physiological and architectural qualities such as the brain. In vitro and ectopic models cannot account for features such as vasculature, blood brain barrier, metabolism, drug delivery and toxicity, and a host of other relevant factors. Orthotopic models have their limitations too, but with proper technique tumor cells of interest can be accurately engrafted into tissue that most closely mimics conditions in the human brain. By employing methods that deliver precisely measured volumes to accurately defined locations at a consistent rate and pressure, mouse models of human brain tumors with predictable growth rates can be reproducibly created and are suitable for reliable analysis of various interventions. The protocol described here focuses on the technical details of designing and preparing for an intracranial injection, performing the surgery, and ensuring successful and reproducible tumor growth and provides starting points for a variety of conditions that can be customized for a range of different brain tumor models.

The brain is a unique site with qualities that are not well represented by in vitro or ectopic analyses. Orthotopic mouse models with reproducible location and growth characteristics can be reliably created with intracranial injections using a stereotaxic fixation instrument and a low pressure syringe pump.

Erstellen Anatomisch genaue und reproduzierbare intrakranielle Xenografts der Menschen Hirntumoren

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live ...

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and highly vascularized, making it an ideal system for tumor implantation. Furthermore, the CAM contains extracellular matrix proteins such as fibronectin, laminin, collagen, integrin alpha(v)beta3, and MMP-2, making it an attractive model to study tumor invasion and metastasis. Scientists have long taken advantage of the physiology of the CAM by using it as a model of angiogenesis. More recently, the CAM assay has been modified to work as an in vivo xenograft model system for various cancers that bridges the gap between basic in vitro work and more complex animal cancer models. The CAM assay allows for the study of tumor growth, anti-tumor therapies, and pro-tumor molecular pathways in a biologically relevant system that is both cost- and time-effective. Here, we describe the development of CAM xenograft model of hepatocellular carcinoma (HCC) with embryonic survival rates of up to 93% and reliable tumor take leading to growth of three-dimensional, vascularized tumors.

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane CAM Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.

Das<em&gt; In Ovo</em&gt; Chick Chorioallantoismembran (CAM) Assay als effiziente Xenograftmodell des hepatozellulären Karzinoms

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

Th17 Inflammation Model of Oropharyngeal Candidiasis in Immunodeficient Mice

Oropharyngeal Candidiasis (OPC) disease is caused not only due to the lack of host immune resistance, but also the absence of appropriate regulation of infection-induced immunopathology. Although Th17 cells are implicated in antifungal defense, their role in immunopathology is unclear. This study presents a method for establishing oral Th17 immunopathology associated with oral candidal infection in immunodeficient mice. The method is based on reconstituting lymphopenic mice with in vitro cultured Th17 cells, followed by oral infection with Candida albicans (C. albicans). Results show that unrestrained Th17 cells result in inflammation and pathology, and is associated with several measurable read-outs including weight loss, pro-inflammatory cytokine production, tongue histopathology and mortality, showing that this model may be valuable in studying OPC immunopathology. Adoptive transfer of regulatory cells (Tregs) controls and reduces the inflammatory response, showing that this model can be used to test new strategies to counteract oral inflammation. This model may also be applicable in studying oral Th17 immunopathology in general in the context of other oral diseases.

Although Candida infection models are available to study host immune resistance, a model to study T cell mediated immunopathology in the context of Candida infection is absent. Here we describe a method to establish Th17 immunopathology associated with oral Candida infection in immunodeficient mice.

Th17 Entzündung Modell Oropharyngeale Candidiasis in immundefizienten Mäusen

Oropharyngeal Candidiasis (OPC) disease is caused not only due to the lack of host immune resistance, but also the absence of appropriate regulation of ...

A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of cancer metastasis are still unclear. Animal models are essential for elucidating the mechanisms and for evaluating novel strategies for the treatment of metastatic cancers. Here, an in-depth description of a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model for exploring the mechanisms of metastasis of solid organ tumors is provided. The survival surgical implantation of BNL 1ME A.7R.1 mouse hepatocellular carcinoma cells directly into the liver (the organ of origin) of the inbred wild-type immune competent laboratory mouse strain, BALB/c is described. The success and reproducibility of this methodology recommends it for widespread use in elucidating the biological mechanisms of solid organ cancer metastasis.

A &quot;Patient-Like&quot; Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The metastatic spread of cancer is the major cause of cancer-related deaths. We provide an in-depth description of our survival surgery methodology for establishing a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model system for studying the mechanisms of metastasis in solid organ tumors.

Ein &quot;Patient-Like&quot; Orthotope Syngene Maus-Modell der Leberzellkarzinom Metastasen

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of ...

Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice

Osmotic pumps continuously deliver compounds at a constant rate into small animals. This article introduces a standard protocol used to induce aortic aneurysms via subcutaneous infusion of angiotensin II (AngII) from implanted osmotic pumps. This protocol includes calculation of AngII amount and dissolution, osmotic pump filling, implantation of osmotic pumps subcutaneously, observation after pump implantation, and harvest of aortas to visualize aortic aneurysms in mice. Subcutaneous infusion of AngII through osmotic pumps following this protocol is a reliable and reproducible technique to induce both abdominal and thoracic aortic aneurysms in mice. Infusion durations range from a few days to several months based on the purpose of the study. AngII 1,000 ng/kg/min is sufficient to provide maximal effects on abdominal aortic aneurysmal formation in male hypercholesterolemic mouse models such as apolipoprotein E deficient or low-density lipoprotein receptor deficient mice. Incidence of abdominal aortic aneurysms induced by AngII infusion via osmotic pumps is 5 - 10 times lower in female hypercholesterolemic mice and also lower in both genders of normocholesterolemic mice. In contrast, AngII-induced thoracic aortic aneurysms in mice are not hypercholesterolemia or gender-dependent. Importantly, multiple features of this mouse model recapitulate those of human aortic aneurysms.

Subcutaneous implantation of osmotic pumps provides a convenient approach for prolonged and consistent delivery of compounds. This approach has been used extensively to study both abdominal and thoracic aortic aneurysms in mice.

Subkutane Angiotensin-II-Infusion mit osmotischen Pumpen induziert Aortenaneurysmen bei Mäusen

Osmotic pumps continuously deliver compounds at a constant rate into small animals.  This article introduces a standard protocol used to induce aortic ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Depletion von Maus-Zellen aus menschlichem Tumorxenografte deutlich verbessert Downstream-Analyse von Zielzellen

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Expression of Exogenous Cytokine in Patient-derived Xenografts via Injection with a Cytokine-transduced Stromal Cell Line

Patient-derived xenograft (PDX) mice are produced by transplanting human cells into immune deficient mice. These models are an important tool for studying the mechanisms of normal and malignant hematopoiesis and are the gold standard for identifying effective chemotherapies for many malignancies. PDX models are possible because many of the mouse cytokines also act on human cells. However, this is not the case for all cytokines, including many that are critical for studying normal and malignant hematopoiesis in human cells. Techniques that engineer mice to produce human cytokines (transgenic and knock-in models) require significant expense before the usefulness of the model has been demonstrated. Other techniques are labor intensive (injection of recombinant cytokine or lentivirus) and in some cases require high levels of technical expertise (hydrodynamic injection of DNA). This report describes a simple method for generating PDX mice that have exogenous human cytokine (TSLP, thymic stromal lymphopoietin) via weekly intraperitoneal injection of stroma that have been transduced to overexpress this cytokine. Use of this method provides an in vivo source of continuous cytokine production that achieves physiological levels of circulating human cytokine in the mouse. Plasma levels of human cytokine can be varied based on the number of stromal cells injected, and cytokine production can be initiated at any point in the experiment. This method also includes cytokine-negative control mice that are similarly produced, but through intraperitoneal injection of stroma transduced with a control vector. We have previously demonstrated that leukemia cells harvested from TSLP-expressing PDX, as compared to control PDX, exhibit a gene expression pattern more like the original patient sample. Together the cytokine-producing and cytokine-negative PDX mice produced by this method provide a model system that we have used successfully to study the role of TSLP in normal and malignant hematopoiesis.

Described here is a method for producing exogenous cytokine in patient-derived xenograft (PDX) mice via weekly intraperitoneal injection of a cytokine-transduced stromal cell line. This method broadens the utility of PDX and provides the option for transient or sustained exogenous cytokine delivery in a multitude of PDX models.

Expression von exogenem Cytokin in Patient-abgeleiteten Xenotransplantaten über Injektion mit einer Cytokin-transduzierten Stromzelllinie

Patient-derived xenograft (PDX) mice are produced by transplanting human cells into immune deficient mice. These models are an important tool for studying ...