Name: the analysis of neurovascular remodeling in entorhino-hippocampal organotypic slice cultures
Uploaded: 2014-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
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Diese Arbeit wurde von der Universität Basel, Departement Biomedizin, und dem Schweizerischen Nationalfonds (31003A_141007) unterstützt. Markus Saxer leistete technische Unterstützung.

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der EG-Richtlinie vom 22. September 2010 des Rates durchgeführt (2010/63 / EU) und wurden überprüft und durch die Schweizer Behörden zugelassen. 1. Einrichten Organotypische Entorhino-Hippocampus-Schnittkulturen <ol><li> Bereiten entorhino-Hippocampus organotypischen Kulturen (EHOSCs) von postnatalen Tag 4 (P4) Maus Welpen mit der statischen Methode Inkubation 4,11. Hier verwenden C57Bl6 und CB6F1 Mäusen. <ol><li> Nehmen Sie etwa 30 min pro Maus Welpen zur Herstellung von Schnittkulturen, dh 3 Stunden für einen Wurf von 6 Welpen Maus. Führen Sie alle Schritte unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Werkbank mit sterilisierten chirurgischen Instrumenten. </li><li> Um eine mögliche Störung von der Position der Scheibe entlang der Zeitachse-septo zu vermeiden, nur Hippocampus des medialen Hälfte. Wenn nicht anders angegeben, führen alle Schritte bei RT. </li></ol></li><li> Abgeschnitten ter Kopf eines P4 Maus Welpe mit chirurgischer Schere. Keine Betäubung für diesen Schritt erforderlich. <ol><li> Entfernen Sie den Schädel rund um das Gehirn und Identifizierung der Riss zwischen dem kaudalen Ende der Großhirnhemisphären und des Mittelhirns. Den Teil des Gehirns, rostral sorgfältig zu entfernen, um das Mittelhirn aus dem Schädel und legen Sie sie in eiskaltem Präparationsmedium, bestehend aus MEM mit einer stabilisierten Form von L-Glutamin. </li></ol></li><li> Fahren Sie mit der Präparation unter einem Stereomikroskop mit dem Gehirn in der eiskalten Herstellungsmedium eingetaucht. Entfernen Sie verbleibende Hirnhäute aus den kortikalen Hemisphären. Identifizierung der Hippocampus auf der medialen Schwanzfläche der Halbkugel und trennen sie zusammen mit dem benachbarten entorhinalen Kortex vom Rest des Gehirns. <ol><li> Übertragen Sie das Gewebe bis zu einer Gewebe Chopper und geschnitten 400 um dicke Scheiben unter aseptischen Bedingungen quer zur septo-zeitliche Achse des Hippocampus. </li></ol></li><li> Legen Sie die Scheiben auf cell Kultureinsätzen (ca. 6 Scheiben pro Platte) und inkubieren sie in 6-Well-Platten mit 1 ml pro Vertiefung Inkubationsmedium (47 ml MEM, 25 ml Eagle-Medium, 25 ml Pferdeserum, 1 ml Glutamax I, 1 ml einer sterile 10% Glucose-Lösung, pH 7,3) in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 bei 37 ° C aufweist. Ändern Sie den nächsten Tag und dann jeden zweiten Tag bis zu 1 Woche das Medium. </li></ol> 2. In-vitro-Hypoxie und Sauerstoff-Glukose-Entzug mit Reperfusion <ol><li> Siehe Tabelle 1 für eine genaue Zeitplan des Verfahrens. Kultur EHOSCs für 5 Tage (DIV5) vor der Einwirkung von Hypoxie oder OGD. Zu diesem Zeitpunkt schaltet das Medium vom Inkubationsmedium, enthaltend 25% Pferdeserum-freiem Medium mit der folgenden Zusammensetzung Serum: Neurobasalmedium mit 2% B27 Supplement, 1% Glutamax und zusätzlich 0,1% Glucose. </li><li> Bereiten Sie die OGD Medium wie in Referenz 7 .Der endgültigen Konzentrationen der Komponenten detailliert beschrieben wird, die folgenden: 0.3mM CaCl 2, 70 mM NaCl, 5,25 mM NaHCO 3, 70 mM KCl, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 2 mM MgSO 4 und 10 mM Saccharose bei pH 6,8. 1 ml der OGD Medium zu jeder Vertiefung von zwei 6-Well-Gewebekulturplatten. <ol><li> Versorgen die OGD-Medium mit N 2 für 1 Stunde in einem Hypoxie Kammer und dann versiegeln und zu halten O / N in einem Brutschrank bei 37 ° C. </li><li> Verwenden anaeroben Streifen als hypoxischen Indikatoren. Betrachten des Mediums, um sauerstofffrei sein, wenn die Farbe der Streifen geändert von rosa bis weiß. </li><li> Für die Induktion von Hypoxie, verwenden Serum-freiem Medium mit Glukose statt OGD Medium. Vor der Verwendung zur Perfusion des Mediums mit N 2 in einer Hypoxie Kammer wie oben für OGD Medium beschrieben. </li></ol></li><li> Bevor die Scheiben auf OGD ausgesetzt ist, versorgen die OGD Medium wieder mit N 2 für 30 min. Add 2 ul einer 1 mg / ml Propidiumiodid (PI)-Lösung pro Vertiefung (bei einer Endkonzentration von 2 ug / ml) mit den Scheiben für 30 min und wählennur gesunde Scheiben für Experimente wie die geringen Zahlen der PI-positiven Zellen angegeben. </li><li> Verwenden Sie den Zeitplan für die OGD-Exposition und Reperfusion in Abbildung 1 angegeben. Berauben Scheiben entweder Sauerstoff nur (Hypoxie) oder Sauerstoff und Glukose (OGD) für 15 min. <ol><li> Für die Induktion der Hypoxie oder OGD, übertragen Scheiben in OGD Medium und halten Sie für 15 Minuten in der Kammer Hypoxie. Sicherstellen, dass alle Flüssigkeiten, die an den Seiten des Einsatzes bleiben weg abgesaugt wenn die Kulturen von normalen Medium OGD Medium und zurück geschaltet. </li><li> Nach Hypoxie oder OGD, ersetzen Sie die OGD Medium mit sauerstoff Serum-freiem Medium und Kulturen dürfen für 3, 24 oder 48 Stunden in Serum-freiem Medium in der regulären Brutschrank bei 37 ° C mit 5% CO 2 zu erholen. PI hinzuzufügen wieder vor der Fixierung für die Bestimmung von Zelltod. </li></ol></li></ol> 3. pharmakologische Behandlungen von Entorhino-Hippocampus Organotypischen Kulturen <ol><li> CulturE EHOSCs für 5 Tage (DIV5) in Inkubationsmedium vor der Belichtung mit pharmakologischen Behandlungen. Starten pharmakologische Behandlungen entweder während oder unmittelbar nach der OGD OGD, wenn Scheiben, um Serum freien Medium übertragen. </li><li> Behandlungen zum Schutz vor OGD. <ol><li> Mit 100 uM 6-Cyano-7-nitrochinoxalin-2,3-dion (CNQX) und 1 uM Tetrodotoxin (TTX) zu dem Kulturmedium während der Induktions OGD (für 15 min) oder unmittelbar nach OGD Induktion für 30 min. Dann, Inkubation in normoxischen Serum freien Medium für 48 Stunden vor der Fixierung. </li></ol></li><li> Behandlungen für die Induktion von exzitotoxische Tod. <ol><li> Nach 5 Tagen in Inkubationsmedium Schalter Kulturen freien Medium, das 100 um (RS) -α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsäure (AMPA) 30 min Serum. </li><li> Entfernen Sie das Kulturmedium mit AMPA durch Aspiration (Vorsicht, um restliche Medium, auf Einsätze zu entfernen), dann übertragen Sie die Scheiben auf frische Platten mit normalen Serum-freiem Medium undhalten sie für 48 Stunden, bis Fixierung. </li></ol></li></ol> 4. Fixierung und Immunfärbung von Entorhino-Hippocampus Organotypischen Kulturen <ol><li> Propidiumiodid (PI)-Färbung. <ol><li> Hinzufügen PI für 30 min in das Kulturmedium von lebenden Scheiben in einer Konzentration von 2 ug / ml. Live-View-Kulturen, die mit einem inversen Mikroskop mit Fluoreszenz-Optik ausgestattet und wählen Scheiben für weitere Behandlungen. Für eine PI-Färbung in Kombination mit Immunhistochemie, fügen PI-Lösung 30 min vor der Fixierung der Kulturen. </li></ol></li><li> Fixierung der Scheiben. <ol><li> Entfernen Sie das Kulturmedium aus der 6-Well-Platte und 3 ml frisch zubereiteten 4% Paraformaldehyd (PFA) in jede Vertiefung. Dann legen Sie die 6-Well-Platte in einem Kühlschrank und fixieren O / N bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie die PFA-Lösung am nächsten Tag und waschen die Scheiben 3-4 mal mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS). </li></ol></li><li> Entfernen der Scheiben aus dem Zellkultur insert und Blockierverfahren für die Immunhistochemie von frei schwebenden Abschnitte. <ol><li> Vorsichtig lösen und entfernen Sie die Scheiben von den Kulturplatten mit Hilfe eines Kunst Pinsel der Größe 0 oder kleiner. Übertragen jedes einzelne Stück in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte mit Blockierungspuffer (PBS mit 3% normalem Ziegenserum (NGS) und 2% Triton-X100) gefüllt. Halten der Scheiben in Blockierungspuffer für 2 h bei RT unter ständigem Rühren mit einem Orbitalschüttler. </li></ol></li><li> Immunfärbung der Schnittkulturen <ol><li> Für die Markierung der Blutgefäße verwenden polyklonalen Anti-Laminin in einer Verdünnung von 1: 200 in PBS mit 1% NGS und 0,5% Triton-X100. </li><li> Zur Markierung Neuronen verwenden anti-Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2 (MAP2) in einer Verdünnung von 1: 500 in PBS mit 1% NGS und 0,5% Triton-X100. </li><li> Die Scheiben mit primären Antikörpern für 48 Stunden Inkubieren bei 4 ° C unter konstantem Rühren. Nach der Inkubationszeit, waschen Sie sie in PBS mit 0,5% Triton-X100 für 3-4 mal. </li&gt; <li> Verdünnte sekundäre Antikörper 1: 500 in PBS, 1% NGS und 0,5% Triton-X100. Bebrüten die Scheiben für 2 h bei RT im Dunkeln mit den Alexa Fluorophor konjugiert Sekundärantikörper. Verwenden Sie die entsprechende Ziege-Anti-Kaninchen-oder Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper Alexa 350 oder 488 konjugiert. </li><li> Entfernen Sie die Sekundärantikörperlösung und waschen die Scheiben dreimal mit Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS); montieren sie auf Glasobjektträger und Deckglas die Folien mit Mowiol. </li></ol></li><li> Mikroskopie der gefärbten Scheiben </li><li> Informieren Sie sich über die gefärbten Scheiben entweder auf einem Standardmikroskop mit Epifluoreszenz Ausrüstung oder mit einem konfokalen Mikroskop. Nehmen Sie Bilder mit einer geeigneten Kamera. Für einige Bilder, invertieren die Fluoreszenzkontrast, um dunkel gefärbte Gefäße auf einem hellen Hintergrund zu erhalten (5 und 6). </li></ol> 5. Bestimmung der regionalen Gefäßdichte in den Kulturen <ol><li> Quantifizierung der vessel Dichte basierend auf Schiff Gänge wie im Referenz 8 beschrieben. </li><li> Verwenden Scheiben für Laminin für diese Messungen gefärbt. Lagern aufgezeichneten Bilder der 10-facher Vergrößerung mit einem 6 x 6 Raster, wobei jedes Gitter gleich 100 x 100 um pro Quadratmeter, Gesamtfeld von 0,25 mm 2 ist. </li><li> Overlay drei solcher Netze in der CA1-Region, CA3, DG, und EG (Abbildung 2). Zählen Sie die Schiffe überqueren die Linien des Gitters. </li><li> Für den Erhalt einer guten Ergebnisse mit statistischer Relevanz, machen Messungen in mindestens 3 unabhängigen Experimenten, die jeweils Daten von drei Welpen Maus mit 3 Scheiben pro Maus Welpen. </li><li> Bestimmen Sie den Mittelwert des Schiffes Übergänge von den Gittern für jede Region und führen eine statistische Analyse durch ANOVA mit Bonferroni-Korrektur als Post-hoc-Test (p &lt;0,05 definiert als signifikant) mit entsprechenden Statistik-Software. </li></ol>

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	<li>Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+cerebral+ischemia+and+the+quest+for+neuroprotection:+navigating+past+failure+to+future+success.">The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success.</a> J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).</li><li>Bacigaluppi, M., Comi, G., Hermann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ischemic+stroke.+Part+two:+modeling+cerebral+ischemia.">Animal models of ischemic stroke. Part two: modeling cerebral ischemia.</a> Open Neurol J. 4, 34-38 (2010).</li><li>Woodhams, P. L., Atkinson, D. 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Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der EG-Richtlinie vom 24. November 1986 (86/609 / EWG) durchgeführt und wurden von Schweizer Behörden überprüft und zugelassen. Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Mit den hier vorgestellten Methoden kann Hippocampus organotypischen Schnittkulturen als vielseitiges Werkzeug zur plastischen Veränderungen im Nervengewebe nach Verletzungen zu untersuchen. Während organotypischen Kulturen haben in der Vergangenheit für die Untersuchung der neuronalen Reaktionen nach Ischämie 6, 7 der neuen Aspekt der gleichzeitigen Untersuchung von Gefäßveränderungen verwendet wurde erheblich erweitert die Anwendungsmöglichkeiten dieser Methode. Die Induktion der OGD oder Hypoxie al...

Das Zentralnervensystem ist besonders empfindlich gegenüber einem Verlust oder Reduktion von Sauerstoff und Glucose durch die Gefäßversorgung. Selbst eine eher kurze Unterbrechung der Blutversorgung des Gehirns kann einen dauerhaften Verlust der Funktion der jeweiligen Hirngebiete, die zu den typischen Hub-Syndrome zu induzieren. Zusätzlich zu dem Verlust von Nervenzellen in den primären betroffenen Gebieten gibt es typischerweise zusätzliche verzögerten neuronalen Verlust durch Sekundärschäden. Leider bis jetzt keine neuroprotektive Behandlung zur Verringerung von Sekundär neuronalen Tod verfügbar war 1. Forschungsanstrengungen zur Untersuchung der Mechanismen der Sekundärschäden auf der Verwendung von Tiermodellen der zerebralen Ischämie wie mittleren Hirnarterie Okklusion und verschiedenen thrombotischen Verschluss Techniken beruhen (eine aktuelle Übersicht siehe 2). Parallel auch aufgrund von Einschränkungen und ethische Bedenken bei der Verwendung von Tiermodellen, organotypischen Kultur der verschiedenen ZNS-Gewebe verwendet wurden, die die stu ermöglichendy der neuronalen Reaktionen auf verschiedene Art der Verletzungen 3-5. Für die Untersuchung der neuronalen Reaktion unter Bedingungen, die ischämische Gehirnverletzung zu imitieren, ist das Modellsystem von Sauerstoff Glukose Deprivation (OGD) entwickelt. In diesem Modell werden die Schnittkulturen vorübergehend auf einem Medium, das Glucose mangelt und wurde mit Stickstoffgas in der Abwesenheit von Sauerstoff ausgesetzt, äquilibriert worden. Bei einer solchen Behandlung ist es möglich, neuronaler Verletzung und der Verlust der eher ähnlich dem nach ischämischer Verletzung in vivo 6, 7 beobachtet induzieren. Im Hippocampus, induziert eine derartige Behandlung neuronaler Verluste insbesondere in der CA1, aber nicht in der CA3-Bereich oder dem Gyrus dentatus des Hippocampus. Im Gegensatz dazu ist die Untersuchung des vaskulären Reaktionen in Schnittkulturen bisher nicht weit verbreitet durchgeführt. Ein offensichtlicher Grund ist der Mangel an Durchblutung und Gefäßdurchblutung in der Schnittkultur-Modell. Allerdings haben wir früher gezeigt haben, dass es möglich ist, b zu erhaltenlood Gefäße im ZNS Schnittkulturen für mehrere Tage 8, 9. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist, um das Schicksal von Neuronen nach OGD nicht nur überwachen, sondern erstrecken sich die Studie mit dem Schicksal und den Umbau des Gefäßsystems, die ein wichtiger Teil der Schädigung Antwort ist. Bis jetzt solche Studien haben die Verwendung von Tierversuchen erforderlich (. De Jong et al, 1999; Cavaglia et al., 2001). In der hier vorgestellten Protokoll, werden wir detailliert, wie solche Studien können in entorhino-Hippocampus organotypischen Kulturen getan werden herausgefordert, entweder mit Hypoxie oder durch exzitotoxische Läsionen gefolgt von der Analyse der beiden neuronalen Überleben und Blutgefäßreaktionen. Dieses Protokoll basiert auf einer zuvor veröffentlichten Studie zu diesem Thema 10 und kann nützlich für jedes Labor interessiert neurovaskulären Wechselwirkungen im ZNS sein.

<table><tbody><tr><td>Minimum Essential Medium MEM</td><td>Gibco</td><td>11012-044</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>stabilized form of L-glutamine</td></tr><tr><td>Millicell cell culture inserts</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Basal medium Eagle&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>41010-026</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Anaerobic strips</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59886</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>AMPA</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>0169-10</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>0190/10</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>1078/1</td><td></td></tr><tr><td>polyclonal anti-laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>anti-MAP2</td><td>Abcam</td><td>ab11267</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-mouse 350</td><td>Molecular Probes</td><td>A11045</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-mouse 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-rabbit 350</td><td>Molecular Probes</td><td>A11046</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-rabbit 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Statistics software</td><td>GraphPad Software</td><td>GraphPad Prism</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain tissue chopper</td><td>Ted Pella</td><td>10180</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxia chamber</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td></td></tr></tbody></table>

the analysis of neurovascular remodeling in entorhino-hippocampal organotypic slice cultures

Ischämischen Hirnverletzung ist eine der häufigsten und schwersten Bedingungen Kompromisse ordnungsgemäße Funktion des Gehirns und führt zu anhaltenden funktionellen Defiziten in den betroffenen Patienten oft. Trotz intensiver Forschungsanstrengungen, gibt es noch keine wirksame Behandlungsmethode verfügbar, die neuronale Verletzung reduziert und schützt Neuronen in den ischämischen Bereichen von verzögerten Sekundär Tod. Forschung in diesem Bereich umfasst typischerweise die Verwendung von aufwendigen und problematischen Tiermodellen. Entorhino-Hippocampus organotypischen Kulturen mit Sauerstoff und Glukose Deprivation (OGD) in Frage gestellt werden in vitro Modelle, die zerebrale Ischämie imitieren etabliert. Der neuartige Aspekt der vorliegenden Studie ist, dass Veränderungen der Gehirnblutgefäße neben neuronalen Veränderungen und die Reaktion sowohl des neuronalen Raum und dem vaskulären Kompartiment untersucht verglichen und korreliert werden. Die in diesem Protokoll vorgestellten Verfahren die möglichen Anwendungen der wesentlichen verbreitern oderganotypic Schnittkultur-Ansatz. Die Induktion der OGD oder Hypoxie allein durch relativ einfache Mittel in organotypischen Kulturen angewendet werden und führt zu einer zuverlässigen und reproduzierbaren Schäden im Nervengewebe. Dies steht in krassem Gegensatz zu den komplizierten und problematischen Tierversuche Induktion Schlaganfall und Ischämie in vivo. Durch die Erweiterung der Analyse auf die Untersuchung der Reaktion des Gefäßsystems könnten neue Möglichkeiten auf, wie die Erhaltung und Wiederherstellung Hirnfunktionen bereitzustellen. Die Schnittkultur hier vorgestellte Ansatz könnte zu einem attraktiven und wichtigen Werkzeug für die Untersuchung der ischämischen Hirnschädigung entwickeln und könnte nützlich für die Prüfung potenzieller therapeutischer Maßnahmen auf die Neuroprotektion angestrebt werden.

Sauerstoff Glukose Deprivation und Hypoxie induzieren neuronalen Tod und Gefäßreduktion insbesondere im Hippocampus CA1-Region. OGD oder Sauerstoffentzug allein für 15 Minuten führte zu einer starken Induktion von Zelltod durch Propidiumiodid-Färbung spezifisch in der CA1-Region des Hippocampus (Figur 3) gesehen, ähnlich wie zuvor beschrieben 7. Mit den Markierungen von Blutgefässen zu visualisieren, wurde festgestellt, dass der Blutgefäßdichte und Organisation erschi...

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The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ein Protokoll für entorhino-Hippocampus organotypischen Kulturen, die Wiedergabe von vielen Aspekten der ischämischen Hirnschädigung ermöglicht, wird vorgestellt. Durch das Studium der Veränderungen der Leitungsbahnen in Zusätzlich zu den Veränderungen in den Nervenzellen ist dieses Protokoll ein vielseitiges Werkzeug, um plastische Veränderungen im Nervengewebe nach Verletzungen zu studieren.

Die Analyse der neurovaskuläre Remodeling in Entorhino-Hippocampus Organotypischen Kulturen

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.7K Aufrufe.  University of Basel.  Ein Protokoll für entorhino-Hippocampus organotypischen Kulturen, die Wiedergabe von vielen Aspekten der ischämischen Hirnschädigung ermöglicht, wird vorgestellt. Durch das Studium der Veränderungen der Leitungsbahnen in Zusätzlich zu den Veränderungen in den Nervenzellen ist dieses Protokoll ein vielseitiges Werkzeug, um plastische Veränderungen im Nervengewebe nach Verletzungen zu studieren. 

Serie: The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This method maintains the characteristic topographical morphology of the hippocampus while allowing direct application of pharmacological agents to the developing hippocampal dentate gyrus. Additionally, slice cultures can be maintained for up to 4 weeks and thus, allow one to study the maturation process of newborn granule neurons. Slice cultures allow for efficient pharmacological manipulation of hippocampal slices while excluding complex variables such as uncertainties related to the deep anatomic location of the hippocampus as well as the blood brain barrier. For these reasons, we sought to optimize organotypic slice cultures specifically for postnatal neurogenesis research.

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis using the organotypic slice culture technique. This method allows for in vitro manipulation of adult neurogenesis and allows for the direct application of pharmacological agents to the cultured hippocampus.

Organotypischen Kulturen für Studien der postnatale Neurogenese

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

Die Organotypische hippokampalen Slice-Kultur-Modell für die Prüfung neuronaler Schädigung

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Neurowissenschaften

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotypischen hippokampalen Slice-Kulturen

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Ein organotypischen Assay für High-Resolution Time-Lapse Imaging neuronaler Migration in der postnatalen Gehirn

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Organotypischen Kulturen zu Oligodendrozyten Dynamik und Myelinisierung Studieren

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. This model is suitable for addressing different research questions that involve studies on neuroprotection, electrophysiological experiments on neurons, neuronal networks or tumor invasion. The hippocampal architecture and neuronal activity in multisynaptic circuits are well conserved in OHSC, even though the slicing procedure itself initially lesions and leads to formation of a glial scar. The scar formation alters presumably the mechanical properties and diffusive behavior of small molecules, etc. Slices allow the monitoring of time dependent processes after brain injury without animal surgery, and studies on interactions between various brain-derived cell types, namely astrocytes, microglia and neurons under both physiological and pathological conditions. An ambivalent aspect of this model is the absence of blood flow and immune blood cells. During the progression of the neuronal injury, migrating immune cells from the blood play an important role. As those cells are missing in slices, the intrinsic processes in the culture may be observed without external interference. Moreover, in OHSC the composition of the medium-external environment is precisely controlled. A further advantage of this method is the lower number of sacrificed animals compared to standard preparations. Several OHSC can be obtained from one animal making simultaneous studies with multiple treatments in one animal possible. For these reasons, OHSC are well suited to analyze the effects of new protective therapeutics after tissue damage or during tumor invasion. 
The protocol presented here describes a preparation method of OHSC that allows generating highly reproducible, well preserved slices that can be used for a variety of experimental research, like neuroprotection or tumor invasion studies.

Organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) represent an in vitro model that simulates the in vivo situation very well. Here we describe a vibratome-based improved slicing protocol to obtain high quality slices for use in assessing the neuroprotective potential of novel substances or the biological behavior of tumor cells.

Organotypischen Hippocampal Slice Kulturen als Modell zur Studie Neuroprotektion und Invasivität der Tumorzellen

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of slice cultures in neuroscience, studies using adult nervous tissue to prepare such cultures are still scarce, particularly those from human subjects. The use of adult human tissue to prepare slice cultures is particularly attractive to enhance the understanding of human neuropathologies, as they hold unique properties typical of the mature human brain lacking in slices produced from rodent (usually neonatal) nervous tissue. This protocol describes how to use brain tissue collected from living human donors submitted to resective brain surgery to prepare short-term, free-floating slice cultures. Procedures to maintain and perform biochemical and cell biology assays using these cultures are also presented. Representative results demonstrate that the typical human cortical lamination is preserved in slices after 4 days in vitro (DIV4), with expected presence of the main neural cell types. Moreover, slices at DIV4 undergo robust cell death when challenged with a toxic stimulus (H2O2), indicating the potential of this model to serve as a platform in cell death assays. This method, a simpler and cost-effective alternative to the widely used protocol using membrane inserts, is mainly recommended for running short-term assays aimed to unravel mechanisms of neurodegeneration behind age-associated brain diseases. Finally, although the protocol is devoted to using cortical tissue collected from patients submitted to surgical treatment of pharmacoresistant temporal lobe epilepsy, it is argued that tissue collected from other brain regions/conditions should also be considered as sources to produce similar free-floating slice cultures.

A protocol to prepare free-floating slice cultures from adult human brain is presented. The protocol is a variation of the widely used slice culture method using membrane inserts. It is simple, cost-effective, and recommended for running short-term assays aimed to unravel mechanisms of neurodegeneration behind age-associated brain diseases.

Kurzfristig frei schwebende Scheibenkulturen aus dem erwachsenen menschlichen Gehirn

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

A Model of Epileptogenesis in Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slice Cultures

Organotypic slice cultures have been widely used to model brain disorders and are considered excellent platforms for evaluating a drug&#8217;s neuroprotective and therapeutic potential. Organotypic slices are prepared from explanted tissue and represent a complex multicellular ex vivo environment. They preserve the three-dimensional cytoarchitecture and local environment of brain cells, maintain the neuronal connectivity and the neuron-glia reciprocal interaction. Hippocampal organotypic slices are considered suitable to explore the basic mechanisms of epileptogenesis, but clinical research and animal models of epilepsy have suggested that the rhinal cortex, composed of perirhinal and entorhinal cortices, play a relevant role in seizure generation.
Here, we describe the preparation of rhinal cortex-hippocampus organotypic slices. Recordings of spontaneous activity from the CA3 area under perfusion with complete growth medium, at physiological temperature and in the absence of pharmacological manipulations, showed that these slices depict evolving epileptic-like events throughout time in culture. Increased cell death, through propidium iodide uptake assay, and gliosis, assessed with fluorescence-coupled immunohistochemistry, was also observed. The experimental approach presented highlights the value of rhinal cortex-hippocampus organotypic slice cultures as a platform to study the dynamics and progression of epileptogenesis and to screen potential therapeutic targets for this brain pathology.

Here, we describe the preparation of rhinal cortex-hippocampus organotypic slices. Under a gradual and controlled deprivation of serum, these slices depict evolving epileptic-like events and can be considered an ex vivo model of epileptogenesis. This system represents an excellent tool for monitoring the dynamics of spontaneous activity, as well as for assessing the progression of neuroinflammatory features throughout the course of epileptogenesis.

Ein Modell der Epileptogenese in rhinalen Kortex-Hippocampus Organotypischen Schnittkulturen

Organotypic slice cultures have been widely used to model brain disorders and are considered excellent platforms for evaluating a drug&#8217;s ...

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell resolution using electrophysiology, microscopy, and pharmacology. However, a major consideration in the design of in vitro experiments is the extent to which different slice preparations recapitulate naturalistic patterns of neural activity as observed in vivo. In the intact brain, the hippocampal network generates highly synchronized population activity reflective of the behavioral state of the animal, as exemplified by the sharp-wave ripple complexes (SWRs) that occur during waking consummatory states or non-REM sleep. SWRs and other forms of network activity can emerge spontaneously in isolated hippocampal slices under appropriate conditions. In order to apply the powerful brain slice toolkit to the investigation of hippocampal network activity, it is necessary to utilize an approach that optimizes tissue health and the preservation of functional connectivity within the hippocampal network. Mice are transcardially perfused with cold sucrose-based artificial cerebrospinal fluid. Horizontal slices containing the hippocampus are cut at a thickness of 450 &#956;m to preserve synaptic connectivity. Slices recover in an interface-style chamber and are transferred to a submerged chamber for recordings. The recording chamber is designed for dual surface superfusion of artificial cerebrospinal fluid at a high flow rate to improve oxygenation of the slice. This protocol yields healthy tissue suitable for the investigation of complex and spontaneous network activity in vitro.

This protocol describes the preparation of horizontal hippocampal-entorhinal cortex (HEC) slices from mice exhibiting spontaneous sharp-wave ripple activity. Slices are incubated in a simplified interface holding chamber and recordings are performed under submerged conditions with fast-flowing artificial cerebrospinal fluid to promote tissue oxygenation and the spontaneous emergence of network-level activity.

Akute Maus Gehirn Schneiden, um spontane Hippocampal-Netzwerk-Aktivität zu untersuchen

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

Horizontale Hippocampal Scheiben der Maus Gehirn

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...