Diese Arbeit wurde von Agence Nationale de la Recherche (Jeunes Chercheuses / Jeunes Chercheurs zu EFN), Fondation Voir et Entendre und Fondation Bettencourt Schueller (Young Investigator Zuwendungen EFN), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, Festanstellung für EFN) unterstützt und das National Eye Institute der National Institutes of Health (R01-EY13295 zu SCF). Darüber hinaus ist das Institut de la Vision by Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Université Pierre et Marie Curie-Paris 6, Centre National de la Recherche Scientifique und Kauf de Paris finanziert.

Das POS-Isolationsexperiment ist zeitaufwendig und kann bis zu 12 Stunden benötigen, um abzuschließen, wenn POS sind vor der Lagerung gekennzeichnet. Das Protokoll wurde von einem Papier von RS Molday und Kollegen im Jahr 1987 31 1997 10 veröffentlicht und von SC Finnemann und Kollegen geändert angepasst. Die Tiere wurden nach der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Erklärung für die Nutzung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research behandelt. Protokolle wurden überprüft und von der Charles Darwin Ethikkommission der Universität Pierre und Marie Curie-Paris 06 und der Fordham University Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. 1. Allgemeine Set Up <ol><li> Erhalten 80 frische Schwein oder Kuh Augen so frisch wie bald nach der Schlachtung wie möglich und halten sie gekühlt im Dunkeln. Geben Sie Anweisungen an den Provider, damit das Unternehmen geht auf die gleiche Weise. Dieses Protokoll wird für 80 Augen optimiert. Bisgehen Sie mit den Augen und größer werden Aktien (zB aus 160 Augen), das Doppelte der Lösungsmengen und führen 2 Runden Ultrazentrifugation; Poolproben später an der Sammelschritt (siehe Schritt 2.2.2). </li><li> Auf die Bank gesetzt die rote Dunkelkammerleuchte, absorbierende Kissen, Tücher (Material Tabelle). Bereiten Sie 15 cm Geschirr und Biohazard-Beutel für die Abfallsammlung (unbenutzt Augenteile, Glaskörper, ...). Tragen Sie eng anliegende Laborkittel, Handschuhe, Ärmelschoner und Schutzbrillen. </li><li> Vorsichtsmaßnahmen: <ol><li> Pre-Chill alle Lösungen dann kalt halten sie in allen Phasen. Halten Sie die Augen und Farbverläufe auf Eis so viel wie möglich gekühlt. </li><li> Halten Sie die Augen und abgeleitete Gewebe in der Dunkelheit so viel wie möglich, bis der Sammelschritt nach der Ultrazentrifugation zu vermeiden Bleichen der visuellen Pigmente und Verlust der Orange-rosa Farbe der aktiven Form der Photopigmente. </li></ol></li></ol> 2. Protokoll Aktionen <ol><li> Werden die Lösungen und Steigungen: <ol><li> Thaw Taurin Lager komplett mit einem 37 ° C Wasserbad. </li><li> Bereiten Sie alle Lösungen aus Stammlösungen (Tabelle 1, Stammlösungen) und mischen Sie die Saccharose mit anderen Inhaltsstoffen mit einem Magnetrührer für jede Lösung. <ol><li> Vorbereitung 15 ml der Homogenisierung Lösung auf eine Endkonzentration von 20% Saccharose, 20 mM Tris-Acetat pH 7,2, 2 mM MgCl 2, 10 mM Glucose und 5 mM Taurin. </li><li> Bereiten Sie die 25% igen Saccharoselösung bis zu einer Endkonzentration von 25% Saccharose (unter Verwendung von 70% Saccharose stock), 20 mM Tris-Acetat pH 7,2, 10 mM Glucose und 5 mM Taurin. </li><li> Bereiten Sie die 60% igen Saccharoselösung bis zu einer Endkonzentration von 60% Saccharose (unter Verwendung von Saccharose-Pulver), Tris 20 mM Acetat pH 7,2, 10 mM Glucose und 5 mM Taurin. </li><li> Die Waschlösung 1 bis zu einer Endkonzentration von 20 mM Tris-Acetat pH 7,2 und 5 mM Taurin. </li><li> Bereiten Sie die Waschlösung 2bis zu einer Endkonzentration von 10% Saccharose, 20 mM Tris-Acetat pH 7,2 und 5 mM Taurin. </li><li> Die Waschlösung 3 bis zu einer Endkonzentration von 10% Saccharose, 20 mM Natriumphosphat, pH 7,2 und 5 mM Taurin. </li></ol></li><li> Beruhigen die Steigung Macher auf einen Magnetrührer und legen einen Rührstab in der Kammer in der Nähe der Ausfahrt, wo die 60% ige Lösung wird eingefügt. Verwenden Sie einen Cut-off-P200 Pipettenspitze am Ausgang des Rohres platziert, um eine ordnungsgemäße Gießgeschwindigkeit zu erzielen. </li><li> Guss linearen Gradienten zart durch Verdünnen und Rühren der 60% Saccharose-Lösung mit 25% eine mit 12 ml von jeder Lösung (dh insgesamt 6 Röhrchen für 80 Augen) in vorgekühlte Ultrazentrifugenröhrchen. Rühren Sie die allmählich-Verdünnung 60% Saccharose-Lösung gut. Beruhigen die Geschwindigkeit Gradientenfluss, Eingießen der Lösung reibungslos und nicht zu schnell. HINWEIS: Um einen kontinuierlichen, linearen Gradienten zu erhalten, halten Sie die Pipettenspitze Öffnung direkt an der Oberfläche der Lösung für den gesamten Gradienten Formation. </li><li> Lassen Sie die Gradienten sitzen auf Eis für etwa 1 Stunde zur Stabilisierung. Halten Sie die Steigungen gekühlt, bis geladen. Die Röhrchen nicht schütteln, um eine Unterbrechung des Gradienten zu vermeiden. </li></ol></li><li> Tissue Sammlung: <ol><li> Sammeln Gewebe unter dim rotes Licht. Nehmen Sie ein Auge in der einen Hand und stecken Sie die Front mit Rand Rasierklinge, während das Auge weg halten (um Spritzer zu vermeiden; Abbildung 1). Verwenden die Rasierklinge an der vorderen Augapfel in 2 Hälften (Kornea plus mindestens 5 mm in die Sklera) geschnitten. Entfernen Sie das Objektiv und drehen Sie die Augenmuschel von innen nach außen, so dass es über die Spitze eines Fingers damit Freilegen der Netzhaut kann stattfinden. </li><li> Mit der Rasierklinge in einem Winkel, sanft kratzen die Netzhaut, Abnehmen leicht und als rosa Schicht erscheinen, vor der Tapetum Oberfläche und an der Sehnervenkopf (Abbildung 1) zu schneiden. Sammeln Sie alle Netzhaut in 2 x 50 ml Röhrchen jeweils mit 15 ml der Homogenisierung Lösung auf Eis. </li><li> Retina homogenisierung: <ol><li> Schütteln Sie die Suspension kräftig von Hand für 2 Minuten, um die verschiedenen Zellschichten unterbrechen, brechen POS aus dem Rest der PR-Zelle, Fragment POS und homogenisieren die Netzhaut Federung. </li><li> Filter 3x durch eine Doppelschicht von sauberen Gaze, um große Gewebestücke entfernen und die Durchströmung in saubere 50-ml-Röhrchen (Abbildung 1). Die Netzhaut-Suspension ziemlich dick, um den Ertrag zu maximieren, drücken Sie vorsichtig auf die Gaze, um die verbleibenden fragmentiert Gewebe nach jeder Filtration lösen. </li></ol></li></ol></li><li> Photorezeptoraußensegment Fragment (POS) Isolierung: <ol><li> Legen Sie vorsichtig das rohe Netzhaut prep, um 6-7 ml pro Röhrchen, über 6 x 30 ml Ultrazentrifugenröhrchen mit jeweils 24 ml frisch, gekühlt kontinuierlichen 25-60% Saccharose-Gradienten (Abbildung 1). Gleichen Sie die gegnerischen Rohre entsprechend der Rotor verwendet werden. Ultrazentrifuge bei 106,000 × g für 50 min bei 4 ° C. </li&gt; <li> Verringert sich die Lösung über der orangerosa Band im oberen Drittel des Gradienten durch Aspiration (2A). Sammeln Sie die orange rosa Band mit einem Cut-off-P1000 Spitze in ein Becherglas. Entsorgen Sie die Ruhe nach dem Neutralisieren mit Bleichmittel (Biomüll). </li><li> Verdünnen mit ~ 4-5 Volumina eiskaltem Wash 1 Lösung. Trennen in so viele 30-ml-Röhrchen nach Bedarf. Zentrifuge bei 3000 × g für 10 min bei 4 ° C. Vorsichtig den Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren Pellets in 10 ml Waschlösung 2 und Schleudern bei 3.000 × g für 10 min wie oben beschrieben. Resuspendieren Pellets in 15 ml waschen 3 und Spin wieder bei 3.000 × g für 10 min. Kombinieren Suspensionen aus mehreren Pellets, um die Anzahl der Rohre vor dem Zentrifugieren benötigt in Wash 2 zu reduzieren und waschen 3 Lösungen. </li></ol></li><li> POS Aliquotierung ohne Etikettierung: <ol><li> Resuspendieren POS in 10 - 20 ml DMEM. Vorverdünnungsvertiefung 10 ul in 490 ul DMEM (1:50) und zählen als auch länglich wie wirbelte POS in eineZellzählung Kammer (2B). Berechnen Ausbeute und Konzentration im POS Partikel pro ml. HINWEIS: Die Ausbeute variiert in Abhängigkeit hauptsächlich vom Alter und der Stamm des Schweine / Kühen und Größe der Augen, beispielsweise eine gute Vorbereitung Bereiche 5-8 x 10 9 POS 80 Schweineaugen. </li><li> Entscheiden über die endgültige DMEM Volumen (typischerweise 10 - 20 ml) und füge Saccharose bis zu einer Endkonzentration von 2,5% Saccharose zu ergeben. </li><li> Bereiten Aliquots der gewünschten Größe, beispielsweise 5 x 10 7 POS pro Röhrchen für eine 2 ml Resuspensionsvolumen für eine 96-Well-Experiment bei 40 &amp; mgr; l / Vertiefung. Spin 1 Aliquot für 5 min bei 2.300 × g bei RT und auswerten Pelletgröße. Bereiten verschiedenen aliquoten Größen für unterschiedliche Anwendungsmengen wie POS sollte nicht eingefroren und aufgetaut werden zweimal. </li><li> Gefriert POS Aliquots bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung. HINWEIS: Aliquots werden für viele Monate stabil. In unseren Händen können unmarkierten oder markierten POS für mindestens ein Jahr gelagert werden. </li></ol></li><li> POS-Kennzeichnung und Aliquotierung: HINWEIS: Wir verwenden typischerweise FITC POS zur Quantifizierung der Phagozytose Assays zu markieren, aber auch andere Farbstoffe, können ebenfalls verwendet werden, je nach Bedarf. <ol><li> Resuspendieren 1 10 mg FITC Ampulle bei einer 2,5 mg / ml Konzentration in 0,1 M Na-Carbonat-Puffer pH 9,5 hergestellt, indem 2,6 ml 0,1 M NaHCO 3, pH 8,4, mit 1,4 ml 0,1 M Na 2 CO 3 pH 11,5 (Tabelle 2, Stock-Lösungen). Drehen Sie für 1 Stunde bei RT während der Schutz vor Licht und Spin für 5 min bei maximaler Geschwindigkeit zu pelletieren, nicht suspendiert FITC Feststoffe. </li><li> Resuspendieren POS Pellet in 10 ml Wash 3 -Lösung (oder DMEM) und 2 ml FITC-Lösung für 80 Augen. Bewahren Sie übrig gebliebenen FITC gefrorenen bei -80 ° C. Drehen für mindestens 1,5 h bei RT. Vor Licht mit Aluminiumfolie. </li><li> Wie in Abschnitt 2.3.4 beschrieben waschen beschriftet POS zweimal mit Waschlösung 3, dann ein- oder zweimal in DMEM, bis fast keine freien FITC im Überstand f gesehenraction. Resuspendieren POS in DMEM und gehen Sie wie bei nicht markierten POS zum Zählen und Aliquotierung (Abschnitt 2.4). </li></ol></li><li> Mit POS in Experimenten: <ol><li> Thaw POS bei RT, und halten Sie sie in der Dunkelheit so viel wie möglich, wenn sie fluoreszenzmarkierten sind. Spin für 5 min bei 2300 × g bei RT. Saugen Sie den Überstand. </li><li> Sofort in geeigneten Volumen Assay-Lösung zu resuspendieren, wie durch das Experiment bestimmt. Bei verschiedenen Zeiten des POS Herausforderung, resuspendiert Shop POS bei RT im Dunkeln zwischen Zeitpunkten für mehrere Stunden. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

Drei Schritte und Bedingungen sind von entscheidender Bedeutung für eine optimierte Reinigung: Qualität der Guss Gradienten und zarte Farbverlauf Rohre Manipulation, wobei Gewebe gekühlt und im Dunkeln, bis die Sammlung Schritt, Stärke Schütteln von Netzhaut Homogenate die richtige POS Isolation vom Rest der PR zu erhalten Zelle. Wenn einige Probleme in richtig sehen Sie die orange Band auftreten, sind sie sehr wahrscheinlich auf einer der drei oben genannten Gründen (siehe auch den zweiten Absatz des Abschnitts <...

In der Netzhaut ist das Sehvermögen durch Isomerisierung von lichtempfindlichen Moleküle, so genannte Opsine, bevor es in ein Signal, das zwischen den Nervenzellen bis zu den bildenden Bereiche im Gehirn übertragen werden können, verwandelt ausgelöst. Diese Moleküle werden in Stapeln von membranöse Scheiben ähnlich Pfannkuchen, die die äußeren Segmentieren von Teilen der Photorezeptorzellen (PRs) bilden eingebettet. An ständige Exposition gegenüber Licht und damit erhebliche Mengen an oxidativen Stress ausgesetzt, PRs kontinuierlich erneuern ihre äußeren Segmente auf mögliche oxidative Schäden zu begrenzen. Photorezeptoraußensegmente sind in engem Kontakt mit apikalen Mikrovilli der benachbarten retinalen Pigmentepithel (RPE) Zellen. RPE-Zellen bilden den äußeren Teil der Blut-Retina-Schranke und gewährleisten eine Vielzahl von Aufgaben, die entscheidend für Photorezeptoren Gesundheit und Funktion 1 sind, wie beispielsweise Abschrecken Lichtstrahlen über die Melaninpigmente Rückisomerisierung der photoreaktiven Komponente Opsin Retinal, Bereitstellung von Nährstoffen und gACHSTUM Faktoren, die Teilnahme an PR-Metaboliten zur Verfügung. Außerdem RPE-Zellen eliminieren verbrachte POS und recyceln ihre Komponenten, eine tägliche Beschäftigung, die durch die zirkadianen Rhythmus in Säugernetzhaut 2,3 geregelt ist. Die Clearance von Schuppen POS ist für PR Überleben absolut notwendig. Wenn es vollständig außer Kraft gesetzt wird, POS Schmutz ansammeln und PRs degenerieren raschem Sehverlust 4,5. Wenn die rhythmische Profil verloren geht und durch eine konstante Aktivität ersetzt, PR und RPE-Defekte zu akkumulieren mit 6 Jahren. Daher ist es sehr wichtig, die molekularen Regulierung der RPE Phagozytose in vitro um Phänotypen seiner Dysfunktion verknüpft verstehen charakterisieren. Interessanterweise ist die molekulare Maschinerie in RPE-Zellen sehr ähnlich dem von Makrophagen verwendet, um apoptotische Zellen zu löschen, und beide sind von der Anerkennung der exponierten Phosphatidylserin auf phagozytischen Trümmer 7-9. Dennoch RPE-Zellen und Makrophagen regulieren phagocytosis verschieden Makrophagen sich für sofortige Beseitigung apoptotischer Zellen bei Begegnung Zeit während RPE Zellen rhythmisch verschlingen POS nur einmal am Tag trotz dauerndem Kontakt mit äußeren Segmenten. Dies legt nahe, spezifischen Regulationsmechanismen, die noch nicht vollständig verstanden sind. Viele der Moleküle in der RPE phagozytischen Maschinen gebracht wurden identifiziert oder bestätigt durch die Verwendung von isolierten POS und Zellkulturassays Phagozytose. Die alphavbeta5 Integrin-Rezeptor an der RPE apikalen Zelloberfläche lokalisiert, in Abstimmung mit seinem Liganden MFG-E8, bindet spezifisch an POS-10-12, die dann über die MerTK Tyrosinkinase-Rezeptor 13-15 internalisiert. Die CD36-Scavenger-Rezeptor wurde gezeigt, dass im POS Aufnahme teilnehmen und sie beeinflussen die Geschwindigkeit 16,17 und könnte als Sensor von oxidierten Phospholipiden am POS Fläche 18 dienen. Internalisierung muss die Einstellung von F-Aktin-Zytoskelett-associated Proteine ​​wie Annexin 2 19, Myosin II 20 und Myosin VIIA 21,22. Einheimische oder oxidierte POS in vitro auch genutzt werden, um Alterungs Phänotypen der RPE-Zellen in vivo, um die Ansammlung von schlecht verdauten oxidiert POS 23-28 verbunden zu verstehen. Die Erzeugung von RPE-Zellen aus Stammzellen hat eine neue Anwendung für isolierte POS, die verwendet werden, um die Funktionalität der Zellen nachweisen, bevor sie an Tieren oder Patienten transplantiert 29,30,27 eingeleitet. Zuerst von Molday und Kollegen im Jahr 1987 31 beschrieben, das Protokoll für die Isolierung von Rinder POS kombiniert eine Ultrazentrifugationsschritt retinaler Homogenate auf kontinuierliche Saccharosegradienten mit Beobachtung der charakteristische orange Aussehen ungebleichtem retinalen Photopigment (Buch 11-cis Retinal). In den letzten 10 Jahren, aufgrund Vorsichtsmaßnahmen, um das Risiko von Rinderwahnsinn zu minimieren, die Verwendung von Schweineaugen geworden increasingly prominent. Das hier beschriebene Protokoll zeigt, wie man große Mengen von POS vom Schwein oder Rind Augen, aliquotiert und für längere Zeiträume gelagert werden können, zu erhalten. Dies beseitigt die Notwendigkeit, POS Nagetier Augen, die Verwendung einer großen Anzahl von Tieren pro POS Aufbereitung und Analyse 32,33,21,22 erfordert vorzubereiten. Zusätzlich werden Informationen über POS Kennzeichnung vor der Lagerung unter Verwendung von fluoreszierenden Molekülen gegeben, zu quantifizieren und zu visualisieren POS in einer vereinfachten und vergleichbarer Weise für einige Anwendungen im Vergleich zur Kennzeichnung POS nach dem Phagozytosetest 32,10. Daher sind diese große Bestände ermöglichen Reproduzierbarkeit und Benutzerfreundlichkeit in vielen verschiedenen Arten von Experimenten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="811">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:311px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:108px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:291px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Specific Material/Equipment</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">2-chamber gradient maker</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>gradient maker with 30-ml chambers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">3-mm diameter silicone tubing</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>tubing for gradient casting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">small size magnetic stir bar</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>stir bar fitting the gradient maker chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">red safelight lamp</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>inactinic lamp for dissection in the dark</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Clear 25x89 cm tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344058</td>
			<td>ultracentrifugation tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PP Oak Ridge tubes</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3119-0050</td>
			<td>30-mL centrifugation tubes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima LE-80K&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>365668</td>
			<td>ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW 32Ti swing rotor</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>369694</td>
			<td>swing rotor for ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Avanti J-26 XP</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>393124</td>
			<td>centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">JA-25.50 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>363058</td>
			<td>rotor for Avanti J-26 XP centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">FITC Isomer I</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>F-1906</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Other Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">counting chamber (such as Neubauer or Malassez)</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dark ice buckets with lids</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">scales</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">magnetic stirrer and upholding pole</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">refrigated microcentrifuge</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">37 &#176;C water bath</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">-80 &#176;C freezer</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">labcoat</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>Health and safety</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gloves</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sleeve protectors</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">googles</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">absorbent pads</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">biohazard trash bags and bins</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Weck-Prep blades (60-mm/2.25-in wide razor blades)</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-cm plastic dish</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sterile gauze sheets</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15- and 50-mL tubes</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>Common consumables</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microtubes</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">aluminum foil</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale purification of porcine or bovine photoreceptor outer segments for phagocytosis assays on retinal pigment epithelial cells

Analyse eines der lebenswichtigen Funktionen des retinalen Pigmentepithels (RPE) -Zellen, die Phagozytose von verbrauchtem gealtert distalen Fragmente Photorezeptor äußeren Segmente (POS) kann in vitro durchgeführt werden. Photorezeptoraußensegmente mit Stapeln von membranöse Scheiben die Phototransduktion Maschinen, die kontinuierlich in der Netzhaut erneuert. Gesamte POS werden täglich von RPE-Zellen eliminiert. Nagetier, Schwein / Rind und humanen RPE-Zellen erkennen POS verschiedener Spezies in einer ähnlichen Weise. Zur Erleichterung der Durchführung von großen Versuchsreihen mit geringer Variabilität kann ein großes Lager an POS aus Schweineaugen isoliert und gelagert werden in Aliquots eingefroren werden. Dieses Protokoll nutzt die Eigenschaft des Photopigmente, die eine orange Farbe an, wenn im Dunkeln gehalten. Unter schwachem Rotlicht, Netzhaut werden in einem Puffer aus geöffneten Augenmuscheln halbieren gesammelt. Das Retinazellsuspension homogenisiert, filtriert und auf einem kontinuierlichen Saccharosegradienten geladen. Nach centrifugation, POS in einer diskreten Bande im oberen Teil des Gradienten, der eine charakteristische orange Farbe hat entfernt. POS werden dann gesammelt, zentrifugiert, resuspendiert nacheinander in Waschpuffer, gezählt und aliquotiert. POS auf diese Weise erhalten wird, kann für die Phagozytose-Assays und Analyse von Protein-Aktivierung, Lokalisierung oder Wechselwirkung zu verschiedenen Zeiten nach POS Herausforderung verwendet werden. Alternativ kann POS mit Fluorophoren markiert werden, e. G., FITC, bevor Aliquotieren für nachfolgende Fluoreszenz Quantifizierung POS Bindung oder Phagozytose. Weitere mögliche Anwendungen umfassen die Verwendung von modifizierten POS oder Kassen Herausforderung verbunden mit Stressbedingungen, um die Wirkung von oxidativem Stress oder Alterung auf die RPE-Zellen zu untersuchen.

Die Kombination aus der linearen Saccharosegradienten und Ultrazentrifugation ermöglicht die Trennung der verschiedenen Komponenten des retinalen Suspension durch Dichtegradientenzentrifugation. Schwer größeren retinalen Trümmer und RPE Zellen sinken auf oder nahe dem Boden des Gradienten (2A). Feuerzeug POS und leichter einzelne Zellen oder Zelltrümmer von der Netzhaut wandern als separate Bänder, um die obere Hälfte des Gradienten, der durch das Ende der Zentrifugationsdauer erreichen. Indem di...

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Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 &#176;C.

Groß Reinigung von Schwein oder Rind Photorezeptoraußensegmente für Phagozytose Assays auf Netzhautpigmentepithelzellen

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

large-scale-purification-porcine-or-bovine-photoreceptor-outer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K Aufrufe.  INSERM, U968. This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 °C.

Serie: Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Die Anwendung eines Maus Ligierte Peyer-Patch-Darmschlinge Assay zu bakterielle Aufnahme von M-Zellen auswerten

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

Isolierung von myeloider dendritischer Zellen und Epithelzellen Menschliche Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

High Yield Reinigung von<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoiten Zur Verwendung in opsonierende Antikörper-Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Murine Thymusepithelzellen

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Makrophagen-Cholesterin Depletion und Auswirkungen auf die Phagozytose<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles (MPs) are one such type of vesicles, ranging in diameter from 0.1 &#956;m to 1 &#956;m, and typically shed from the plasma membrane of eukaryotic cells undergoing activation or apoptosis. Here we describe the generation of T lymphocyte&#8211;derived microparticles (LMPs) from apoptotic CEM T cells stimulated with actinomycin D. LMPs are isolated through a multistep differential centrifugation process and characterized using flow cytometry. This protocol also presents an in situ cell death detection method for demonstrating the proapoptotic effect of LMPs on bronchial epithelial cells derived from mouse primary respiratory bronchial tissue explants. Methods described herein provide a reproducible procedure for isolating abundant quantities of LMPs from apoptotic lymphocytes in vitro. LMPs derived in this manner can be used to evaluate the characteristics of various disease models, and for pharmacology and toxicology testing. Given that the airway epithelium offers a protective physical and functional barrier between the external environment and underlying tissue, use of bronchial tissue explants rather than immortalized epithelial cell lines provides an effective model for investigations requiring airway tract tissue.

Cell membrane&#8211;shed microparticles (MPs) are active biological vesicles that can be isolated and their pathophysiological effects investigated in various models. Here we describe a method for generating MPs derived from T lymphocytes (LMPs) and for demonstrating their proapoptotic effect on airway epithelial cells.

Generierung von lymphatische Mikropartikel und Nachweis ihrer pro-apoptotische Wirkung auf die Epithelzellen der Atemwege

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

Legionella pneumophila der äußeren Membran - Vesikeln: Isolierung und Analyse ihrer Pro-inflammatorische Potential auf Makrophagen

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and inflammatory intractable diseases. We herein developed an experimental method to investigate phagocytosis quantitatively using the fruit fly Drosophila, in which the gene network controlling engulfment reactions is evolutionally conserved from mammals. In order to accurately detect and count engulfing and un-engulfing phagocytes using whole animals, Drosophila embryos were homogenized to obtain dispersed cells including phagocytes and apoptotic cells. The use of dispersed embryonic cells enables us to measure in vivo phagocytosis levels as if we performed an in vitro phagocytosis assay in which it is possible to observe all phagocytes and apoptotic cells in whole embryos and precisely quantify the level of phagocytosis. We confirmed that this method reproduces those of previous studies that identified the genes required for the phagocytosis of apoptotic cells. This method allows the engulfment of dead cells to be analyzed, and when combined with the powerful genetics of Drosophila, will reveal the complex phagocytic reactions comprised of the migration, recognition, engulfment, and degradation of apoptotic cells by phagocytes.

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

We herein describe a phagocytosis assay using the dispersed embryonic cells of Drosophila. It enables us to easily and precisely quantify in vivo phagocytosis levels, and to identify new molecules required for the phagocytosis of apoptotic cells.

Phagozytose - Assay für apoptotische Zellen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

Laminar-Flow-based Assays, Rekrutierung von Leukozyten auf kultivierten vaskuläre Zellen und adhärenten Thrombozyten zu untersuchen

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to restore function of glands damaged by radiation therapies or due to pathologies associated with Sj&#246;gren's syndrome. A second goal of researchers is to define the mechanisms by which viruses replicate within glandular tissue where they can then gain access to salivary fluids important for horizontal transmission. These goals highlight the need for a robust and accessible in vitro salivary gland model that can be utilized by researchers interested in the above mentioned as well as related research areas. Here we discuss a simple protocol to isolate epithelial cells from human salivary glands and propagate them in vitro. Our protocol can be further optimized to meet the needs of individual studies. Briefly, salivary tissue is mechanically and enzymatically separated to isolate single cells or small clusters of cells. Selection for epithelial cells occurs by plating onto a basement membrane matrix in the presence of media optimized to promote epithelial cell growth. These resulting cultures can be maintained as three-dimensional clusters, termed "salispheres", or grown as a monolayer on treated plastic tissue culture dishes. This protocol results in the outgrowth of a heterogenous population of mainly epithelial cells that can be propagated for 5-8 passages (15-20 population doublings) before undergoing cellular senescence.

We present a method for isolating and cultivating primary human salivary gland-derived epithelial cells. These cells exhibit gene expression patterns consistent with them being of salivary epithelial origin and can be grown as salispheres on basement membrane matrices derived from Engelbreth-Holm-Swarm tumor cells or as monolayers on treated culture dishes.

Isolierung von Speicheldrüsenepithelzellen aus menschlichen Speicheldrüsen für In-Vitro-Wachstum als Speicheldrüsen oder Monolayer

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...