Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus NIH (5K22A1119151-01 und 1R56DK104903-01) zu MLB, Pilot / Machbarkeits Programm des Diabetes Research Center (P30-DK079638) bei BCM, JDRF 1-FAC-2014-243-AN APF, ADA unterstützt 1-15-JF-07, AAI Karriere in Immunology Fellowship MB und The Robert und Janice McNair-Stiftung.

Ethik - Statement: Es wird alles unternommen Tier Beschwerden oder Stress auf ein Minimum während der Bestrahlung und Schwanzvene Injektionen zu halten. Mäuse werden als Quelle der Zellen in diesen Experimenten verwendet wird; als solche sind keine Verfahren oder Manipulationen abgesehen von Euthanasie. Die Mäuse werden durch CO 2 Inhalation durch Genickbruch folgte eingeschläfert Tod zu bestätigen. Dieses Verfahren ist mit den Empfehlungen des Gremiums für Euthanasie von der American Veterinary Medical Association konsistent. 1. Bereiten Sie Retrovirale Construct <ol><li> Sub-Klon der T-Zell - Rezeptor (TCR) alpha und beta - Ketten, durch ein 2A - Linker getrennt sind , in eine MSCV-basierenden retroviralen Vektor 11 (beispielsweise pMIAII oder pMIGII) 11. HINWEIS: Die 2A Linkers ermöglicht stöchiometrische und konkordant Expression der alpha- und beta-TZR-Ketten von einem einzelnen offenen Leserahmen. Der Vektor enthält eine IRES fluoreszierendes Protein Kassette (ametrine oder GFP), das verwendet wird, umSpur transduzierten Zellen und Transduktionseffizienz. Für eine detaillierte Protokoll finden Sie unter Holst et al. 11 </li><li> Isolieren Plasmid-DNA im Handel erhalten Plasma-Prep-Kit oder ein ähnliches Produkt. Verwenden Sie eine Arbeitskonzentration von 1 bis 2 &amp; mgr; g &amp; mgr; l -1. </li></ol> 2. Erzeugung von Retrovirale Producer-Zelllinien <ol><li> Verwenden einen zweistufigen Prozess die retrovirale Produzentenzelllinien zu erzeugen. HINWEIS: Für ein ausführliches Protokoll, sehen Sie bitte Holst et al . 11. <ol><li> Generieren Retrovirus durch transiente Transfektion von 293T - Zellen mit drei Plasmiden (pVSVG, PEQ-Pam3 (-E) und Vektor von Interesse 11) und nehmen Sie die retrovirale Überstand von den 293T - Zellen die GP + E86 ekotropischen retroviralen Produzentenzelllinie zu transduzieren. </li><li> Isolieren Sie die oberen 40% der fluoreszierenden exprimierenden GP + E86 produzierenden Zellen durch FACS und propagieren die transdcuced-GP + E86 Produzentenzellen als Quelle des Virus. HINWEIS: Die Erzeugungvon hohem Titer Erzeuger ist kritisch für eine effiziente Transduktion von Knochenmarkszellen. Für eine vollständige Protokoll bitte Holst et al anzuzeigen. 11 </li></ol></li></ol> 3. Retrovirus-vermittelte Stem Cell Gene Transfer (Tag -5) <ol><li> Auftauen und Kultur 0,5 -1,0 x 10 6 jedes GP + E86 Produktionszelllinie in komplettem DMEM 10% (vol / vol) FBS ein ausreichendes Wachstum für zwei konfluenten 150-mm - Platten von Tag 0 dieses Protokolls zu ermöglichen. HINWEIS: Thawing 0,5 - 5. 50% Konfluenz am Tag Dies gilt auch für 5 Tage der Kultur, um den GP + E86 zu erweitern ermöglicht - 1,0 x 10 6 jedes GP + E86 Produktionszelllinie in einem 10 - cm - Platte für 30 erlauben Hersteller-Zelllinien zu zwei konfluenten 150-mm-Platten von Tag 0. <ol><li> Kultur retroviralen Producer-Zelllinie in vollständiger Gewebekulturmedien, enthaltend 5% Kälberserum Feta und Ciprofloxacin (10 ug / ml) Mycoplasma-Kontamination zu vermeiden. Hinweis: Die Verwendung von Ciprofloxacin brechen, wenn generating der virale Überstand für Knochenmarkübertragung. Vermeiden Sie über Wachstum der Erzeugerzelllinie, da diese sich negativ auf Knochenmark Transduktionswirksamkeit auswirken wird. </li></ol></li></ol> 4. Inject Spendermäusen mit 5-Fluorouracil (5-FU) (Tag -3) <ol><li> Wiegen Sie die Spendermäuse (5-12 Wochen alt) erforderlich, um die Menge an 5-FU zu bestimmen. Mit Mäuse jünger als 5 Wochen alt Ergebnisse in Ausbeute gering Knochenmark. Um sicherzustellen, dass die Expression eines einzelnen TCR, verwenden Sie eine T-Zell-defizienten Mausstamm wie SCID, RAG oder TCR alpha defizienten Mäusen als Knochenmarkspender. </li><li> Zu liefern , 0,15 mg 5-FU pro Gramm Körpergewicht Arbeiten in der Gewebekultur Haube verdünnen Sie die 5-FU Lager mit sterilem PBS , um eine ausreichende Menge von 10 mg ml -1 Arbeitslösung von 5-FU zu machen. </li><li> Unter Verwendung einer 1 ml Spritze mit einer 37 G Nadel injiziert intraperitoneal 0,15 mg 5-FU pro Gramm Körpergewicht pro Spendermaus. HINWEIS: Verwenden Sie 1 Spendermaus pro Empfänger zu starten und zu justierendie Anzahl von Spendermäusen nach der Zellausbeute. Ein alternatives Verfahren zu den 5-FU - Behandlung zur Anreicherung und Isolierung von Knochenmarksvorläuferzellen ist die negative Selektion von Lineage - positiven Zellen , wie in Viret et al. </li></ol> 5. Knochenmark-Extraktionsverfahren (Tag 0) <ol><li> Erhalten Dissektion Schere und Pinzette für die Knochen Isolation. Bereiten Medien (HBSS, ergänzt mit 5% FCS (vol / vol)) Knochen in einem 50 ml konischen Röhrchen zu sammeln. Halten Sie 50 ml konischen haltigen Medien auf Eis. Euthanize Mäuse durch CO 2 Inhalation durch Genickbruch folgte Tod zu bestätigen. Pinch Pfote um sicherzustellen, dass keine Reflexe erkannt. </li><li> Sterilisieren der Operationsstelle und chirurgische Werkzeuge mit Ethanol oder Methanol. Entfernen Sie den Femur, Tibia, Humerus, und Beckengürtel sorgfältig indem zuerst nach oben und unter dem Beckengürtel. Schnitt zurück nach unten entlang des Oberschenkels an der Tibia. Entfernen Sie das gesamte umliegende Gewebe Schere und Pinzette sauberen Knochen zu erhalten. BehaltenKnochen in HBSS + 5% (vol / vol) FBS hydratisiert. </li><li> Trennen Sie die Knochen von an den Gelenken schneiden, um sicherzustellen, beide abzuschneiden endet in jedem Knochen. Legen Sie eine 25-Gauge-Nadel in eine 10-ml-Spritze befestigt enthält HBSS + 5% (vol / vol) FBS. Wenden Sie Druck und spülen Sie alle Knochenmark durch einen 70 &amp; mgr; m Sieb ruht in einem 50 ml konischen. </li><li> Von Zeit zu Zeit, drücken Sie die Knochenmark durch die 70-um-Filter den Kolben aus einer 1 ml oder 3 ml Spritze. Spülen Sie das Sieb mit HBSS + 5% (vol / vol) FBS. Dies wird eine Zellsuspension gewährleisten, die frei von Knochenfragmenten und Gewebe. Halten Zellen steril durch das Verfahren in einer sterilen Haube durchgeführt wird. </li><li> Zentrifuge Knochenmarkszellen bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C. </li></ol> 6. Knochenmark-Kultur (Tag 0) <ol><li> Dekantieren oder absaugen Medien und resuspendieren Zellpellet in 1 ml Ammoniumchlorid-Basis roten Blut Lysepuffer (oder gleichwertig RBC-Lyse-Puffer) pro 50 ml konischen Röhrchen. Nach 1 min Inkubation bei RaumTemperatur, quenchen die rote Puffer Zelllyse durch 10 ml vollständigem DMEM 20% (Vol / Vol) FBS hinzugefügt wird. </li><li> Zentrifugen Zellen bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Dekantieren oder absaugen Überstand und resuspendieren Knochenmark in 5 ml komplettem DMEM 20% (vol / vol) FBS. Zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer-Zählkammer. HINWEIS: Allgemeine Ausbeute sollte ca. 5 - 10 x 10 6 Zellen pro Maus; jedoch kann die Ausbeute bei den verschiedenen Stämmen von Mäusen variieren. </li><li> Platte Knochenmarkzellen in einer Dichte von 4 x 10 7 Zellen pro 150 mm-Platte in 30 ml vollständigem DMEM 20% (Vol / Vol) FBS ergänzt mit IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1) und SCF (50 g ml -1). HINWEIS: Verwenden Sie frisch aufgetauten-aliquotiert Zytokinen. Verwenden Sie keine Cytokine, die eingefroren wurden und aufgetaut als einmal oder bei 4 ° C für mehr als 2 Wochen gehalten. </li><li> Inkubieren über Nacht Knochenmark (ca. 24 h) bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li></ol><ol><li> Platte 3 x 10 6 retroviralen Erzeugerzellen pro 150 mm-Platte in 18 ml vollständigem DMEM - 20% (Vol / Vol) FBS. </li><li> Inkubieren retroviralen Erzeugerzellen bei 37 ° C über Nacht. Antizipieren einer 150-mm-Platte für 15 Millionen Knochenmarkzellen (ca. 2 - 3 Donormäusen). </li></ol> 8. Retroviral Supernatant (Tag 1) <ol><li> Am nächsten Tag (etwa 24 Stunden später), ernten den retroviralen Überstand von den Produzenten Platten durch die Erstellung des retroviralen Überstand direkt aus der 150-mm-Platte mit einer 10-ml-Spritze und Filter mit einem 0,45 (in Schritt 7 eingestellt ist) -μm Spritzenfilter. </li><li> ersetzen Sie vorsichtig den entfernten retroviralen Überstand mit 18 ml frischem komplettem DMEM 20% (vol / vol) FBS. </li><li> Ergänzung des gefilterten retroviralen Überstand mit IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1), MSCF (50 g ml -1) und Hexadimethrinbromid (Polybrene) (6 &amp;# 956; g ml -1). HINWEIS: Hexadimethrinbromid sollten frisch alle 2 Monate gemacht werden, um einen Rückgang der Wirksamkeit der retroviralen Transduktion zu vermeiden. </li></ol> 9. Knochenmark-Ernte (Tag 1) <ol><li> Nach Abschluss von Schritt 8.3, ernten die Knochenmarkzellen aus Schritt 6.4 und übertragen Sie die Medien nicht adhärenten Zellen in sterile 50-ml-Röhrchen enthält. </li><li> Waschen Sie die Platten kräftig mit 10 ml PBS und sammeln sich in der 50-ml-Erlen aus Schritt 9.1. Falls erforderlich, wiederholen Sie den Waschschritt. </li><li> Zentrifuge die Zellen bei 300 · g für 10 min bei 4 ° C, dekantiert den Überstand, resuspendiere Zellen in einem kleinen Volumen (1 - 3 ml) komplett DMEM 20% (Vol / Vol) FBS und zählen. Antizipieren von 50 bis 75% Rückgewinnung von Tag 0 Resuspendieren Knochenmark bei 1 x 10 6 Zellen pro 1 ml des retroviralen Überstand Zytokinen und Hexadimethrinbromid enthält. </li></ol> 10. Bone Marrow Transduction (Tag 1) <ol><li> Platte des retroviralen Überstand / Knochen marrow Mischung mit einem Volumen von 3 ml pro Vertiefung in einer Sechs-Well-Gewebekulturplatte. Wickeln Sie die Platten in der Plastikverpackung um einen Gasaustausch während der Zentrifugation in Schritt 10.2 minimieren. </li><li> Dreh die gewickelt Sechs-Well-Platten bei 1.000 xg für 60 min ein 37 ° C. </li><li> Nach dem Spin abgeschlossen ist, entfernen Sie die Plastikfolie und legen Sie die Platten in einem 37 ° C CO 2 Inkubator für 24 Stunden. </li></ol> 11. Retroviral Supernatant und Transduction (Tag 2) <ol><li> Nach 24 Stunden sammeln frische Virusüberstand aus der viralen Hersteller-Zelllinie. Filtriere den retroviralen Überstand unter Verwendung einer 10-ml-Spritze und eine 0,45-um-Spritzenfilter. Ergänzung des gefilterten retroviralen Überstand mit IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1) und SCF (50 g ml -1) und Hexadimethrinbromid (6 g ml -1). </li><li> Als nächstes vorsichtig mit Pipette entfernen oder die obersten 2 ml Medium aus jeder Vertiefung der Sechs-Well-Platte aspirieren die Knochenmarkszellen enthält,. HINWEIS: Arbeit sorgfältig nicht das Knochenmark anzusaugen, die in der Regel in der Mitte der Vertiefung konzentriert wird. Alternativ kann der abgenommenen versponnen werden Sie sich alle verlorenen Knochenmarkszellen zu erholen. </li><li> Zu jeder Vertiefung im Knochenmark 6-Well-Platte 3 ml frischem viralen Überstand mit Zytokinen und Hexadimethrinbromid. Wickeln Sie die Platten aus Kunststoff, und wiederholen Sie die Spinübertragung bei 1.000 × g für 60 min ein 37 ° C. Auszupacken , die Platten und Inkubieren Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 über Nacht (etwa 24 h). </li></ol> 12. Zugabe von frischem Ergänzte DMEM (Tag 3) <ol><li> Nach 24 Stunden die Top 2 ml Medium aus jeder Vertiefung der Sechs-Well-Platte entfernen Sie die Knochenmarkzellen, wie in Schritt 11.2 enthält. Ersetzen Sie die entfernt Medien mit frischem DMEM 20% (vol / vol) FBS mit Endkonzentrationen von IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1) und SCF (50 g ml -1) . </li><li> Inkubieren KnochenmarkPlatten bei 37 ° C CO 2 Inkubator für weitere 24 hr. </li></ol> 13. Ernte transduzierten Knochenmark (Tag 4) <ol><li> Nach 24 Stunden, sammeln die Knochenmarkszellen aus den Sechs-Well-Platten. Waschen Sie die Platten kräftig mit PBS alle nicht-adhärente Zellen zu entfernen. <ol><li> Zentrifugieren der Zellen bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C und dekantiert den Überstand. </li><li> Resuspendieren des Knochenmarks in einem kleinen Volumen (1 ml) PBS + 0,5% (vol / vol) hitzeinaktiviertem FBS. Halten Sie Zellen auf Eis. </li></ol></li><li> Nehmen Sie eine 10-ul-Probe jeder Knochenmark Zustand und zählen Sie die Zellen, die eine Neubauer-Zählkammer verwendet wird. Unter der Annahme , 1 - mindestens 4 x 10 6 Zellen zu übertragen pro Empfängermaus 2 - Donor pro Empfänger, wird die Ausbeute ausreichend sein. Resuspendieren des Knochenmarks in einem ausreichenden Volumen von PBS + 0,5% (vol / vol) hitzeinaktiviertem FBS 200 einzuspritzen - 300 &amp; mgr; l pro Maus. <ol><li> Injizieren mindestens 2 x 10 6 Zellen mit einer Transduktionseffizienz(injizieren bis zu 8 x10 6 Zellen) pro Maus intravenös von 25%. HINWEIS: Es wird routinemßig fünf Empfängermäuse injizieren pro zwei Platten mit 6 Vertiefungen von Knochenmarkszellen. Wenn die Ausbeute wesentlich geringer, mehr Donormäusen ist, sollte bis kann eine ausreichende Knochenmark verwendet werden Zahl erhalten werden. Um eine optimale Wiederherstellung zu erreichen, von mindestens 5 x 10 5 transduzierte (fluoreszierend positive) sollte in jedem Empfänger injiziert werden. </li></ol></li><li> Mit einem Mikro - Pipette, nehmen Sie eine 10-ul - Probe von jeder Bedingung Knochenmark und Transduktionseffizienz durch Fluss analysieren Zytometrie basierend auf der Expression des fluoreszierenden Marker (Abbildung 1A) 11. HINWEIS: In der Regel ist der Anteil der Fluoreszenz-positiven Zellen liegt zwischen 25% und 70%, abhängig von dem Konstrukt und retrovirale Titer. Die Zahl der transduzierten Knochenmarkzellen erforderlich a subletal bestrahlen Maus zu rekonstituieren kann abhängig von der Transduktionseffizienz variieren. Je niedriger die transduction Effizienz, benötigt die mehr Knochenmarkzellen und umgekehrt, je höher die Knochenmark Transduktionseffizienz, die geringere Anzahl von Zellen für die Rekonstitution benötigt. Transduktionseffizienz unter 25% ist suboptimal und kann zu einer unzureichenden Rekonstitution und Überleben führen. Um eine optimale Knochenmark Erholung und Transduktionseffizienz zu gewährleisten, verwenden Sie frisch zubereitete Gewebekulturmedien und Zytokinen. Wenn ein neues TCR Expression des retrogenic System verwendet wird , ist die Auswahl des TCR in vivo unbekannt. In Abhängigkeit von jedem einzelnen TCR - Affinität, TCR Selektion im Thymus und peripheren T - Zell - Expression wird 17 variieren. </li></ol> 14. Maus-Bestrahlung, Knochenmark-Injection und Pflege <ol><li> Bestrahlen Mäuse am Tag vor der Knochenmark-Injektion (am selben Tag wie Schritt 13). Verwenden Sie die folgenden Dosen: C57BL / 6 - Mäuse (und andere Wildtyp - Stämme), 900 rads; Rag1 - / - Mäuse, 500 Rad; SCID - Mäuse, 300 rad). <ol><li> Platz Empfängermäuse auf Amoxicillin (50 mg / kg / Tag) oder ein anderes Antibiotikum Wasserbehandlung vor der Bestrahlung, und halten Sie auf Antibiotika für die ersten zwei Wochen nach der Knochenmark-Injektion. HINWEIS: Die optimale Bestrahlungsdosis kann empirisch bestimmt werden müssen. </li></ol></li><li> Für die Injektion laden die Zellen aus Schritt 13.1 in eine 1-ml-Spritze mit stumpfen Nadeln unmittelbar vor der Injektion, dann Injektion die Nadel 27er ändern, zu vertreiben jegliche Luft Luftembolie zu vermeiden. Wärme Mäuse unter einer Wärmelampe und 0,2 ml Knochenmark pro Maus intravenös injiziert. HINWEIS: Lassen Sie sich nicht Zellen in der Spritze für längere Zeit oder die Zellen absetzen sitzen. </li><li> Überwachen Sie die Mäuse wöchentlich, um sicherzustellen, dass sie gesund bleiben. </li><li> Nach 5 - 6 Wochen, bluten die Mäuse zur Rekonstitution auf der Grundlage von GFP zu überprüfen + / ametrine + und TCR Co-Expression (Abbildung 1B) 11. </li></ol>

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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibitory+cytokine+IL-35+contributes+to+regulatory+T-cell+function.">The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function.</a> Nature. 450, 566-569 (2007).</li><li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+signaling+mediated+by+T+cell+antigen+receptor-CD3+ITAMs+ensures+effective+negative+selection+and+prevents+autoimmunity.">Scalable signaling mediated by T cell antigen receptor-CD3 ITAMs ensures effective negative selection and prevents autoimmunity.</a> Nature immunology. 9, 658-666 (2008).</li><li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+with+chimeric+antigen+receptors+have+potent+antitumor+effects+and+can+establish+memory+in+patients+with+advanced+leukemia.">T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia.</a> Sci Transl Med. 3, 95ra73 (2011).</li><li>VanSeggelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cells+Engineered+With+Chimeric+Antigen+Receptors+Targeting+NKG2D+Ligands+Display+Lethal+Toxicity+in+Mice.">T Cells Engineered With Chimeric Antigen Receptors Targeting NKG2D Ligands Display Lethal Toxicity in Mice.</a> Mol Ther. 23, 1600-1610 (2015).</li></ol>

Keine Interessenkonflikte erklärt.

In dem Protokoll wir ausführlich einige kritische Schritte optimale Knochenmark Gesundheit, Transduktionseffizienz und Rekonstitution zu gewährleisten. Erster wichtiger Schritt ist die Erzeugung und die ordnungsgemäße Wartung der GP + E86 Virusproduzentenzellen. Verwenden frühen Passage Produktionszelllinien und halten bei 80% Konfluenz oder niedriger vor der Verwendung. Wenn frisch machen viralen Produzentenzellen GP + E86, sicherzustellen, sind die 293T-Zellen frühen Passage und wachsen in der Kultur für 24 bis...

T - Zell - Rezeptor (TCR) Repertoire von Mensch und Maus wurde mit 1 x 10 8 und 2 x 10 6 einzigartige TCRs jeweils 1,2 geschätzt. Diese große Vielfalt ermöglicht T-Zellen eine Vielzahl von Antigen-Epitope aus selbst Peptiden sowie von Pathogenen dargestellt durch den Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) auf Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) abgeleitet zu erkennen. Die feinen Unterschiede in den Wechselwirkungen der TCRs mit einzigartigen Peptid-MHC-Komplexe diktieren, ob eine T-Zell-Apoptose durchlaufen wird, Anergie, Aktivierung, Differenzierung, Zytokinproduktion oder Zytotoxizität. Jedoch aufgrund der großen TCR-Repertoire, Analyse, wie ein spezifischer TCR zu einem bestimmten Antigen zu reagieren erfordert die Verwendung von einzelnen TCR-Systeme. Verschiedene TCR transgene Mäuse wurden erzeugt , um die Funktion eines einzelnen TCR in einem in vivo - Modell 3-9 zu studieren. Es gibt jedoch Einschränkungen transgenen Mäusen einschließlich der TCRKosten, die Länge der Zeit eine einzelne transgene Maus und die so genannte Gründereffekt von zufälligen Transgen - Insertion in die Keimbahn DNA 10 zu erzeugen. Daher relativ wenige TCR transgene Mäuse wurden für jede gegebene Antigen und die funktionellen Auswirkungen von hohen und niedrigen TCR-Affinität für das gleiche Epitop gerichtet werden selten erzeugt. Um die Notwendigkeit für eine schnelle Annäherung an Bildschirm - Adresse und mehrere TZR einzeln oder in Kombination, retrogenic ( &#39;retro&#39; von Retrovirus und &quot;gene&quot; von transgenen) Mäuse wurden als Alternative genutzt studieren 11-13 transgene Mäuse zu TCR. Die 2A Peptid Konsensusmotiv innerhalb von mehreren Viren gefunden bestehen aus einer 2A-Asp-Val / Ile-Glut-X-Asn-Pro-Gly-2B-Pro, bei der Spaltung zwischen dem Glycin der 2A und dem Prolin der 2B auftritt von cis - aktiven Hydrolase - Aktivität, was zu einer ribosomalen Skipping bei der Übersetzung 10,14-16. Für eine detaillierte Darstellung der c darstelltlaub der verschiedenen 2A Peptide (F2A, E2A, T2A und P2A) finden Sie auf Referenzen 10 - 12. Auf diese Weise zwei Cistrons (TCR alpha und TCR beta) können in einem einzigen Vektor was in stöchiometrischen Übersetzung verknüpft werden. Unter Verwendung dieses Ansatzes können wir zum Ausdruck bringen und direkt mehrere Antigen - spezifischen TZR in vivo vergleichen.

<table><tbody><tr><td>DMEM, high glucose + glutamine</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>Dulbecco&#039;s Modification of Eagle&#039;s Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine &amp;amp; sodium pyruvate</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biological</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Versene</td><td>Lonza</td><td>17-161F</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;#181;m syringe filter</td><td>Thermo Scientific</td><td>194-2545</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma</td><td>H9268-10G</td><td>Sterile Filtered in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Ciprofloxacin&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>AAJ61970-06</td><td></td></tr><tr><td>5-fluorouracil (5-FU)</td><td>VWR</td><td>AAA13456-06</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM nonessential Amino Acids</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M solution</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strept</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>150 mm tissue culture dishes</td><td>Greiner Bio-one</td><td>639160</td><td></td></tr><tr><td>Tisue culture-treated 6-well flat plate</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;#181;m nylon cell strainers</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-3</td><td>Invitrogen</td><td>PMC0033</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-6</td><td>Invitrogen</td><td>&amp;nbsp;PHC0063</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Stem Cell Factor</td><td>Invitrogen</td><td>PMC2113L</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Corning Cellgro</td><td>46-D13-CM</td><td></td></tr><tr><td>HANKS Buffer</td><td>Corning Cellgro</td><td>21020147</td><td></td></tr><tr><td>BD 10 ml Syringe</td><td>BD</td><td>300912</td><td></td></tr><tr><td>BD 1 ml Syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 1/2 BD Precision Glide Needle</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>30 G x 1/2 BD Precision Glide Needle</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr></tbody></table>

retroviral transduction of bone marrow progenitor cells to generate t-cell receptor retrogenic mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

Knochenmark Transduktionseffizienz bei Schritt 13.3 des Protokolls überprüft , bevor das Knochenmark in Schwanzvene iv In der repräsentativen bone marrow Transduktion Figur (1A) eingespritzt wird, ungefähr 10 &amp; mgr; l der geernteten Knochenmark wurden zu 100-ul PBS und für ametrine Expression analysiert. Im allgemeinen der Prozentsatz der fluoreszierenden positiven Zellen liegt zwischen 25% und 70%, abhängig von dem Konstrukt und retrovirale Titer. Nach 6 Woche...

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Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Retrovirale Transduktion von Knochenmark-Progenitorzellen zu generieren T-Zell-Rezeptor Retrogenic Mäuse

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.5K Aufrufe.  Baylor College of Medicine. We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Serie: Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Transduction-Transplantation Mouse Model of Myeloproliferative Neoplasm

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the gene of interest in hematopoietic cells and can be used to study the gene's role in normal and/or malignant hematopoiesis. This protocol provides a detailed description on how to perform transduction-transplantation using calreticulin (CALR) mutations recently identified in myeloproliferative neoplasm (MPN) as an example. In this protocol whole bone marrow cells from 5-flurouracil (5-FU) treated donor mice are transduced with a retrovirus encoding mutant CALR and transplanted into lethally irradiated syngeneic hosts. Donor cells expressing mutant CALR are marked with green fluorescent protein (GFP). Transplanted mice develop an MPN phenotype including elevated platelets in the peripheral blood, expansion of megakaryocytes in the bone marrow, and bone marrow fibrosis. We provide a step-by-step account of how to generate retrovirus, calculate viral titer, transduce whole bone marrow cells, and transplant into irradiated recipient mice.

This manuscript provides a description of the methodology used to establish transduction-transplantation mouse models. A detailed account is given of technical errors to avoid when performing bone marrow transplants. A clear understanding should be gained of the importance of high viral titer, transfection/transduction, and irradiation.

Transduction-Transplantation Maus-Modell der myeloproliferativen Neoplasien

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the ...

Forschung

Krebsforschung

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged antigen-specific T cell receptor (TCR) have been an indispensable tool to study T cell development and function. However, such TCRs are usually isolated from the relevant T cells after long-term culture often following repeated antigen stimulation, which unavoidably selects for T cells with high affinity. Random genomic integration of the TCR &alpha;- and &beta;-chain and expression from non-endogenous promoters can lead to variations in expression level and kinetics.
Epigenetic reprogramming via somatic cell nuclear transfer provides a tool to generate embryonic stem cells and mice from any cell of interest. Consequently, when SCNT is applied to T cells of known specificity, these genetic V(D)J rearrangements are transferred to the SCNT-embryonic stem cells (ESCs) and the mice derived from them, while epigenetic marks are reset. We have demonstrated that T cells with pre-defined specificities against Toxoplasma gondii can be used to generate mouse models that express the specific TCR from their endogenous loci, without experimentally introduced genetic modification. The relative ease and speed with which such transnuclear models can be obtained holds promise for the construction of other disease models.

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

We demonstrate here that epigenetic reprogramming via Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) can be used as a tool to generate mouse models with pre-defined T cell receptor (TCR) specificities. These transnuclear mice express the corresponding TCR from their endogenous locus under the control of the endogenous promoter.

Transnuclear Mäuse mit vordefinierten T-Zell-Rezeptor Spezifitäten gegen Toxoplasma gondii Via SCNT Erhalten

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Immunologie und Infektion

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control of a heterologous expression system to facilitate the analysis of the resulting phenotype. This approach can be used to express a gene that is not normally found in the organism, to express a mutant form of a gene product, or to over-express a dominant-negative form of the gene product. It is particularly useful in the study of the hematopoetic system, where transcriptional regulation is a major control mechanism in the development and differentiation of B cells 1, reviewed in 2-4.
Mouse genetics is a powerful tool for the study of human genes and diseases. A comparative analysis of the mouse and human genome reveals conservation of synteny in over 90% of the genome 5. Also, much of the technology used in mouse models is applicable to the study of human genes, for example, gene disruptions and allelic replacement 6. However, the creation of a transgenic mouse requires a great deal of resources of both a financial and technical nature. Several projects have begun to compile libraries of knock out mouse strains (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) or mutagenesis induced strains (RIKEN), which require large-scale efforts and collaboration 7. Therefore, it is desirable to first study the phenotype of a desired gene in a cell culture model of primary cells before progressing to a mouse model. 
Retroviral DNA integrates into the host DNA, preferably within or near transcription units or CpG islands, resulting in stable and heritable expression of the packaged gene of interest while avoiding transcriptional silencing 8 9. The genes are then transcribed under the control of a high efficiency retroviral promoter, resulting in a high efficiency of transcription and protein production. Therefore, retroviral expression can be used with cells that are difficult to transfect, provided the cells are in an active state during mitosis. Because the structural genes of the virus are contained within the packaging cell line, the expression vectors used to clone the gene of interest contain no structural genes of the virus, which both eliminates the possibility of viral revertants and increases the safety of working with viral supernatants as no infectious virions are produced 10. 
Here we present a protocol for recombinant retroviral production and subsequent infection of splenic B cells. After isolation, the cultured splenic cells are stimulated with Th derived lymphokines and anti-CD40, which induces a burst of B cell proliferation and differentiation 11. This protocol is ideal for the study of events occurring late in B cell development and differentiation, as B cells are isolated from the spleen following initial hematopoetic events but prior to antigenic stimulation to induce plasmacytic differentiation.

An efficient system of structure and function analysis of a gene in an ex vivo culture of splenic B-lymphocytes is described. This method takes advantage of recombinant retroviral production in a helper free, ecotrophic packaging cell line. Stable, heritable expression of a gene of interest within primary lymphocytes is achieved leading to generation of surface antibodies on B cells undergoing class switch recombination.

Rekombinanten retroviralen Produktion und Infektion von B-Zellen

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFR&#945;, etc.). We are able to model and study a human-like disease in our mouse model, by transplanting bone marrow cells previously infected with a retrovirus expressing the oncogene of interest. Replication-defective retrovirus encoding a human oncogene and a marker (GFP, RFP, antibiotic resistance gene, etc.) is produced by a transient transfection protocol using 293T cells, a human renal epithelial cell line transformed by the adenovirus E1A gene product. 293 cells have the unusual property of being highly transfectable by calcium phosphate (CaPO4), with up to 50-80% transfection efficiency readily attainable. Here, we co-transfect 293 cells with a retroviral vector expressing the oncogene of interest and a plasmid that expresses the gag-pol-env packaging functions, such as the single-genome packaging constructs kat or pCL, in this case the EcoPak plasmid. The initial transfection is further improved by use of chloroquine. Stocks of ecotropic virus, collected as culture supernatant 48 hrs. post-transfection, can be stored at -80&deg;C and used for infection of cell-lines in view of transformation and in vitro studies, or primary cells such as mouse bone marrow cells, that can then be used for transplant in our mouse model.

This technique demonstrates an efficient way to prepare replication-defective retroviral stocks encoding a human oncogene, and subsequently used for induction of myeloproliferative disease in the mouse model.

Produktion von replikationsdefekte Retrovirus durch transiente Transfektion von 293T-Zellen

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

Biologie

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Generieren<em&gt; De Novo</em&gt; Antigen-spezifische Zellrezeptoren humanen T von Retrovirale Transduktion von Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have been conducive to downstream in vivo functional analysis of TCR heterodimers. We have developed an improved protocol based on a two-step multiplex-nested PCR, which results in a PCR product that spans entire variable regions of a human TCR alpha and beta chains. By identifying unique restriction sites and incorporating them into the PCR primers, we have made the PCR product compatible with direct sub-cloning into the template retroviral vector. The resulting retroviral construct encodes a chimeric human/mouse TCR with a mouse intracellular domain, which is functional in mouse cells or in in vivo mouse models. Overall, the protocol described here combines human single cell paired TCR alpha and beta chain identification with streamlined generation of retroviral vectors readily adaptable for in vitro and in vivo TCR expression. The video and the accompanying material are designed to give a highly detailed description of the single cell PCR, so that the critical steps can be followed and potential pitfalls avoided. Additionally, we provide a detailed description of the cloning steps necessary to generate the expression vector. Once mastered, the whole procedure from single cell sorting to TCR expression could be performed in a short two-week period.

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

The current protocol combines single cell paired human TCR alpha and beta chain sequencing with streamlined generation of retroviral vectors compatible with in vitro and in vivo TCR expression.

Optimierte Einzelzelle TCR Isolation und Generierung von retroviralen Vektoren für In-Vitro und In Vivo Ausdruck menschlichen TCRs

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have ...

Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting from advances in genome editing technology and lentivirus-mediated transgene delivery systems, an efficient and economical method is described here that establishes mice in which genes are manipulated specifically in hematopoietic stem cells. Lentiviruses are used to transduce Cas9-expressing lineage-negative bone marrow cells with a guide RNA (gRNA) targeting specific genes and a red fluorescence reporter gene (RFP), then these cells are transplanted into lethally-irradiated C57BL/6 mice. Mice transplanted with lentivirus expressing non-targeting gRNA are used as controls. Engraftment of transduced hematopoietic stem cells are evaluated by flow cytometric analysis of RFP-positive leukocytes of peripheral blood. Using this method, ~90% transduction of myeloid cells and ~70% of lymphoid cells at 4 weeks after transplantation can be achieved. Genomic DNA is isolated from RFP-positive blood cells, and portions of the targeted site DNA are amplified by PCR to validate the genome editing. This protocol provides a high-throughput evaluation of hematopoiesis-regulatory genes and can be extended to a variety of mouse disease models with hematopoietic cell involvement.

Described are protocols for the highly efficient genome editing of murine hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) by the CRISPR/Cas9 system to rapidly develop mouse model systems with hematopoietic system-specific gene modifications.

Lentiviral CRISPR/Cas9-Vermittelte Genombearbeitung zur Untersuchung hämatopoetischer Zellen in Krankheitsmodellen

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting ...

Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production

As cell function is influenced by niche-specific factors in the cellular microenvironment, methods to dissect cell localization and migration can provide further insight on cell function. B-1a cells are a unique B cell subset in mice that produce protective natural IgM antibodies against oxidation-specific epitopes that arise during health and disease. B-1a cell IgM production differs depending on B-1a cell location, and therefore it becomes useful from a therapeutic standpoint to target B-1a localization to niches supportive of high antibody production. Here we describe a method to target B-1a cell migration to the bone marrow by retroviral-mediated overexpression of the C-X-C motif chemokine receptor 4 (CXCR4). Gene induction in primary murine B cells can be challenging and typically yields low transfection efficiencies of 10-20% depending on technique. Here we demonstrate that retroviral transduction of primary murine B-1a cells results in 30-40% transduction efficiency. This method utilizes adoptive cell transfer of transduced B-1a cells into B cell-deficient recipient mice so that donor B-1a cell migration and localization can be visualized. This protocol can be modified for other retroviral constructs and can be used in diverse functional assays post-adoptive transfer, including analysis of donor cell or host cell phenotype and function, or analysis of soluble factors secreted post B-1a cell transfer. The use of distinct donor and recipient mice differentiated by CD45.1 and CD45.2 allotype and the presence of a GFP reporter within the retroviral plasmid could also enable detection of donor cells in other, immune-sufficient mouse models containing endogenous B cell populations.

Here we describe a method for retroviral overexpression and adoptive transfer of murine B-1a cells to examine in vivo B-1a cell migration and localization. This protocol can be extended for diverse downstream functional assays including quantification of donor B-1a cell localization or analysis of donor cell-derived secreted factors post-adoptive transfer.

Retrovirale Überexpression von CXCR4 auf murine B-1a-Zellen und Adoptivtransfer für gezielte B-1a-Zellmigration zur Knochenmark- und IgM-Produktion

As cell function is influenced by niche-specific factors in the cellular microenvironment, methods to dissect cell localization and migration can provide ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

Retrovirale Infektion von murinen embryonalen Stammzellen abgeleitete Embryoidkörper Zellen für die Analyse von hämatopoetischen Differenzierung

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...