Name: the analysis of neurovascular remodeling in entorhino-hippocampal organotypic slice cultures
Uploaded: 2014-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
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이 작품은 바젤 대학의 생물 의학 교실 및 스위스 국립 과학 재단 (31003A_141007)에 의해 지원되었다. 마르쿠스 Saxer 기술 지원을 제공했다.

동물 실험을 2010 년 9 월 (22)의 유럽 공동체위원회 지침에 따라 수행 하였다 (63분의 2,010 / EU)과 검토하고 스위스 당국에 의해 허용되었다. 1의 Organotypic Entorhino - 해마 슬라이스 문화를 설정 <ol><li> 정적 배양 방법 4,11를 사용하여 출생 후의 일 4 (P4) 마우스 새끼에서 entorhino - 해마의 Organotypic 슬라이스 문화 (EHOSCs)를 준비합니다. 여기 C57BL6 및 CB6F1 마우스를 사용합니다. <ol><li> 즉 슬라이스 문화의 준비를 위해 마우스 강아지 당 약 30 분, 6 마우스 새끼의 쓰레기에 대한 세 시간을 가져 가라. 멸균 된 수술 도구와 층류 벤치에서 무균 조건 하에서 모든 단계를 수행합니다. </li><li> septo-시간축을 따라 슬라이스의 위치에서 가능한 간섭을 피하기 위해, 단지 해마 중격 절반의 조각을 사용한다. 달리 명시하지 않으면, RT에서 모든 단계를 수행한다. </li></ol></li><li> t 잘라그는 수술 가위로 P4 마우스 강아지의 머리입니다. 마취는이 단계가 필요하지 않습니다. <ol><li> 뇌 주변의 두개골을 제거하고 대뇌 반구와 중뇌의 꼬리 끝 사이의 균열을 식별합니다. 조심스럽게 두개골에서 중뇌에 뇌 주동이의 부분을 제거하고 L-글루타민의 안정화 된 형태로 보충 MEM 구성된 얼음처럼 차가운 준비 매체에 넣습니다. </li></ol></li><li> 뇌가 냉담한 준비 매체에 침지와 실체 현미경 해부를 계속합니다. 대뇌 피질 반구에서 남은 수막을 제거합니다. 반구의 내측 꼬리 표면에서 해마를 확인하고 뇌의 나머지 부분에서 인접한 entorhinal 피질과 함께 그것을 구분합니다. <ol><li> 조직 헬기에 조직을 전송하고 해마의 septo - 시간 축에 무균 조건 횡단에서 400 μm의 두께 조각을 잘라. </li></ol></li><li> CE의 조각을 배치LL 문화 삽입 (약 6 삽입 당 조각) 배양 배지 (47 ㎖의 MEM, 25 ㎖의 이글 중간을 잘 당 1 ㎖, 25 ㎖의 말 혈청, 1 ㎖ glutamax I, 1 mL를 6 웰 플레이트에서 그들을 품어 37 ° C에서 5 % CO 2 가습 분위기에서 살균 10 % 포도당 용액의 pH 7.3). 매체 다음날과 일주에 다음 다른 모든 일을 위로 변경합니다. </li></ol> 재관류와 체외 저산소증에서 2 및 산소 - 포도당 박탈 <ol><li> 절차의 정확한 시간 일정은 표 1을 참조하십시오. 저산소증 또는 OGD에 노출하기 전에 오일 (DIV5)에 대한 문화 EHOSCs. 이 시점에서 다음과 같은 조성으로 배지를 혈청 25 % 말 혈청을 함유하는 배양 배지에서 매체를 전환 : Neurobasal 배지를 2 % B27 보충제, 1 % glutamax 추가 0.1 % 글루코스와. </li><li> 참조 7 구성 요소의 국지적 인 최종 농도에서 설명하는대로 다음이 될 것 OGD 매체를 준비합니다 : 0.3MM의 염화칼슘이, 70 mM의 염화나트륨, 5.25 mM의 탄산 수소 나트륨, 70 밀리미터의 KCl, pH가 6.8에서 1.25 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 2 mM의 황산, 10 mM의 크로스. 두 개의 6 - 웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 OGD 배지 1 ㎖를 추가한다. <ol><li> 저산소 챔버에서 1 시간 동안 N 2 OGD 매체를 관류 한 다음 밀봉 O를 유지 / 37 ° C에서 인큐베이터에서 N. </li><li> 저산소 지표로 혐기성 스트립을 사용합니다. 스트립의 색이 흰색에 분홍색에서 변경 될 때 산소가 없음을 매체를 고려한다. </li><li> 저산소증의 유도를 들어, 대신 OGD 매체의 혈당과 혈청 배지를 사용합니다. 사용 전에 OGD 매체에 대해 위에서 설명한 바와 같이 저산소증 챔버에서 N 2와 함께 매체를 관류. </li></ol></li><li> 슬라이스는 OGD에 노출되기 전에, 30 분 동안 N 2로 다시 OGD 매체를 관류. 1 ㎎ / ㎖ 프로피 디움 아이오다 이드 (PI)가 30 분 동안 조각에 (2 μg / ML의 최종 농도에 대해) 잘 당 솔루션은 선택의 2 μl를 추가실험 만 건강한 슬라이스 PI 양성 세포의 낮은 숫자로 나타낸 바와 같이. </li><li> . OGD 노출과 재관류 그림 1에 표시된의 일정을 사용하여 15 분 동안 하나의 산소 만 (저산소증) 또는 산소와 포도당 (OGD)의 조각을 박탈. <ol><li> 저산소증 또는 OGD의 유도를 들어, OGD 매체에 조각을 전송하고 저산소 챔버에서 15 분 동안 유지한다. 문화가 OGD 매체 다시 정기적 매체로 전환 할 때 삽입의 측면에 남아있는 모든 유체 거리에 흡입되어 있는지 확인합니다. </li><li> 저산소증 또는 OGD 후, 산소 혈청 배지와 OGD 매체를 대체하고 문화는 5 % CO 2와 37 ° C에서 일반 배양기에서 무 혈청 배지에서 3, 24 또는 48 시간 동안 복구 할 수 있습니다. 세포 죽음의 결정에 대한 고정 다시 이전 PI를 추가합니다. </li></ol></li></ol> Entorhino - 해마 Organotypic 슬라이스 문화의 3 약리 치료 <ol><li> 이 배양약물 치료에 노출하기 전에 배양 배지에서 오일 (DIV5)에 대한 전자 EHOSCs. 약물 치료 OGD 동안 즉시 조각 혈청 배지로 전송하는 경우 OGD 후를 시작합니다. </li><li> OGD에서 보호를위한 트리트먼트. <ol><li> 30 분 동안 OGD 유도 직후에 100 μM 6 - 시아 노 -7 - 퀴녹 살린 2,3 - 디온 (CNQX) 또는 (15 분 동안) OGD의 유도시 배지 1 μM 테트로도톡신 (TTX) 또는 추가. 그런 다음, 고정하기 전에 48 시간 동안 정상 산소 혈청 배지에서 배양한다. </li></ol></li><li> 흥분 독성 죽음의 유도 치료. <ol><li> 배양 배지 스위치 배양 5 일 후에 30 분 동안 100 μM (RS) -α 아미노 -3 - 하이드 록시 -5 - 메틸-4-isoxazolepropionic 산 (AMPA)를 함유하는 배지를 혈청한다. </li><li> 흡인 (삽입에 남아있는 매체를 제거하는데주의를 기울여야)에 의해 AMPA를 포함하는 배양 배지를 제거한 다음 정상 혈청 배지와 신선한 판에 조각을 전송고정 될 때까지 48 시간 동안 보관하십시오. </li></ol></li></ol> (4)의 고정 및 면역 염색 Entorhino - 해마 Organotypic 슬라이스 문화 <ol><li> 요오드화 프로피 듐 (PI) 염색. <ol><li> 2 μg / ml의 농도에서 살고있는 조각의 문화 매체에 30 분 동안 PI를 추가합니다. 형광 광학 장착 거꾸로 현미경으로 살아있는 문화를보기 및 추가 치료에 대한 슬라이스를 선택합니다. 면역 조직 화학 염색과 함께 PI 염색의 경우, 이전에 문화의 정착에 PI 솔루션 30 분을 추가합니다. </li></ol></li><li> 조각의 고정. <ol><li> 6 - 웰 플레이트로부터 배지를 제거하고 각 웰에 새로 제조 한 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 3 ㎖를 추가한다. 그런 다음 냉장고에 6 웰 플레이트를 배치하고 4 ° C에서 O / N을 고정한다. </li><li> PFA 솔루션에게 다음과 같은 일을 제거하고 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)으로 조각 3 ~ 4 회 반복한다. </li></ol></li><li> 세포 배양에서 I 슬라이스 제거nsert 무료 부동 섹션의 면역 조직 화학 염색에 대한 차단 절차. <ol><li> 조심스럽게 분리하고 크기가 0 이하의 아트 페인트 브러시를 사용하여 문화 삽입에서 슬라이스를 제거합니다. (3 % 정상 염소 혈청 (NGS)와 2 % 트리톤 - X100과 PBS)를 버퍼를 차단 가득 96 웰 플레이트의 우물에 각각의 조각을 전송합니다. 오비탈 쉐이커로 일정한 교반 하에서 RT에서 2 시간 동안 블로킹 버퍼 슬라이스를 보관. </li></ol></li><li> 슬라이스 문화의 면역 염색 <ol><li> 표지 용 혈관은 1 희석 폴리 클로 날 항 - 라미닌을 사용 (200)을 PBS는 NGS 1 % 및 0.5 % 트리톤-X100을 포함한다. </li><li> PBS가 1 % NGS 0.5 % 트리톤 - X100을 포함에 500 : 라벨 뉴런은 하나의 희석 단백질 2 (MAP2) 관련 안티 미세 소관 (microtubule)을 사용하십시오. </li><li> 일정한 교반과 함께 4 ° C에서 48 시간 동안 차 항체 조각을 품어. 잠복기 후, 3 ~ 4 회 0.5 % 트리톤 - X100과 PBS로 닦아냅니다. </li&gt; <li> 1 차 항체를 희석 : 500 PBS가 1 % NGS 및 0.5 % 트리톤-X100을 포함한다. 알렉사 형광 물질 이차 항체와 함께 어둠 속에서 실온에서 2 시간 동안 조각을 품어. 알렉사 350 또는 488에 접합 적절한 염소 항 - 토끼 나 염소 항 - 마우스 차 항체를 사용합니다. </li><li> 차 항체 용액을 제거하고 트리스 완충 용액 (TBS)로 조각을 세 번 씻어; 유리 슬라이드에 그들을 마운트 Mowiol와 슬라이드를 커버 슬립. </li></ol></li><li> 스테인드 조각의 현미경 </li><li> 표면 형광 장비와 표준 현미경이나 공 초점 현미경으로 하나 스테인드 조각을 볼 수 있습니다. 적절한 카메라로 이미지를 가져 가라. 일부 이미지를 들어, 밝은 배경에 은밀히 스테인드 혈관을 수득하기 위해서, 형광 콘트라스트 (도 5 및 6)을 반전. </li></ol> 문화의 국가 별 선박 밀도 (5) 결정 <ol><li> vesse 정량화참조 8에 설명 된대로 선박 횡단에 따라 리터 밀도. </li><li> 이러한 측정을위한 라미닌 스테인드 조각을 사용합니다. 각 그리드 평방 당 100 × 100 μm의, 0.25 mm 2의 총 필드에 해당하는 6 × 6 그리드와 10 배 배율의 녹화 영상을 첨부합니다. </li><li> CA1, CA3, DG, 및 EC 지역에서 오버레이 세 등의 그리드 (그림 2). 그리드의 줄을 건너 용기를 계산합니다. </li><li> 통계적 관련성 좋은 결과를 얻기 위해, 마우스 새끼 당 3 개 조각 3 새끼 마우스에서, 적어도 3 개의 독립적 인 실험에 각각 포함하는 데이터를 측정 할. </li><li> 각 지역의 그리드에서 선박 횡단의 평균 값을 결정하고 적절한 통계 소프트웨어를 사용하여 (같은 중요한 정의 P &lt;0.05) 사후 시험과 페로 니 보정과 ANOVA로 통계 분석을 수행합니다. </li></ol>

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	<li>Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+cerebral+ischemia+and+the+quest+for+neuroprotection:+navigating+past+failure+to+future+success.">The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success.</a> J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).</li><li>Bacigaluppi, M., Comi, G., Hermann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ischemic+stroke.+Part+two:+modeling+cerebral+ischemia.">Animal models of ischemic stroke. Part two: modeling cerebral ischemia.</a> Open Neurol J. 4, 34-38 (2010).</li><li>Woodhams, P. L., Atkinson, D. 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동물 실험은 1986년 11월 24일 (609분의 86 / EEC)의 유럽 공동체위원회 지침에 따라 수행하고, 스위스 당국에 의해 검토하고 허용 하였다. 저자가 공개하는 게 없다.

여기에 제시된 방법으로, 해마의 Organotypic 슬라이스 문화는 손상 후 신경 조직 플라스틱 변화를 연구하기 위해 다양한 도구로 사용할 수 있습니다. Organotypic 슬라이스 배양 혈관 변화의 동시 연구의 새로운 형태 7, 6 허혈 후 신경 반응을 연구를 위해 이전에 사용 되었으나 크게이 방법의 응용 가능성을 향상시킨다. OGD 또는 단독 저산소증 유도의 Organotypic 슬라이스 문화 오히려 간단한 방법...

중추 신경계는 혈관에 의한 손실이나 산소와 포도당 공급의 감소에 특히 민감하다. 뇌에 혈액을 공급하더라도 다소 짧은 중단 일반적인 스트로크 증후군 선도 중요한 뇌 영역의 기능에 영구적 손실을 유도 할 수있다. 주 영향 영역에서 신경 세포 손실에 더하여, 일반적으로 이차 손상으로 인한 추가적인 지연 성 뉴런의 손실이있다. 불행하게도 지금까지 차 신경 죽음의 감소에 대한 신경 치료는 1 사용할 수 없습니다. 이차 손상의 기전 연구를위한 연구 노력은 중간 대뇌 동맥 폐쇄 다양한 혈전 폐색 기법 등 뇌허혈 동물 모델의 사용에 의존한다 (검토를 위해 최근 2 참조). 병렬로 인해 제한 및 동물 모델, 다양한 CNS 조직의 Organotypic 슬라이스 문화의 사용과 윤리적 인 문제로 스튜를 허용하는 사용되었다상해 3-5의 다양한 유형에 대한 신경 반응의 마구. 허혈성 뇌 손상을 모방하는 조건 하에서 반응 신경 연구를위한 산소 포도당 박탈 모델 시스템 (OGD)가 개발되었다. 이 모델에서, 슬라이스 문화 일시적 글루코스 부족과 산소의 부재하에 질소 가스로 평형화 한 매체에 노출된다. 이러한 처리로, 생체 6,7 허혈성 손상 후 관찰 된 것과 다소 유사하다 신경 손상 및 손실을 유도 할 수있다. 해마에서, 이러한 치료에 특히 CA1에서 신경 세포 손실을 유발하지만 CA3 영역 또는 해마의 치아 이랑 (dentate gyrus). 반대로, 슬라이스 배양 혈관 반응 연구는 지금까지 광범위하게 수행되지 않았다. 명백한 이유는 슬라이스 배양 모델에서 순환과 혈관 관류의 부족이다. 그러나, 우리는 B를 유지하는 것이 가능하다는 것을 미리 보여 주었다CNS에서들 (100d) 선박은 9, 몇 일 8 문화를 슬라이스. 이 방법의 전반적인 목표는 OGD 후 신경 세포의 운명을 모니터링하지만 부상 응답의 중요한 부분입니다 혈관의 운명과 리모델링에 대한 연구를 확장 할뿐만 아니라. 지금까지 이러한 연구는 동물 실험의 사용 필수있다 (. 데 용 등, 1999; Cavaglia 등, 2001.). 프로토콜이 여기에 제시, 우리는 이러한 연구는 저산소증으로 또는 둘 다 신경 세포의 생존과 혈관 반응의 분석을 다음에 흥분 독성 병변 중 하나에 도전 entorhino - 해마의 Organotypic 슬라이스 문화에 상세하게 할 수있는 방법. 이 프로토콜은이 주제 10에 이전에 출판 된 연구를 바탕으로하며, 중추 신경계의 신경 혈관의 상호 작용에 관심이있는 실험실 유용 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Minimum Essential Medium MEM</td><td>Gibco</td><td>11012-044</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>stabilized form of L-glutamine</td></tr><tr><td>Millicell cell culture inserts</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Basal medium Eagle&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>41010-026</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Anaerobic strips</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59886</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>AMPA</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>0169-10</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>0190/10</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>1078/1</td><td></td></tr><tr><td>polyclonal anti-laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>anti-MAP2</td><td>Abcam</td><td>ab11267</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-mouse 350</td><td>Molecular Probes</td><td>A11045</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-mouse 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-rabbit 350</td><td>Molecular Probes</td><td>A11046</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-rabbit 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Statistics software</td><td>GraphPad Software</td><td>GraphPad Prism</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain tissue chopper</td><td>Ted Pella</td><td>10180</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxia chamber</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td></td></tr></tbody></table>

the analysis of neurovascular remodeling in entorhino-hippocampal organotypic slice cultures

허혈성 뇌 손상은 적절한 뇌 기능을 저하 가장 일반적이고 치명적인 상태 사이이며 종종 영향 환자에서 기능적 결손을 지속 리드. 집중적 인 연구 노력에도 불구하고, 여전히 신경 세포의 손상을 줄이고 지연 보조 죽음 허혈 영역의 신경 세포를 보호 가능한 효과적인 치료 옵션이 없습니다. 이 분야의 연구는 일반적으로 문제가 정교하고 동물 모델의 사용을 포함한다. 산소와 포도당 결핍 (OGD)에 도전 Entorhino - 해마의 Organotypic 슬라이스 문화는 뇌허혈을 모방 생체 모델에서 설정됩니다. 본 연구의 목적은 신규 한 뇌 혈관의 변화가 비교 상관 될 수있는 변경 및 신경 신경 혈관 구획과 구획 모두 반응 이외에 다룬다는 것이다. 이 프로토콜에서 제시된 방법은 실질적으로의 잠재적 인 응용 범위를 확장하거나ganotypic 슬라이스 문화 접근 방식. OGD 또는 단독 저산소증 유도의 Organotypic 슬라이스 문화 오히려 간단한 방법에 의해 적용하고 신경 조직의 신뢰성과 재현성 손상에 이르게 할 수 있습니다. 이 생체 내에서 뇌졸중 및 허혈을 유도 복잡하고 문제가 동물 실험 완전히 대조적이다. 분석을 확대하여 보존하고 뇌 기능을 복원하는 방법에 대한 새로운 방법을 제공 할 수있는 혈관의 반응에 대한 연구를 포함합니다. 여기에 제시된 슬라이스 문화 접근 방식은 허혈성 뇌 손상의 연구를위한 매력적이고 중요한 도구로 발전 할 수 있으며 신경 보호하기위한 잠재적 인 치료 대책을 테스트하는 데 유용 할 수 있습니다.

산소 및 글루코스 부족 저산소증은 해마 CA1 영역의 신경 세포 특이 죽음과 혈관의 감소를 유도한다. 이전에 설명한 바와 같이 유사한 7 해마 (도 3)의 CA1 영역에서 특히 요오드화 프로피 듐 염색하여 본 OGD 또는 산소 결핍 혼자 15 분 동안 세포 사멸의 강한 유도 유도. 마커는 혈관 네트워크를 시각화, 그것은 혈관 밀도 및 조직 CA1 영역을 제외한 대부분의 지역 문화?...

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The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

허혈성 뇌 손상의 여러 측면을 재생할 수 있습니다 entorhino - 해마의 Organotypic 슬라이스 문화에 대한 프로토콜은 제공됩니다. 신경 세포의 변화에​​ 더하여 neurovasculature의 변화를 연구함으로써,이 프로토콜은 손상 후 신경 조직 플라스틱 변화를 연구하는 다양한 도구입니다.

에서 신경 혈관 리모델링의 분석 Entorhino - 해마 Organotypic 슬라이스 문화

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

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9.7K 조회수.  University of Basel.  허혈성 뇌 손상의 여러 측면을 재생할 수 있습니다 entorhino - 해마의 Organotypic 슬라이스 문화에 대한 프로토콜은 제공됩니다. 신경 세포의 변화에​​ 더하여 neurovasculature의 변화를 연구함으로써,이 프로토콜은 손상 후 신경 조직 플라스틱 변화를 연구하는 다양한 도구입니다. 

비디오: The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This method maintains the characteristic topographical morphology of the hippocampus while allowing direct application of pharmacological agents to the developing hippocampal dentate gyrus. Additionally, slice cultures can be maintained for up to 4 weeks and thus, allow one to study the maturation process of newborn granule neurons. Slice cultures allow for efficient pharmacological manipulation of hippocampal slices while excluding complex variables such as uncertainties related to the deep anatomic location of the hippocampus as well as the blood brain barrier. For these reasons, we sought to optimize organotypic slice cultures specifically for postnatal neurogenesis research.

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis using the organotypic slice culture technique. This method allows for in vitro manipulation of adult neurogenesis and allows for the direct application of pharmacological agents to the cultured hippocampus.

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Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

연구

발생학

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

의 연결을 부상을 검사에 대한 Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화 모델

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

신경과학

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

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Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

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NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. This model is suitable for addressing different research questions that involve studies on neuroprotection, electrophysiological experiments on neurons, neuronal networks or tumor invasion. The hippocampal architecture and neuronal activity in multisynaptic circuits are well conserved in OHSC, even though the slicing procedure itself initially lesions and leads to formation of a glial scar. The scar formation alters presumably the mechanical properties and diffusive behavior of small molecules, etc. Slices allow the monitoring of time dependent processes after brain injury without animal surgery, and studies on interactions between various brain-derived cell types, namely astrocytes, microglia and neurons under both physiological and pathological conditions. An ambivalent aspect of this model is the absence of blood flow and immune blood cells. During the progression of the neuronal injury, migrating immune cells from the blood play an important role. As those cells are missing in slices, the intrinsic processes in the culture may be observed without external interference. Moreover, in OHSC the composition of the medium-external environment is precisely controlled. A further advantage of this method is the lower number of sacrificed animals compared to standard preparations. Several OHSC can be obtained from one animal making simultaneous studies with multiple treatments in one animal possible. For these reasons, OHSC are well suited to analyze the effects of new protective therapeutics after tissue damage or during tumor invasion. 
The protocol presented here describes a preparation method of OHSC that allows generating highly reproducible, well preserved slices that can be used for a variety of experimental research, like neuroprotection or tumor invasion studies.

Organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) represent an in vitro model that simulates the in vivo situation very well. Here we describe a vibratome-based improved slicing protocol to obtain high quality slices for use in assessing the neuroprotective potential of novel substances or the biological behavior of tumor cells.

Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화 연구 Neuroprotection 및 종양 세포의 침입을 모델로

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of slice cultures in neuroscience, studies using adult nervous tissue to prepare such cultures are still scarce, particularly those from human subjects. The use of adult human tissue to prepare slice cultures is particularly attractive to enhance the understanding of human neuropathologies, as they hold unique properties typical of the mature human brain lacking in slices produced from rodent (usually neonatal) nervous tissue. This protocol describes how to use brain tissue collected from living human donors submitted to resective brain surgery to prepare short-term, free-floating slice cultures. Procedures to maintain and perform biochemical and cell biology assays using these cultures are also presented. Representative results demonstrate that the typical human cortical lamination is preserved in slices after 4 days in vitro (DIV4), with expected presence of the main neural cell types. Moreover, slices at DIV4 undergo robust cell death when challenged with a toxic stimulus (H2O2), indicating the potential of this model to serve as a platform in cell death assays. This method, a simpler and cost-effective alternative to the widely used protocol using membrane inserts, is mainly recommended for running short-term assays aimed to unravel mechanisms of neurodegeneration behind age-associated brain diseases. Finally, although the protocol is devoted to using cortical tissue collected from patients submitted to surgical treatment of pharmacoresistant temporal lobe epilepsy, it is argued that tissue collected from other brain regions/conditions should also be considered as sources to produce similar free-floating slice cultures.

A protocol to prepare free-floating slice cultures from adult human brain is presented. The protocol is a variation of the widely used slice culture method using membrane inserts. It is simple, cost-effective, and recommended for running short-term assays aimed to unravel mechanisms of neurodegeneration behind age-associated brain diseases.

성인 인간의 뇌에서 단기 자유 부동 슬라이스 문화

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

A Model of Epileptogenesis in Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slice Cultures

Organotypic slice cultures have been widely used to model brain disorders and are considered excellent platforms for evaluating a drug&#8217;s neuroprotective and therapeutic potential. Organotypic slices are prepared from explanted tissue and represent a complex multicellular ex vivo environment. They preserve the three-dimensional cytoarchitecture and local environment of brain cells, maintain the neuronal connectivity and the neuron-glia reciprocal interaction. Hippocampal organotypic slices are considered suitable to explore the basic mechanisms of epileptogenesis, but clinical research and animal models of epilepsy have suggested that the rhinal cortex, composed of perirhinal and entorhinal cortices, play a relevant role in seizure generation.
Here, we describe the preparation of rhinal cortex-hippocampus organotypic slices. Recordings of spontaneous activity from the CA3 area under perfusion with complete growth medium, at physiological temperature and in the absence of pharmacological manipulations, showed that these slices depict evolving epileptic-like events throughout time in culture. Increased cell death, through propidium iodide uptake assay, and gliosis, assessed with fluorescence-coupled immunohistochemistry, was also observed. The experimental approach presented highlights the value of rhinal cortex-hippocampus organotypic slice cultures as a platform to study the dynamics and progression of epileptogenesis and to screen potential therapeutic targets for this brain pathology.

Here, we describe the preparation of rhinal cortex-hippocampus organotypic slices. Under a gradual and controlled deprivation of serum, these slices depict evolving epileptic-like events and can be considered an ex vivo model of epileptogenesis. This system represents an excellent tool for monitoring the dynamics of spontaneous activity, as well as for assessing the progression of neuroinflammatory features throughout the course of epileptogenesis.

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Organotypic slice cultures have been widely used to model brain disorders and are considered excellent platforms for evaluating a drug&#8217;s ...

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell resolution using electrophysiology, microscopy, and pharmacology. However, a major consideration in the design of in vitro experiments is the extent to which different slice preparations recapitulate naturalistic patterns of neural activity as observed in vivo. In the intact brain, the hippocampal network generates highly synchronized population activity reflective of the behavioral state of the animal, as exemplified by the sharp-wave ripple complexes (SWRs) that occur during waking consummatory states or non-REM sleep. SWRs and other forms of network activity can emerge spontaneously in isolated hippocampal slices under appropriate conditions. In order to apply the powerful brain slice toolkit to the investigation of hippocampal network activity, it is necessary to utilize an approach that optimizes tissue health and the preservation of functional connectivity within the hippocampal network. Mice are transcardially perfused with cold sucrose-based artificial cerebrospinal fluid. Horizontal slices containing the hippocampus are cut at a thickness of 450 &#956;m to preserve synaptic connectivity. Slices recover in an interface-style chamber and are transferred to a submerged chamber for recordings. The recording chamber is designed for dual surface superfusion of artificial cerebrospinal fluid at a high flow rate to improve oxygenation of the slice. This protocol yields healthy tissue suitable for the investigation of complex and spontaneous network activity in vitro.

This protocol describes the preparation of horizontal hippocampal-entorhinal cortex (HEC) slices from mice exhibiting spontaneous sharp-wave ripple activity. Slices are incubated in a simplified interface holding chamber and recordings are performed under submerged conditions with fast-flowing artificial cerebrospinal fluid to promote tissue oxygenation and the spontaneous emergence of network-level activity.

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Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

마우스 뇌의 수평 해마 조각

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...