Name: creating anatomically accurate and reproducible intracranial xenografts of human brain tumors
Uploaded: 2014-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
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Il dottor Keating è finanziato da DOD CA100335 concessione ed è un San Baldrick Foundation Scholar.

Tutte le procedure descritte sono stati esaminati e approvati dal nostro cura degli animali e l&#39;uso comitato istituzionale. 1 Piano Experiment <ol><li> Scegli le cellule da iniettare. Le cellule provenienti da una varietà di fonti sono candidati per l&#39;iniezione: aderenti linee di coltura cellulare, cloni geneticamente modificati, cellule neurosfere, colture primarie, o tumori disaggregati. Il tipo di modello desiderato definirà la sede più idonea di iniezione. <ol><li> Determinare il numero di cellule per l&#39;iniezione. Il numero di cellule necessario per formare tumori varia con la linea cellulare e deve essere determinato empiricamente; tasso di crescita tumorale dipende fortemente dal tipo di cellulare, numero di cellulare e numero di colture di tessuti passaggio. Numeri di cellulari che vanno da 1 x Ottobre 04-2 x 10 5 o più per iniezione hanno prodotto tumori di varie tassi di crescita. </li><li> Limitare il volume per l&#39;iniezione. Le cellule devono essere sospese nel più piccolo volume di siero media liberi o fosfato tamponata sAline (PBS) che permette di regolare, facile passaggio attraverso un ago 26 G. Il più piccolo il volume effettivamente consegnato nel cervello, il più preciso e definito il tumore risultante; Risultati ottimali si ottengono iniettando volumi che variano da 3 a 6 microlitri. Piano di preparare un volume totale finale di almeno 50 ml di cellule in sospensione, indipendentemente dal numero di iniezioni pianificate, per consentire misurazioni accurate, miscelazione e campionamento. </li></ol></li><li> Scegli topi appropriato per il modello. Modelli murini di tumori umani in genere utilizzano giovani topi immuno-compromessi per evitare rigetto immunitario mediata. Non è necessario per il lavoro che si terrà in una cappa di sicurezza biologica se vengono prese precauzioni appropriate, compresa la decontaminazione, disinfezione e sterilizzazione di materiali e attrezzature. Il lavoro qui mostrato è stato fatto in topi nudi atimici, maschi e femmine, tra i 6 e 12 settimane di età. I topi che pesano meno di 20 g può essere difficile da posizionare cometelaio tereotaxic e può essere più suscettibile di ipotermia. </li></ol> 2 Montare l&#39;apparecchiatura <ol><li> Ottenere e decontaminare un mouse telaio stereotassico, console di allineamento, e porta la testa anestesia gas del mouse, pompa microsiringa, rilievo di calore, macchina per anestesia, lampada da lavoro in fibra ottica, e trapano rotante a velocità variabile. Pulire e decontaminare tutte le attrezzature. </li><li> Programmare i parametri di iniezione (tra cui il volume di iniezione, la portata, unità di tasso, tipo siringa) e altre variabili necessarie per il funzionamento della pompa a siringa. Ottimizzare le impostazioni per ogni modello particolare. NOTA: In queste iniezioni le impostazioni erano 3.000 campioni nl ad una velocità di 400 nl / min (unità di tasso &quot;M&quot;) utilizzando una siringa da 25 ml (Device Type &quot;E&quot;), modalità nel Non-raggruppati (&quot;N&quot;). </li><li> Pulire una microsiringa di precisione con il 26 ago G con diversi risciacqui di acqua deionizzata sterile (diH 2 O) e il 70% di etanolo (EtOH), facendo un ri finalense con diH 2 O. Alcuni, ma non tutti i modelli sono progettati per essere sterilizzati in autoclave. Accertarsi che il movimento del pistone è liscia e libera. </li><li> Ottenere apparecchiature per anestesia. Isoflurano è l&#39;anestetico preferito in quanto è facile da regolare la profondità e la durata dell&#39;anestesia. Assicurarsi che l&#39;unità stereotassica è dotata di un attacco di gas per anestesia del mouse e che il tubo e connettori necessari sono in atto per fornire la miscela di gas dalla macchina per anestesia al mouse. </li><li> Strumenti chirurgici Autoclave, tra cui forbici a punta fine, due pinze / pinze emostatiche (con denti) per sutura, forbici di medie dimensioni, pinzette medio e punta fine, e almeno due punte dentali 1 mm. Mantenere gli strumenti puliti durante la procedura con il 70% EtOH, disinfettante, o uno sterilizzatore tallone. </li><li> Ottenere isoflurano, analgesico, unguento oftalmico / lubrificante, pomata antibiotica, soluzione salina, il 30% di perossido di idrogeno (H 2 O 2), antisettico, e cera ossea (se desiderato) da unfornitura veterinario o medico. Preparare sterile diH 2 O e il 70% EtOH. Usa e getta, come garze, medicazioni sterili, suture, tamponi di cotone, etanolo punta tamponi, guanti chirurgici sterili, lame chirurgiche e più sono dettagliate nella lista dei materiali. Un bel pennarello indelebile punta per la marcatura del cranio deve essere decontaminata e dedicato per uso chirurgico. </li></ol> 3 Preparare Celle per iniezione <ol><li> Negli esperimenti qui riportati, selezionare una linea di cellule GBM umano immortalato. Determinare il numero di cellule (2 x 10 5) e il volume di sospensione da iniettare (3 ml) empiricamente; dettagli possono variare con il tipo di cellule. Usare un volume di almeno 50 ml di facilitare misurazione accurata, miscelazione e iniezione. </li><li> Trypsinize cellule e risospendere in media o PBS. Effettuare le seguenti operazioni appena prima dell&#39;iniezione di cellule: <ol><li> Rimuovere i supporti dalle cellule mediante aspirazione e lavare con 10 ml di PBS per mm piastra 100; rimuovi PBS. </li><li> Annunciod 1 ml di tripsina per ogni piastra mm 100 e incubare a RT giusto il tempo di produrre una sospensione di cellule singole. </li><li> Interrompere l&#39;attività di tripsina con 5 ml di coltura di Dulbecco modificato (DMEM) + 10% di siero fetale bovino (FBS) per mm piastra 100. </li><li> Cellule pellet per centrifugazione a 450 xg e risospendere in ~ 5 ml di siero DMEM libero (SF-DMEM) per mm piastra 100. </li><li> Contare cellule vitali mediante un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato. </li><li> Regolare la densità delle cellule dal vivo per 2 x 10 5 cellule / 3 ml (o come determinato da sperimentazione) di pellet e risospendere le cellule in SF-DMEM. </li></ol></li><li> Mantenere le cellule refrigerate su ghiaccio o una confezione freddo (non consentono alle cellule di congelare). Mescolare delicatamente schioccare le dita. </li></ol> 4. Anestetizzare e Preparare il mouse per Chirurgia <ol><li> Indurre l&#39;anestesia utilizzando ~ 5% isoflurano (ossigeno flusso ~ 2 L / min) o come indicato dal veterinario. Induzione dovrebbe prendere 2 a 3 min. Mantenere il mouse ad una profondità adeguatadi anestesia con ~ 3% isoflurano. <ol><li> Controllare la profondità di anestesia pizzico punta, regolare isoflurano se indicato e continuare a monitorare la respirazione e la punta risposta pizzico tutta la procedura. Coprire mouse con garze per calore e controllare il mouse regolarmente durante tutta la procedura, che può richiedere 45 minuti a 1 ora, a seconda del tasso di iniezione. </li></ol></li><li> Posizionare il mouse nel telaio stereotassico trascinando con attenzione la barra palato sulla lingua e nella bocca. Agganciare gli incisivi anteriori nel foro del dente. Utilizzare barre orecchio per stabilizzare la testa, con la superficie orecchio-a-occhio il più vicino possibile orizzontale. Non forzare bar nel condotto uditivo. E &#39;fondamentale per posizionare la testina in modo sicuro: controllare il movimento da lato a lato e su-e-giù delicatamente con i polpastrelli. Utilizzare i controlli di regolazione dell&#39;unità stereotassico per ottimizzare vestibilità. </li><li> Lubrificare gli occhi con pomata oftalmica. Pulire la pelle tra le orecchie e gli occhi due volte con alternanza di applicazioni di un povidone-iodine antisettico e il 70% EtOH. </li><li> Iniettare per via sottocutanea analgesico scelto (SQ) in fianco (o come indicato). </li></ol> 5 Eseguire iniezione <ol><li> Determinare il sito di iniezione. Il sito di iniezione può variare con le dimensioni e la tensione del mouse e il tipo di cellula. Cellule iniettate troppo vicino ai ventricoli possono portare alla diffusione cranio-spinale della malattia. Cellule iniettate troppo superficiale possono crescere attraverso il percorso dell&#39;ago. NOTA: Negli esperimenti qui riportati, l&#39;obiettivo è stato definito come la regione frontale della corteccia cerebrale un sito 2,5 millimetri laterale (destra) 1,5 mm anteriormente e 3,5 mm ventrale rispetto al bregma è stato scelto (Figura 1), producendo un tumore mesencefalo nei topi che vanno da 20 a 30 g. </li><li> Fai una piccola incisione (~ lunga 8 mm) con tecnica sterile attraverso la pelle della testa per esporre il bregma e il sito di iniezione. Un taglio diagonale, da un punto tra l&#39;asse mediana e l&#39;occhio destro verso l&#39;orecchio destro ( <strong&gt; Figura 2) consente l&#39;accesso sia al bregma e il sito di iniezione. </li><li> Ritrarre la pelle e utilizzare un tampone di cotone sterile per asciugare la superficie del cranio. Tamponare l&#39;osso con un altro tampone inumidito con H 2 O 2 per visualizzare bregma. L&#39;H 2 O 2 produrrà bolle di ossigeno, lasciando le linee sottili di schiuma bianca lungo le suture coronali e sagittali che si intersecano al bregma. </li><li> Bloccare una siringa vuota con ago sulla micropompa e manovrare la punta dell&#39;ago direttamente sopra il bregma; set di coordinate sulla console di allineamento a 0,0 mm lateralmente, 0,0 millimetri anteriore / posteriore e 0,0 millimetri ventrale / dorsale. </li><li> Spostare l&#39;ago a 2,5 mm lateralmente (destra) ea 1,5 mm anteriormente rispetto al bregma (o posizione desiderata) utilizzando le manopole di controllo sull&#39;unità stereotassico. Sollevare la siringa leggermente e segnare la posizione esatta sul cranio con un pennarello apposito. Se la superficie esterna del cranio non è in piano con bregma (i.e., la dorsale / ventrale coordinate non più legge zero), ripristinare il ventrale / dorsale a leggere per 0,0 al fine di garantire che la profondità della iniezione non viene spostato. </li><li> Praticare un piccolo foro nel cranio con un trapano rotativo portatile dotato di una punta sterile dentale presso il sito appropriato contrassegnati con la penna al punto 5.5. Tenere il trapano in un angolo al cranio e toccare molto delicatamente la punta all&#39;osso. Ripetere se necessario. Foratura quasi ma non completamente attraverso l&#39;osso, lasciando l&#39;ago per penetrare effettivamente questo strato del cranio, comporta l&#39;iniezione pulito. </li><li> Rimuovere la polvere di osso con un batuffolo di cotone inumidito in PBS o soluzione salina. Ritorna la siringa alla pompa e abbassare l&#39;ago verso il basso per il buco bava per confermare la posizione. Se il buco bava non è centrato con l&#39;ago, usare il trapano per allargare l&#39;apertura. </li><li> Mescolare delicatamente la sospensione cellulare e disegnare le celle nella siringa utilizzando il controller della pompa. Evitare bolle e grumi e pulire l&#39;arguzia agoh un tampone imbevuto di alcool per rimuovere le cellule contaminanti sulla superficie esterna. Se la siringa / ago è ostruito o congelato, rimuovere e pulire subito con acqua sterile e il 70% EtOH. </li><li> Abbassare l&#39;ago al livello della superficie del cranio (0,0 millimetri ventrale / dorsali). Poi, lentamente (in circa 1 min) abbassare l&#39;ago per perforare attraverso l&#39;intero spessore del cranio e penetrare il cervello ad una profondità di quattro millimetri ventrall. Estrarre l&#39;ago lentamente a 3,5 mm ventrale. Se la testa del mouse viene tenuto saldamente nell&#39;unità stereotassico, ci dovrebbe essere quasi nessun movimento del cranio. </li><li> Verificare che i parametri corretti nel controller della pompa (sezione 2.2) e premere il tasto &quot;RUN / STOP&quot; (o come indicato dal manuale del prodotto) per autoinject cellule. Monitorare il mouse e regolare isoflurano se indicato. Guarda la siringa e verificare che il pistone si muove in canna. Movimento congelato o intasato può risultare in un piegato / pistone rotto. </li><li> Attendere da 1 a 2 min con l&#39;ago in bpioggia, poi molto lentamente (più di 3 a 4 min) ritirare l&#39;ago dal tessuto. Tempo totale per rimuovere l&#39;ago dopo l&#39;iniezione è completa si trova a 5 min. Usare un tampone di cotone per asciugare la zona intorno al foro bava; lasciare i bordi della pelle aperta per consentire l&#39;osso asciugare. </li><li> Togliere la siringa dalla pompa e sciacquare rapidamente 3x con H 2 O sterile, 3x con il 70% EtOH, e 3 volte con H 2 O sterile (o come indicato dal produttore). Pulire ago con EtOH e mettere da parte. </li><li> Applicare la cera ossea sterile (equivalente a 1 o 2 ml) al foro bava e utilizzare l&#39;estremità di legno di un tampone di cotone sterile per tamp la cera sopra e nell&#39;osso. Se la superficie viene essiccato adeguatamente, dovrebbe attaccare. </li><li> Stendere telo sterile su tutta l&#39;area di lavoro del mouse e dintorni e suturare l&#39;incisione; tre punti dovrebbero essere sufficienti. In alternativa, è possibile utilizzare l&#39;adesivo chirurgico. Applicare un antibiotico topico. </li><li> Ridurre isoflurano al 0% e rimuovere il mouse dall&#39;unità stereotassico, essendo careful per proteggere i denti. Controllare le orecchie, la bocca e la lingua. </li><li> Monitorare il mouse vicino dopo l&#39;iniezione. Posizionare il mouse su un rilievo di calore per 5 a 10 minuti; poi il trasferimento a gabbia (il rilievo di calore) e osservare il mouse fino a quando si sveglia ed è ambulatoriale. Non lasciare incustodito il mouse fino a quando non ha ripreso coscienza sufficiente per mantenere prona sternale. Non restituire mouse per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione. Considerare l&#39;uso di analgesici supplementari se i segni di dolore sono notati. </li></ol> 6 Fine e Monitor Recovery e lo sviluppo del tumore <ol><li> Pulire tutti gli strumenti e le attrezzature che utilizzano il 70% EtOH, uno sterilizzatore perlina o disinfettante tra i topi. </li><li> Monitorare i topi iniettati per due giorni dopo la procedura per i segni di dolore, infezioni o altre complicazioni. Iniettare analgesico a 24 e 48 ore (o come indicato) dopo la procedura. Rimuovere suture a 7 a 10 giorni, se necessario. </li><li> Valutare i topi per i segni clinici della malattia, paralysis, diminuzione dell&#39;attività, perdita di peso, convulsioni, o malattia generale. </li><li> Monitorare lo sviluppo del tumore con i mezzi adeguati [risonanza magnetica (MRI), in vivo Imaging Systems (IVIS), ecc]. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Modelli di mouse ortotopico di cancro al cervello umano può essere un ottimo strumento per valutare l&#39;efficacia delle terapie cliniche, ma la cura deve essere presa per ottimizzare il posizionamento delle cellule nel tessuto cerebrale. Studi hanno dimostrato che eccessivi volumi aliquote, tecnica di iniezione ottimale e tassi di iniezione affrettate possono portare a mancanza di tenuta e la comparsa di cellule tumorali in luoghi indesiderati (ventricoli, midollo spinale, regioni extradurali, ecc.) E alta v...

Studi in vitro su cellule tumorali del cervello sono di valore inestimabile per sezionare i meccanismi molecolari che guidano la crescita, la sopravvivenza, la migrazione e l&#39;invasione delle cellule tumorali; esperimenti sulle cellule in coltura possono definire vie di segnalazione, suggerire potenziali bersagli terapeutici, e caratterizzare la risposta cellulare al trattamento farmacologico. Ma in vitro sistemi sono troppo semplicistico per predire la risposta ai farmaci organismal; mancano le reazioni fisiologiche, le risposte immunitarie, microambiente cellulare, e eterogeneità complessiva dei sistemi viventi animali. Geneticamente modelli di ingegneria può essere prezioso, quando disponibile, ma esistono differenze molecolari tra le specie e le cellule murine non può ricapitolare gli eventi in processi umani, con conseguente discrepanze significative quando si confrontano modelli animali di osservazioni cliniche 1. Modelli di xenotrapianto topi, che comporta sottocutanea (SQ) iniezione di linee cellulari tumorali del cervello umano sotto la pelle del fianco sono facili da eseguiree misurare; essi possono essere usati per affrontare gli effetti di modificazione genica e la somministrazione del farmaco / consegna, metabolismo e tossicità. Inconvenienti di rilievo, tuttavia, limitano l&#39;utilità dei modelli SQ. Il microambiente non ricapitolare quello di un tumore cerebrale naturale: le interazioni dei vari tipi di cellule e tessuti; la vascolarizzazione locale, e una miriade di altri fattori unica per il cervello non possono essere replicati. Per riprodurre in modo più accurato l&#39;ambiente unico di un tumore al cervello naturale e testare gli effetti degli interventi farmaceutiche, un modello ortotopico mouse dovrebbe essere utilizzato. Inoltre, le tecniche di ortotopici può essere utilizzato come parte di un approccio geneticamente in cui le cellule non cancerose umane primarie (differenziate o progenitore) sono geneticamente modificati e iniettato nel sito in questione di un mouse, con o senza cellule dello stroma umane, con conseguente tumorigenesi simile a quello osservato negli esseri umani 1. Questo articolo descriveuna metodologia per creare con precisione e riproducibile tumori cerebrali nei topi. Usando questa tecnica, l&#39;utente può iniettare con precisione una piccola aliquota di cellule sospese in una posizione specificata della regione fronto-parieto-temporale del mouse corteccia cerebrale. Mortalità del mouse è estremamente basso; nelle nostre mani, non i topi sono morti per complicazioni chirurgiche dopo 185 procedure. Caratteristiche del tumore risultante può essere confrontato con quello dei tumori clinici tipici; per esempio: rapidità di crescita, il grado di necrosi, estensione dell&#39;invasione, eterogeneità di tipo cellulare, la presenza di cellule mitotiche, marcatori di proliferazione e apoptosi, ecc linee cellulari e campioni di tessuto o disaggregati tumorali umane possono quindi essere valutati in base alla loro capacità di per simulare la presentazione clinica reale. Pharmaceuticals, selezionati in base alle loro performance in coltura cellulare, possono essere testati nel contesto di un metabolismo funzionante, sistema circolatorio, e la barriera emato-encefalica, come esistono in un animale gravato witah tumore, il tutto in un contesto architettonico rilevante. Inoltre, le cellule scelti per l&#39;iniezione possono essere geneticamente modificati per studiare l&#39;impatto di atterramenti specifiche, delezioni, knock-in, le mutazioni, ecc sulla crescita del tumore e la sopravvivenza. Un certo numero di pubblicazioni documentano tumori studi che utilizzano una varietà di tecniche intracraniche. Yamada et al. Ha fatto uno studio dettagliato della iniezione di colorante e di cellule U87 e ha scoperto che riducendo al minimo il volume di iniezione e la tariffa prodotto il migliore tumore 2. . Brooks et al trovato riproducibilità superiore e l&#39;efficienza mediante un iniettore controllato da microprocessore piuttosto che un metodo manuale per fornire vettori virali; le loro conclusioni in materia di parametri di iniezione ottimali sono applicabili alla consegna delle cellule 3. Shankavaram et al. Hanno dimostrato che glioblastoma multiforme (GBM) linee di cellule iniettate ortotopicamente (utilizzando un metodo manuale) nel cervello ricapitolato il profilo di espressione genica del cltumori inical più strettamente che sia in xenotrapianti vitro o SQ, sostenendo l&#39;utilizzo di modelli intracranici per gli studi preclinici 4. Giannini et al. Cellule da campioni chirurgici umani che erano stati sostenuti nei fianchi di topi nudi da passaging seriale nel cervello di topi ulteriori iniettato, e ha dimostrato che questo approccio conservato paziente alterazioni del gene del tumore nel modello 5. Risultati simili sono stati riportati da Yi et al 6. Utilizzando una configurazione stereotassico, sito di iniezione ben definita, e una velocità di iniezione lento e costante, ottennero tumori cerebrali riproducibili con tassi di crescita costanti e alto (100%), tasso di attecchimento. La validità di questa tecnica è stato quindi ben definito; una ricerca di letteratura suggerisce che le applicazioni di questa tecnica sono ampie. Carty et al. Usato iniezioni intracraniche di consegnare con successo vettori virali esprimenti geni terapeutici nella corteccia frontale di transgenic modello della malattia di Alzheimer 7. Thaci et al. Ha descritto l&#39;uso di iniezioni intracraniche di consegnare terapeutico adenovirus oncolitici in un supporto a base neurale delle cellule staminali in topi nudi già trasportano ortotopicamente iniettati tumori GBM 8. Chiaramente, le iniezioni intracraniche sono uno strumento versatile ed efficace per la ricerca preclinica. Pubblicazioni precedenti in The Journal of Experiments Visualizzato descrivono approcci fondamentali 9-11, ma prendiamo il concetto di iniezione intracranica del tumore e la modellazione ortotopico a un livello superiore di precisione utilizzando la tecnologia facile da padrone.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console</td><td>Kopf</td><td>Model 940</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Gas Anesthesia Head Holder</td><td>Kopf</td><td>Model 923-B</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Ear Bars</td><td>Kopf</td><td>Medel 922</td><td></td></tr><tr><td>Fiber Optic Illuminator</td><td>Fisher</td><td>12-562-36</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicroPump III</td><td>WPI</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>Micro4 microprocessor</td><td>WPI</td><td>UMC4</td><td></td></tr><tr><td>Variable speed hand-held rotary drill</td><td>Dremel</td><td>Model 300</td><td></td></tr><tr><td>Dental drill bit, 1.0 mm</td><td>Spoelting</td><td>514554</td><td></td></tr><tr><td>Adaptor for dental drill bit: 3/32 inch collet</td><td>Dremel</td><td>481</td><td></td></tr><tr><td>Heating pad</td><td></td><td></td><td>for mice</td></tr><tr><td>Isoflurane vaporizer system</td><td></td><td></td><td>for mice</td></tr><tr><td>Medical tubing and connectors</td><td></td><td></td><td>to connect isoflurane vaporizer with stereotaxic frame</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Instruments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Precision 25 &amp;mu;l microsyringe</td><td>Hamilton&amp;nbsp;</td><td>7636-01</td><td>Model 702, without needle</td></tr><tr><td>Microsyringe needles, 26s G</td><td>Hamilton&amp;nbsp;</td><td>7804-04</td><td>RN, 25 mm point style 2</td></tr><tr><td>Fine-tipped scissors (straight, sharp/sharp)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medium-sized standard scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standard serrated forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serrated hemostats (2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine-tipped forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Supplies&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sutures 5-0 vicryl P-3 13 mm (Ethicon)</td><td>MWI</td><td>J463G</td><td></td></tr><tr><td>Surgical blades #10, stainless (Feather)</td><td>Fisher</td><td>296#10</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane (Fluriso)&amp;nbsp;</td><td>VetOne&amp;nbsp;</td><td>NDC 13985-528-60</td><td>Item #502017. Liquid inhalation anesthetic. federal law restricts this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian.</td></tr><tr><td>Carprofen (Rimadyl Injectable 50 mg/ml)</td><td>Pfizer</td><td>NDC 61106-8507-01</td><td>dilute in saline</td></tr><tr><td>Ophthalmic ointment (artificial tears)</td><td>Rugby</td><td>NDC 0536-6550-91</td><td></td></tr><tr><td>Topical antibiotic (AK-Poly-Bac )</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-238-35</td><td></td></tr><tr><td>Povidone-iodine topical antiseptic, 10% (Betadine)</td><td>Betadine</td><td>NDC 67618-150-04</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide, 30%</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>H325-100</td><td>for visualizing skull landmarks</td></tr><tr><td>Sterile saline</td><td>VetOne&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>NDC 13985-807-25</td><td>for diluting solutions, cleaning tissue</td></tr><tr><td>Bone wax</td><td>WPI</td><td>Item #501771</td><td></td></tr><tr><td>Sterile drapes</td><td>McKesson</td><td>25-517</td><td></td></tr><tr><td>Sterile surgical gloves</td><td>McKesson</td><td>(to fit)</td><td></td></tr><tr><td>Sterile gauze pads, 2 x 2</td><td>Fisherbrand&amp;nbsp;</td><td>22028556</td><td></td></tr><tr><td>Sterile gauze pads, 4 x 4</td><td>Fisherbrand&amp;nbsp;</td><td>22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol prep pads (medium)</td><td>PDI</td><td>B603</td><td></td></tr><tr><td>Sterile cotton-tipped applicators</td><td>Fisherbrand&amp;nbsp;</td><td>23-400-114</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 0.5 ml screw cap tube with caps for cells</td><td>USA Scientific</td><td>1405-4700</td><td>for cells</td></tr><tr><td>Individually wrapped sterile dispo pipettes</td><td>Fisher</td><td>BD 357575</td><td>for needle cleaning solutions</td></tr><tr><td>BD insulin syringes with needles&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>329461</td><td>for analgesic</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td></td><td></td><td>for cleaning</td></tr><tr><td>Sterile diH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td>for cleaning</td></tr><tr><td>Microfuge tubes for cleaning solutions</td><td></td><td></td><td>for needle cleaning solutions</td></tr><tr><td>Felt tip pen (dedicated)</td><td></td><td></td><td>for marking skull</td></tr></tbody></table>

creating anatomically accurate and reproducible intracranial xenografts of human brain tumors

Modelli di tumore ortotopico sono attualmente il modo migliore per studiare le caratteristiche di un tipo di tumore, con e senza l&#39;intervento, nel contesto di un animale vivo - in particolare in siti con caratteristiche uniche fisiologici e architettonici come il cervello in vitro e modelli ectopiche non possono. tenere conto di caratteristiche quali vasi, il sangue barriera del cervello, il metabolismo, somministrazione di farmaci e la tossicità, e una miriade di altri fattori rilevanti. Modelli ortotopico hanno i loro limiti troppo, ma con adeguate cellule tumorali tecnica di interesse possono essere innestate con esattezza in tessuto che più strettamente imita le condizioni nel cervello umano. Utilizzando metodi che forniscono i volumi misurati con precisione a definire con precisione posizioni ad una velocità costante e pressione, modelli murini di tumori cerebrali umani con tassi di crescita prevedibili possono essere riproducibile creati e sono adatti per un&#39;analisi attendibile dei vari interventi. Il protocollo qui descritto si concentra sul tedettagli chnical di progettazione e preparazione per l&#39;iniezione intracranica, eseguire l&#39;intervento chirurgico, e garantire la crescita del tumore e di successo riproducibile e fornisce i punti di partenza per una serie di condizioni che possono essere personalizzati per una vasta gamma di diversi modelli di tumore al cervello.

Xenotrapianti intracranica affidabili possono essere creati con questa tecnica descritta. Identificare le strutture critiche del cranio del mouse (Figura 1), consentirà il riconoscimento del bregma e guidare il ricercatore in una posizione di iniezione precisa e riproducibile. In questi studi la linea parentale U251, U251 cellule trasfettate con luciferasi (U251-Luc), o U87 immortalato cellule di coltura di tessuti GBM umani sono stati sospesi a 4-6 ml di SF-DMEM e iniettato 2,5 millimetri laterale (a ...

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Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors

Il cervello è un sito unico con qualità che non sono ben rappresentati da in vitro o analisi ectopiche. Modelli di mouse ortotopico con caratteristiche di localizzazione e di crescita riproducibili possono essere attendibilmente creati con iniezioni intracraniche utilizzando uno strumento di fissazione stereotassico e una pompa a siringa a bassa pressione.

Creazione anatomicamente accurati e riproducibili intracranica xenotrapianti di tumori cerebrali umani

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

15.5K Views.  University of Colorado School of Medicine.  Il cervello è un sito unico con qualità che non sono ben rappresentati da in vitro o analisi ectopiche. Modelli di mouse ortotopico con caratteristiche di localizzazione e di crescita riproducibili possono essere attendibilmente creati con iniezioni intracraniche utilizzando uno strumento di fissazione stereotassico e una pompa a siringa a bassa pressione. 

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Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging

Transplantation models using human brain tumor cells have served an essential function in neuro-oncology research for many years. In the past, the most commonly used procedure for human tumor xenograft establishment consisted of the collection of cells from culture flasks, followed by the subcutaneous injection of the collected cells in immunocompromised mice. Whereas this approach still sees frequent use in many laboratories, there has been a significant shift in emphasis over the past decade towards orthotopic xenograft establishment, which, in the instance of brain tumors, requires tumor cell injection into appropriate neuroanatomical structures. Because intracranial xenograft establishment eliminates the ability to monitor tumor growth through direct measurement, such as by use of calipers, the shift in emphasis towards orthotopic brain tumor xenograft models has necessitated the utilization of non-invasive imaging for assessing tumor burden in host animals. Of the currently available imaging methods, bioluminescence monitoring is generally considered to offer the best combination of sensitivity, expediency, and cost. Here, we will demonstrate procedures for orthotopic brain tumor establishment, and for monitoring tumor growth and response to treatment when testing experimental therapies.

Luciferase-modified human brain tumor xenografts can be established intracranially in athymic mice, with subsequent monitoring of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. In combination with survival analysis, bioluminescence monitoring is an essential research tool for pre-clinical testing of therapies being considered for treating brain tumors.

Stabilire intracranica xenotrapianti Brain Tumor Con successiva analisi della crescita tumorale e risposta alla terapia con Imaging bioluminescenza

Transplantation models using human brain tumor cells have served an essential function in neuro-oncology research for many years. In the past, the most ...

Ricerca

Neuroscienze

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma (glioma) and medulloblastoma. The widely used stereotactic approach only allows for the injection of a single animal at a time, is labor intensive and requires highly specialized equipment. The guide screw method, initially developed by Lal et al.,1 was developed to eliminate cumbersome stereotactic procedures. We now describe a modified guide screw approach that is rapid and exceptionally safe; both of which are critical ethical considerations. Notably, our procedure now incorporates an infusion pump that allows up to 10 animals to be simultaneously injected with tumor cells.
To demonstrate the utility of this procedure, we established human U87MG glioma cells as intracranial xenografts in mice, which were then treated with AMG102; a fully human antibody directed to HGF/scatter factor currently undergoing clinical evaluation2-5. Systemic injection of AMG102 significantly prolonged the survival of all mice with intracranial U87MG xenografts and resulted in a number of complete cures. 
This study demonstrates that the guide screw method is an inexpensive, highly reproducible approach for establishing intracranial xenografts. Furthermore, it provides a relevant physiological model for validating novel therapeutic strategies for the treatment of brain cancers.

In order to evaluate novel therapeutic paradigms for the treatment of glioma, physiological relevant models are essential. We utilize an implantable guide screw procedure for establishment of intracranial xenograft models that is more rapid and safer than stereotactic approaches.

Un semplice metodo vite Guida per intracranica Studi dello xenotrapianto in topi

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

Medicina

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality treatment consisting of surgical resection, post-operative radiation therapy and temozolomide chemotherapy 1. New therapeutic approaches are clearly needed to improve patient survival and quality of life. The development of more effective treatment strategies would be aided by animal models of GBM that recapitulate human disease yet allow serial imaging to monitor tumor growth and treatment response. In this paper, we describe our technique for the precise stereotactic implantation of bio-imageable GBM cancer cells into the brains of nude mice resulting in tumor xenografts that recapitulate key clinical features of GBM 2. This method yields tumors that are reproducible and are located in precise anatomic locations while allowing in vivo bioluminescent imaging to serially monitor intracranial xenograft growth and response to treatments 3-5. This method is also well-tolerated by the animals with low perioperative morbidity and mortality.

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

We describe an integrated method for the precise, stereotactic implantation of human glioblastoma multiforme cells into the brains of nude mice and subsequent serial in vivo imaging to monitor growth and response to treatment of the resultant xenografts.

Stereotassica impianto intracranico e<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging Bioluminescent di xenotrapianti di tumori in un sistema modello del mouse di Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality ...

Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are particularly devastating, difficult to treat, and confer a poor prognosis. While the precise incidence of brain metastases in the United States remains hard to estimate, it is likely to increase as extracranial therapies continue to become more efficacious in treating cancer. Thus, it is necessary to identify and develop novel therapeutic approaches to treat metastasis at this site. To this end, intracranial injection of cancer cells has become a well-established method in which to model brain metastasis. Previously, the inability to directly measure tumor growth has been a technical hindrance to this model; however, increasing availability and quality of small animal imaging modalities, such as magnetic resonance imaging (MRI), are vastly improving the ability to monitor tumor growth over time and infer changes within the brain during the experimental period. Herein, intracranial injection of murine mammary tumor cells into immunocompetent mice followed by MRI is demonstrated. The presented injection approach utilizes isoflurane anesthesia and a stereotactic setup with a digitally controlled, automated drill and needle injection to enhance precision, and reduce technical error. MRI is measured over time using a 9.4 Tesla instrument in The Ohio State University James Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource. Tumor volume measurements are demonstrated at each time point through use of ImageJ. Overall, this intracranial injection approach allows for precise injection, day-to-day monitoring, and accurate tumor volume measurements, which combined greatly enhance the utility of this model system to test novel hypotheses on the drivers of brain metastases.

Intracranial brain metastasis modeling is complicated by an inability to monitor tumor size and response to treatment with precise and timely methods. The presented methodology couples intracranial tumor injection with magnetic resonance imaging analysis, which when combined, cultivates precise and consistent injections, enhanced animal monitoring, and accurate tumor volume measurements.

Modellazione delle metastasi cerebrali attraverso l'iniezione intracraniciale e la risonanza magnetica

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are ...

Ricerca sul cancro

Primary Orthotopic Glioma Xenografts Recapitulate Infiltrative Growth and Isocitrate Dehydrogenase I Mutation

Malignant gliomas constitute a heterogeneous group of highly infiltrative glial neoplasms with distinct clinical and molecular features. Primary orthotopic xenografts recapitulate the histopathological and molecular features of malignant glioma subtypes in preclinical animal models. To model WHO grades III and IV malignant gliomas in transplantation assays, human tumor cells are xenografted into an orthotopic site, the brain, of immunocompromised mice. In contrast to secondary xenografts that utilize cultured tumor cells, human glioma cells are dissociated from resected specimens and transplanted without prior passage in tissue culture to generate primary xenografts. The procedure in this report details tumor sample preparation, intracranial transplantation into immunocompromised mice, monitoring for tumor engraftment and tumor harvesting for subsequent passage into recipient animals or analysis. Tumor cell preparation requires 2 hr and surgical procedure requires 20 min/animal.

Malignant gliomas constitute a heterogeneous group of highly infiltrative glial neoplasms with distinct clinical and molecular features. Primary orthotopic xenografts recapitulate the histopathological and molecular features of malignant glioma subtypes in preclinical animal models.

Gli xenoinnesti glioma ortotopici primari ricapitolano la crescita infiltrativa e la mutazione isocitrato deidrogenasi I

Malignant gliomas constitute a heterogeneous group of highly infiltrative glial neoplasms with distinct clinical and molecular features. Primary ...

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology rely on the injection of a suspension of glioma cells into the brain parenchyma following incision of the dura-mater. Whereas the cells have to be injected superficially to be accessible to intravital two-photon microscopy, superficial injections fail to recapitulate the physiopathological conditions. Indeed, escaping through the injection tract most tumor cells reach the extra-dural space where they expand abnormally fast in absence of mechanical constraints from the parenchyma.
Our improvements consist not only in focally implanting a glioma spheroid rather than injecting a suspension of glioma cells in the superficial layers of the cerebral cortex but also in clogging the injection site by a cross-linked dextran gel hemi-bead that is glued to the surrounding parenchyma and sealed to dura-mater with cyanoacrylate. Altogether these measures enforce the physiological expansion and infiltration of the tumor cells inside the brain parenchyma. Craniotomy was finally closed with a glass window cemented to the skull to allow chronic imaging over weeks in absence of scar tissue development.
Taking advantage of fluorescent transgenic animals grafted with fluorescent tumor cells we have shown that the dynamics of interactions occurring between glioma cells, neurons (e.g. Thy1-CFP mice) and vasculature (highlighted by an intravenous injection of a fluorescent dye) can be visualized by intravital two-photon microscopy during the progression of the disease.
The possibility to image a tumor at microscopic resolution in a minimally compromised cerebral environment represents an improvement of current GBM animal models which should benefit the field of neuro-oncology and drug testing.

We have established a cortical orthotopic glioblastoma model in mice for intravital two-photon microscopy that recapitulates the biophysical constraints normally at play during the growth of the tumor. A chronic glass window replacing the skull above the tumor enables the follow-up of the tumor progression over time by two-photon microscopy.

Un ortotopico Glioblastoma modello di mouse mantenimento di vincoli Cervello parenchimale fisiche e adatto per intravitale due fotoni Microscopia

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Translational Orthotopic Models of Glioblastoma Multiforme

Genetically engineered mouse (GEM) models for human glioblastoma multiforme (GBM) are critical to understanding the development and progression of brain tumors. Unlike xenograft tumors, in GEMs, tumors arise in the native microenvironment in an immunocompetent mouse. However, the use of GBM GEMs in preclinical treatment studies is challenging due to long tumor latencies, heterogeneity in neoplasm frequency, and the timing of advanced grade tumor development. Mice induced via intracranial orthotopic injection are more tractable for preclinical studies, and retain features of the GEM tumors. We generated an orthotopic brain tumor model derived from a GEM model with Rb, Kras, and p53 aberrations (TRP), which develops GBM tumors&#160;displaying linear foci of necrosis by neoplastic cells, and dense vascularization analogous to human GBM. Cells derived from GEM GBM tumors are injected intracranially into wild-type, strain-matched recipient mice and reproduce grade IV tumors, therefore bypassing the long tumor latency period in GEM mice and allowing for the creation of large and reproducible cohorts for preclinical studies. The highly proliferative, invasive, and vascular features of the TRP GEM model for GBM are recapitulated in the orthotopic tumors, and histopathology markers reflect human GBM subgroups. Tumor growth is monitored by serial MRI scans. Due to the invasive nature of the intracranial tumors in immunocompetent models, carefully following the injection procedure outlined here is essential to prevent extracranial tumor growth.

Here, we describe a preclinical orthotopic mouse model for GBM, established by intracranial injection of cells derived from genetically engineered mouse model tumors. This model displays the disease hallmarks of human GBM. For translational studies, the mouse brain tumor is tracked by in vivo MRI and histopathology.

Modelli ortotopici traslazionali di glioblastoma multiforme

Genetically engineered mouse (GEM) models for human glioblastoma multiforme (GBM) are critical to understanding the development and progression of brain ...

Establishment of Orthotopic Patient-derived Xenograft Models for Brain Tumors using a Stereotaxic Device

The development of clinically relevant and reliable models for central nervous system (CNS) tumors has been pivotal in advancing the field of neuro-oncology. One of the most widely used techniques is the orthotopic intracranial injection, a method that allows investigating of tumor growth, invasion, and dissemination within a controlled setting. This technique involves transplanting tumor cells from a specific patient region into the corresponding anatomical site in an animal. By doing so, these orthotopic brain tumor models offer a unique advantage, as they more accurately replicate cancer's biological behavior and its interactions with the brain environment seen in human patients. This makes them especially valuable for preclinical therapeutic testing, where a close resemblance to the clinical scenario is essential for evaluating potential treatments. This protocol shares experiences in developing patient-derived xenograft (PDX) models for pediatric brain tumors, including diffuse midline glioma (DMG), glioblastoma (GBM), medulloblastoma, and ependymoma. This method delineates the procedure for conducting intracranial stereotaxic injections in mice, ensuring the correct targeting of the injection site within the brain. Additionally, we describe the post-procedural monitoring system employed to detect signs of successful tumor engraftment. Following tumor injection, a rigorous monitoring system is implemented to observe the animals for any signs of neurological impairment, behavioral changes, and/or weight loss, which are common indicators of tumor progression. This system allows for timely intervention and provides critical data regarding the tumor's growth dynamics. By refining these models and protocols, we aim to enhance the reliability and translational potential of preclinical studies, contributing to the development of more effective treatments for pediatric CNS tumors.

The development of orthotopic pediatric brain tumor models requires meticulous precision, using a stereotaxic device to implant cancer cells precisely. The methodology presented here outlines the steps involved in preparing brain tumor cells, performing intracranial injections, and implementing a post-operative monitoring system to assess brain tumor engraftment.

The development of clinically relevant and reliable models for central nervous system (CNS) tumors has been pivotal in advancing the field of ...

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce efficient therapies have been proposed over the last decade. Among the promising candidates for designing novel therapeutic strategies, cellular immunotherapies have been targeted to eliminate highly invasive and chemo-radioresistant tumor cells, likely involved in a rapid and fatal relapse of this cancer. Thus, administration(s) of allogeneic GBM-reactive immune cell effectors, such as human V&#978;9V&#948;2 T lymphocytes, in the vicinity of the tumor would represents a unique opportunity to deliver efficient and highly concentrated therapeutic agents directly into the site of brain malignancies. Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a preclinical proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of these cellular immunotherapies that rely on stereotactic injections of allogeneic human lymphocytes within intrabrain tumor beds.

Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of intrabrain-delivered cellular immunotherapies.

Trasferimento adottivo stereotactic di citotossici cellule immunitarie nei modelli murini di xenotrapianti Multiforme di Glioblastoma umano ortotopico

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...

Immunologia e infezioni

Intranasal Delivery of Therapeutic Stem Cells to Glioblastoma in a Mouse Model

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of therapeutic stem cells via the intranasal route is a recently discovered alternative strategy, with strong potential for clinical translation, due to its non-invasive nature compared to intracranial implantation or delivery via systemic routes. The lack of blood brain barrier further strengthens the therapeutic potential of stem cells undergoing intranasal brain entry. This article summarizes the essential techniques utilized in our studies and outlines the basic principles of intranasal strategy for stem cell delivery using a mouse model of intracranial glioma xenografts. We demonstrate the optimized procedures that generate consistent and reproducible results with specific predetermined experimental parameters and offer guidelines for streamlined work flow that ensure efficient execution and reliable experimental outcome. The article is designed to serve as a baseline for further experimental customization based on hypothesis, stem cell types, or tumor specifics.

Stem cells are promising therapeutic carriers to treat brain tumors due to their intrinsic tumor tropism. Non-invasive intranasal stem cell delivery bypasses the blood brain barrier and demonstrates strong potential for clinical translation. This article summarizes the basic principles of intranasal stem cell delivery in a mouse model of glioma.

Intranasale consegna delle cellule staminali terapeutiche a Glioblastoma in un modello di mouse

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of ...