Diese Arbeit wurde vom Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO) Vlaanderen G0466.10, 11I0113N unterstützt; &quot;Eddy Merckx Research Grant&quot; und die &quot;Sporta Forschung Grant&quot; für Pädiatrische Kardiologie, UZ Leuven, Belgien (JC); das Zentrum für Molekulare und Vaskuläre Biologie wird durch die Programmafinanciering KU Leuven (PF / 10/014), die von der &quot;Geconcentreerde Onderzoeksacties&quot; (GOA 2009/13) von der Universität von Leuven und ein Forschungsstipendium von Boehringer Ingelheim.

Tierversuche wurden von der Ethikkommission der KU Leuven genehmigt. 1. Vorbereiten Bakterien für In-vitro-Perfusionen und In-vivo-Experimente <ol><li> Wir verwendeten S. aureus-Stamm Newman für alle in dieser Handschrift beschriebenen Experimente. S. aureus Newman in Brain Heart Infusion (BHI) mit 10% Glycerin bei -80 ° C gelagert. </li><li> Verwenden Sie eine sterile Schleife, um die gefrorenen Bakterien bei 37 ° C (OD 600&gt; 3) abkratzen und impfen in 5 ml CASO-Bouillon (TSB) O / N. </li><li> Waschen der Bakterien durch Zentrifugation (2.600 g, RT, 5 min) und Resuspension des Bakterienpellets in 5 ml PBS (phosphatgepufferte Salzlösung). </li><li> Eine 1 mg / ml Lösung von 5 (6) -Carboxy-fluorescein-N-hydroxysuccinimidylester (Carboxyfluorescein) in Ethanol. Verdünne die 1 mg / ml Carboxy-Fluorescein-Lösung zu 150 &amp; mgr; g / ml in Wasser in Laborqualität (zB MilliQ Wasser). Schützen Sie die Rohre vor Lichtmit Aluminiumfolie und bei -20 ° C. </li><li> Zentrifugieren Bakterien (2.600 xg, RT, 5 min). Resuspendieren der Bakterienpellets in 800 &amp; mgr; l PBS und 200 &amp; mgr; l (Endkonzentration 30 ug / ml für die Perfusion Experimente) oder 400 &amp; mgr; l (Endkonzentration 50 ug / ml für die in vivo-Experimente) der 150 ug / ml Carboxy-Fluorescein-Lösung. Schützen Sie die Rohre von Licht mit Aluminiumfolie und Inkubation für 30 min bei RT auf einem Schüttler. </li><li> Nach der Markierung Block mit 6% Rinderserumalbumin (BSA) -Lösung in PBS. </li><li> Verdünnte Bakterien mittels optischer Densitometrie (OD), eine OD 600 von 0,65 für die in vitro-Experimente (entsprechend etwa 3 × 10 8 koloniebildenden Einheiten (CFU) / ml für S. aureus) und eine OD 600 von 1,8 für die in vivo-Experimente ( entsprechend etwa 1 x 10 9 CFU / ml für S. aureus) in PBS. Schützen Sie die Rohre von Licht mit Aluminiumfolie und verlassen auf dem Eis. </li></ol> 2. In Vitro Perfusionsexperimenten <ol><li> Beschichtung der Deckgläser <ol><li> Verdünnter von Willebrand Faktor (VWF) (Haemate P, Stammkonzentration 2,400 ug / ml) in Laborqualität Wasser (entionisiertem destilliertem) bis zu einer Endkonzentration von 50 ug / ml. </li><li> Verdünnter Kollagen in isotonischer Glucoselösung (SKF-Lösung, pH 2,7-2,9, wie vom Hersteller geliefert) in einer Endkonzentration von 160 ug / ml. </li><li> Coat Deckgläser (24 x 50 mm) mit VWF oder Kollagen durch Fallenlassen 200 ul der Beschichtung auf Parafilm und legen Sie das Deckglas auf der Oberseite des Tropfens. Das Tröpfchen entlang der Oberfläche des Deckglases verteilt. </li><li> Inkubiere das Deckglas in einem befeuchteten Behälter für 4 h bei RT. Die Deckgläser aus dem Parafilm Heben Sie mit einer stumpfen Nadel. Montieren Sie das Deckglas in den unteren Teil der Durchflusskammer. </li></ol></li><li> Beschichtung von Kunststoff Slips mit Endothelzellen <ol><li> Coat Kunststoff rutscht(1-well PCA Zellkulturkammer, Sarstedt, Deutschland) mit 1 ml einer 1% igen Gelatinelösung in PBS und Inkubation für 30 min bei 37 ° C. Samen menschlichen Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) auf den mit Gelatine beschichteten Kunststoff rutscht und sie wachsen zu 70-80% Konfluenz. Montieren Sie die Kunststoff-Schlupf in den unteren Teil der Durchflusskammer. </li></ol></li><li> Perfusion Experiment ANMERKUNG: Eine schematische Übersicht der in vitro Perfusionsmodell ist in Figur 1 dargestellt. <ol><li> Führen in vitro bakterielle Adhäsion Studien in einem Mikroparallelplattenflusskammer in einer laminaren Scherspannung zwischen 2,5 dyne / cm 2 und 20 dyne / cm 2, um verschiedene physiologische Strömungsbedingungen zu simulieren. </li><li> Die Durchflusskammer (Inhouse-Design) besteht aus einem Metallrahmen und einer Perfusionskammer aus Plexiglas (Poly (methyl) (PMMA)). Indem zu einem hochgenauen Infusionspumpe (PHD 2000 Infusion, Harvard Apparatus, USA) verbinden, können wir Strömungs ra erzeugentes zwischen 0,0001 &amp; mgr; l / min und 220.82 ml / min. </li><li> Den Schlauch an dem oberen Teil der Strömungskammer und injizieren Mediums im Schlauch. Platzieren danach den oberen Teil der Strömungskammer auf der Oberseite der Bodenteil und der Durchflusskammer zu montieren. Seien Sie vorsichtig, um Luftblasen zu vermeiden. Injizieren Sie 1 ml Medium durch die Kammer, um sicherzustellen, dass die Kammer nicht undicht und um überschüssige Beschichtungslösung zu entfernen. Vermeiden Sie Luftblasen. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf einer thermo-kontrollierten Heizkissen bei 37 ° C auf einem Mikroskop-Fach. Da es sich um ein Anschlussverfahren, gibt es keine Notwendigkeit für strenge aseptische Verfahren. Einen Einschnitt in der Nähe der Halsschlagader, entfernen Sie vorsichtig die rechte Seite der Halsmuskel und zu isolieren, die Halsschlagader aus dem umgebenden Gewebe. </li><li> Einrichten der Infusionspumpe und Fluoreszenzmikroskop. Infusionspumpe Einstellungen hängen von der Spritzendurchmesser und die gewünschte Durchflussrate (siehe Abschnitt 2.4). Von nun an arbeiten in einem dunklen Raum. </li><li> VWF Beschichtung: <ol><li> Füllen Sie eine Spritze mit fluoreszenzmarkierten Bakterien und schließen Sie es an das Einlassrohr. Vermeiden Sie Luftblasen. Starten Sie die Infusionspumpe für 10 min. Die Infusionsdauer hängt von der Schergeschwindigkeit und der Beschichtung, Bakterien und Medium verwendet und sollte den stationären Zustand der Haftung darstellen. </li><li> Nach 10 min wurde abzuwaschen ungebundene Bakterien durch Verbinden einer Spritze mit PBS mit dem Einlassrohr und dem Start der Infusionspumpe. </li><li> Nehmen Sie sich mindestens 15 Bilder oder Filme an verschiedenen Orten nach dem Waschprozess. Bakterien sind kleine und potenziell schwer scharf zu stellen. Vor der in vitro Strömungsexperiment kann die geeignete Brennebene, indem ein Tropfen von fluoreszenzmarkierten Bakterien auf einem Deckglas und Platzieren des Deckglases in der Strömungskammer abgerufen werden. Dann suchen Sie nach dem entsprechenden Brennebene und speichern Sie die Einstellungen. HINWEIS: Bei der in vitro Strömungsexperiment Erfassen der Bilder während des Waschschritts (± 5 min nach dem Start) wird sichergestellt, dass nur dieSignal für anhaftende Bakterien eingefangen. </li></ol></li><li> Collagen Beschichtung: <ol><li> In 60 ug / ml VWF an die fluoreszenzmarkierten Bakterien kurz vor dem Start der Perfusion. Füllen Sie eine Spritze mit fluoreszenzmarkierten Bakterien oder fluoreszenzmarkierten Bakterien, die mit 60 ug / ml VWF ergänzt und an das Einlassrohr. Vermeiden Sie Luftblasen. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.5.2 bis 2.3.5.3 </li></ol></li><li> Endothelzellen: <ol><li> Aktivierung der Endothelzellen durch Perfusion mit einer 0,1 mM Lösung des Ca 2+ -ionophore A23187 (Stammlösung 10 mM in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst ist) in DMEM für 10 min mit einer bei der gleichen Schergeschwindigkeit wie die bakterielle Perfusion durch Perfusion 0,1 mm. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.5.2 bis 2.3.5.3. </li></ol></li></ol></li><li> Berechnen Schergeschwindigkeit und Scherspannung wie folgt. Schergeschwindigkeit = 6Q / wh 2 Wo: Q: Durchfluss in ml / min, w: Breite in cm, h: Höhe in cm Schubspannung (τ) = Schub Ratteex Viskosität (μ) Wo μ: mittel: 0,01 dyn x sec / cm 2, Vollblut: 0,04 dyn x sec / cm 2 </li><li> Bildanalyse <ol><li> Erhalten Sie Live-Bilder mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop mit einem Schwarz-Weiß-Kamera und zu entwickeln, mit Imaging-Software. Verwenden Sie die Belichtungszeit von 1,5 sec. Nehmen Sie mehrere Snapshots (mindestens 15) nach dem Zufallsprinzip über die beschichtete Fläche der Strömungskammer verteilt und speichern Sie sie in das entsprechende Dateiformat. </li><li> Führen Sie die Bildanalyse mit ImageJ. Subtrahieren Sie den Hintergrund, um glatte kontinuierliche Hintergründe aus dem Bild (Process - Substract Hintergrund) zu entfernen und legen Sie die Schwelle zum unteren und oberen Schwellenwerte festgelegt, die Segmentierung von Graustufenbildern in Merkmale von Interesse. Misst die Fläche, auf die Schwelle begrenzt. </li><li> Vergleichen bakterielle Adhäsion, ausgedrückt als Fluoreszenzbereich, beispielsweise mit Hilfe von statistischen Analysesoftware. Vergleichen Sie die Gruppen mit one-way ANOVA oder two-tailed Student-t-Test. Berichten alle Werte als Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM). Betrachten wir ein p-Wert von &lt;0,05 signifikant (* p &lt;0,05; ** p &lt;0,01; *** p &lt;0.001). </li></ol></li></ol> 3. In Vivo Mesenteriale Perfusionsmodell <ol><li> Vorbereitung / Chirurgie der Maus <ol><li> Schnell die Maus in der Nacht vor dem Experiment, um Stuhlgang zu begrenzen. </li><li> Geben Sie eine 6-8 Wochen alten Maus (C57BL / 6) präoperative Analgesie durch eine subkutane Injektion von Buprenorphin (0,1 mg / kg Körpergewicht (BW)) 20-30 Minuten vor der Operation. </li><li> Betäuben die Maus durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (125 mg / kg KG) und Xylazin (12,5 mg / kg KG). Prüfen Sie durch Pedalreflex. Bewerben vet Salbe auf Trockenheit zu verhindern. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf einer thermo-kontrollierten Heizkissen bei 37 ° C auf einem Mikroskop-Fach. Da es sich um ein Anschlussverfahren, gibt es keine Notwendigkeit einer strikten asceptic Verfahren. Einen Einschnitt in der Nähe der Halsschlagader, entfernen Sie vorsichtig die rechte Seite der Halsmuskel und zu isolieren, die Halsschlagader aus dem umgebenden Gewebe. </li><li> Legen Sie eine 2 Französisch intravenösen Katheter in die rechte Halsschlagader für die Infusion von fluoreszenzmarkierten Bakterien oder andere Lösungen. Öffnen Sie die Bauchhöhle über eine Mittellinie Bauchschnitt und verwenden Wattestäbchen, um das Mesenterium verteilt und die mesenterialen Arteriolen und venulären Zirkulation zu visualisieren. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf der rechten Seite auf eine transparente Platte und befestigen Sie die Kanüle mit Klebeband. Verwenden Sie eine heiße Packung zu Unterkühlung zu verhindern. Zur Dehydratisierung des Gewebes zu verhindern, fallen 500 ul 0,9% NaCl auf die Eingeweide. </li></ol></li><li> Fluoreszenzmikroskopie von bakteriellen Adhäsion an die mesenterischen Zirkulations <ol><li> Arbeiten Sie in einem dunklen Raum. Verwenden Sie Wattestäbchen, um die Gefäße zu immobilisieren und visualisieren diese unter einem inversen Mikroskop. </li><li> 5 ul einer 10 mM Lösung o topisch anwendenf die Ca 2+ -ionophore A23187 in DMSO gelöst. Nach 10 sec, injizieren 100 ul markierten Bakterien (siehe Schritt 1) ​​durch die Jugularkatheter. Nehmen Sie Zeitraffer-Bilder. Nachdem das Experiment beendet ist, einschläfern die Maus nach institutionellen genehmigten Richtlinien. </li></ol></li><li> Bildanalyse <ol><li> Erhalten Sie Live-Bilder mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop erfasst mit einem Schwarz-Weiß-Kamera und entwickelt mit jeder Bildbearbeitungssoftware. Bewerben automatische Belichtungszeit und Kontrastoptimierung speziell für die verwendeten Geräte. </li><li> Erwerben Sie Zeitraffer-Bilder mit der &quot;Erwerb&quot; in der Werkzeugleiste (Multidimensional Acquisitions - Time) unter Verwendung von 40 Zyklen von 1000 Bildern / s. Speichern Sie die Bilder in einem entsprechenden Bild-Dateiformat. </li><li> Prozessbilder mit ImageJ-Analyse-Software, um den Bereich der Fluoreszenzsignal pro Bild zu messen. Definieren Sie die Schwelle zum unteren und oberen Schwellenwerte festgelegt, die Segmentierung von Graustufenbildern in features von Interesse. Identifizieren Sie die Region von Interesse (Blutgefäß) und messen Sie den Bereich, um die Schwelle und der Region von Interesse beschränkt. Vergleichen bakterielle Adhäsion, ausgedrückt als Fluoreszenz-Bereich mit jeder statistische oder grafische Software. </li></ol></li></ol>

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	<li>Vanassche, T., Peetermans, W. E., Herregods, M. C., Herijgers, P., Verhamme, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-thrombotic+therapy+in+infective+endocarditis.">Anti-thrombotic therapy in infective endocarditis.</a> Expert Rev Cardiovasc Ther. 9 (9), 1203-1219 (2011).</li><li>Heying, R., van de Gevel, J., Que, Y. A., Moreillon, P., Beekhuizen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin-binding+proteins+and+clumping+factor+A+in+Staphylococcus+aureus+experimental+endocarditis:+FnBPA+is+sufficient+to+activate+human+endothelial+cells.">Fibronectin-binding proteins and clumping factor A in Staphylococcus aureus experimental endocarditis: FnBPA is sufficient to activate human endothelial cells.</a> Thromb Haemost. 97 (4), 617-626 (2007).</li><li>Pappelbaum, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultralarge+von+Willebrand+factor+fibers+mediate+luminal+Staphylococcus+aureus+adhesion+to+an+intact+endothelial+cell+layer+under+shear+stress.">Ultralarge von Willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress.</a> Circulation. 128 (1), 50-59 (2013).</li><li>Claes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+Staphylococcus+aureus+to+the+vessel+wall+under+flow+is+mediated+by+von+Willebrand+factor&#8211;binding+protein.">Adhesion of Staphylococcus aureus to the vessel wall under flow is mediated by von Willebrand factor&#8211;binding protein.</a> Blood. 124 (10), 1669-1976 (2014).</li><li>Thiene, G., Basso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+and+pathogenesis+of+infective+endocarditis+in+native+heart+valves.">Pathology and pathogenesis of infective endocarditis in native heart valves.</a> Cardiovasc Pathol. 15 (5), 256-263 (2006).</li><li>Sixma, J. J., Schiphorst, M. E., Verweij, C. L., Pannekoek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+deletion+of+the+A1+domain+of+von+Willebrand+factor+on+its+binding+to+heparin,+collagen+and+platelets+in+the+presence+of+ristocetin.">Effect of deletion of the A1 domain of von Willebrand factor on its binding to heparin, collagen and platelets in the presence of ristocetin.</a> Eur J Biochem/FEBS. 196 (2), 369-375 (1991).</li><li>Theilmeier, G., Lenaerts, T., Remacle, C., Collen, D., Vermylen, J., Hoylaerts, M. 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A., Lehrer, S., Sohn, H. Y., Conzen, P., Pohl, U., Kr&#246;tz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+cyclooxygenase-2+enhances+platelet+adhesion+in+hamster+arterioles+in+vivo.">Selective inhibition of cyclooxygenase-2 enhances platelet adhesion in hamster arterioles in vivo.</a> Circulation. 110 (14), 2053-2059 (2004).</li><li>Kim, K. H., Barazia, A., Cho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+heterotypic+platelet-neutrophil+interactions+on+the+activated+endothelium+during+vascular+inflammation+and+thrombus+formation+in+live+mice.">Real-time imaging of heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice.</a> J Vis Exp. 2 (74), (2013).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Scherbeanspruchung ist ein entscheidender Faktor für die vorzeitige bakterielle Adhäsion an der Behälterwand und zur anschließenden Erzeugung des endovaskulären oder endokardialen Vegetationen und metastatischen Infektionen 4,5. Wir beschrieben in vitro und in vivo Modellen komplementär zu der Pathogenese von endovaskulären Infektionen unter physiologischen Scherspannungs studieren. Diese Modelle haben uns erlaubt, von Willebrand-Faktor-bindendes Protein (vWbp) als Haupt S. identifizieren aureus Protein unter Fluss mit einer verletzten Gefäßwand frei VWF 4 interagieren. Endovascular Infektionen und infektiöser Endokarditis sind insbesondere von Bedeutung, nicht nur weil der Sepsis-induzierten Organversagen und Tod, sondern auch wegen der lokalen und entfernten (&quot;metastatic &#39;) Komplikationen. Um infektiöse Endokarditis und metastatischen Infektionen verursachen, haben Bakterien an der Gefäßwand anhaften und somit Widerstand gegen die Scherspannung des strömenden Bluts. Am meistenUntersuchungen an Bakterien Virulenzfaktoren in statischen Bedingungen durchgeführt. Allerdings könnte diese etablierten Wechselwirkungen Scherkräfte und Untersuchungen nicht standhalten unter Strömungsbedingungen können neue, bisher nicht berücksichtigten Faktoren in Bakterien-Wirt Wechselspiel offenbaren. Unter Verwendung der Mikrofließkammer parallel haben wir ua die Bedeutung der VWF für vaskuläre Haftung gezeigt. Unter Scherbeanspruchung, VWF schrittweise entfaltet sich aus seiner Ruhekugelförmiger Struktur und macht die A1-Domäne, die mit Thrombozyten über seine GPIb-Rezeptor 6 zusammenwirkt. Strömungskammern wurden ausgiebig verwendet werden, um die Thrombozytenfunktion 7 studieren. Bemerkenswert ist, auch S. aureus Haftung unter Fluss erfordert VWF, insbesondere die A1-Domäne, die auf Scherung ausgesetzt ist. Wir identifizierten vWbp zu vermitteln VWF-Bindung. vWbp ist ein Koagulase, die auf S. trägt aureus Pathophysiologie durch Aktivierung des Hosts Prothrombin. Staphylothrombin, die resulting Komplex eines bakteriellen Koagulase und Prothrombin, wandelt Fibrinogen in unlösliches Fibrin 8,9. Unsere Studien haben gezeigt, dass nicht nur vWbp Prothrombin aktiviert, jedoch löst die Bildung von Bakterien-Fibrin-Blutplättchen-Aggregate, die die Haftung, die Blutgefäße unter Strömungs 4,10,11 verbessern. Die In-vitro-Flusskammer-Modell ermöglicht es, die verschiedenen Akteure in die bakterielle Adhäsion an zellulären oder Matrixkomponenten zu studieren. Bakteriellen Virulenzfaktoren können mit Mutanten oder harmlose Bakterien zur Expression spezifischer Oberflächenproteine ​​untersucht werden. Alternativ können pharmakologische Inhibitoren oder blockierende Antikörper gegen das Medium in der Strömungskammer zugegeben werden. Die Rolle von Wirtsfaktoren, wie beispielsweise unterschiedliche Bestandteile der extrazellulären Matrix können mit Deckgläsern mit verschiedenen Beschichtungen untersucht werden. Die Deckgläser kann auch mit Endothelzellen, deren Aktivierungsstatus kann durch Zugabe von spezifischen Stimulatoren moduliert werden abgedeckt. Apart aus der Gefäßwand, kann der Beitrag von Wirtszellen und Blutplasmaproteine ​​durch Zugabe dieser Faktoren strömenden Mediums untersucht werden. So können verschiedene Bedingungen zunehmender Komplexität unter standardisierten Bedingungen laminarer Strömung untersucht, um die Interaktionen, die Bakterien an der Gefßwand in vivo anhaften lassen entwirren. Wechselwirkungen in der in-vitro-Modell identifiziert werden anschließend in einem Tiermodell untersucht, um ihre Bedeutung in einem komplexen Organismus zu testen. Andere in vivo Modelle zur dynamischen Wechselwirkungen unter Strömungs studieren beschrieben, wie der Hamster Rückenhautkammer 12 und der Cremaster-Modell 13. Im Vergleich dazu ist das hier beschriebene mesenterica Perfusionsmodell bietet mehrere Vorteile aufgrund seiner Benutzerfreundlichkeit, die Möglichkeit zu variieren Host genetischen Hintergrund der Mäuse und pharmakologische Interventionen zu bewerten. Im Ergebnis der beschriebenen Modellebieten die Möglichkeit, Oberflächenproteine ​​nicht nur von S. studieren aureus, aber von vielen anderen Mikroorganismen in verschiedenen Host-Hintergründe, zum besseren Verständnis der Pathogenese von Gefäßinfektionen.

To establish endovascular infections, pathogens require a mechanism to adhere to the endothelium, which lines the vessel wall and the inner surface of the heart, and to persist and establish an infection despite being exposed to the shear stress of rapidly flowing blood. The most frequent pathogen causing life-threatening endovascular infections and infective endocarditis is Staphylococcus aureus (S. aureus)1. 
Various bacterial surface-bound adhesive molecules mediate adhesion to host tissue by interacting with extracellular matrix components. These MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) recognize molecules such as fibronectin, fibrinogen, collagen and von Willebrand factor (VWF). MSCRAMMs are important virulence factors of S. aureus and are implicated in the colonization and invasion of the host2. Most studies on these virulence factors have been performed in static conditions, and thus may not be representative for human infections where initial adhesion of the bacteria occurs in flowing blood. 
In the case of bloodstream infections, bacteria need to overcome the shearing forces of flowing blood in order to attach to the vessel wall. Models that investigate the interaction between bacteria and endothelium or subendothelium under flow conditions are therefore of particular interest. 
A recent study showed that the adhesion of S. aureus to blood vessels under shear stress is mediated by VWF3. VWF, a shear stress-operational protein, is released from endothelial cells upon activation. Circulating VWF binds to collagen fibers of the exposed subendothelial matrix. Our group reported that the von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of S. aureus is crucial for shear-mediated adhesion to VWF4. 
In this article, we present an in vitro flow chamber model where bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells can be evaluated. To validate the findings from in vitro data, we have developed an in vivo model that visualizes and quantifies the direct interaction of bacteria with the vessel wall and the formation of bacteria-platelet thrombi in the mesenteric circulation of mice, using real-time intravital vascular microscopy.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="border-collapse:
 collapse;width:192pt">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion (BHI)</td>
			<td>BD Plastipak&#160;</td>
			<td align="right">237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth (TSB)</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>CM0129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-169</td>
			<td>D-PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(6)-carboxy-fluorescein N-hydroxysuccinimidyl ester&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21878-25MG-F</td>
			<td>fluorescent labeling&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)</td>
			<td>Roch</td>
			<td colspan="2">10 735 086 001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemate-P</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>PL 15036/0010</td>
			<td>VWF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horm collagen</td>
			<td>Takeda</td>
			<td align="right">10500</td>
			<td>collagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-well PCA cell culture chambers</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td align="center" class="xl63">########</td>
			<td>plastic slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temgesic</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td align="right">283716</td>
			<td>bruprenorphine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesketin (Ketamin hydrochloride 115 mg/ml (100 mg/ml ketaminum))</td>
			<td>Eurovet</td>
			<td>BE-V136516</td>
			<td>ketamin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYL-M 2% (xylazine hydrochloride 23.32 mg/ml (20 mg/ml xylazine))</td>
			<td>VMD Arendonk</td>
			<td>BE-V170581</td>
			<td>xylazine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 french intravenous catheter green</td>
			<td>Portex</td>
			<td colspan="2">200/300/010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,9% Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Baxter Healthcare</td>
			<td>W7124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton swabs</td>
			<td>International Medical Product</td>
			<td align="right">300230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2+-ionophore solution A23187</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2">C7522-10 MG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 gauge 1 ml syringe&#160;&#160;</td>
			<td>BD Plastipak&#160;</td>
			<td align="right">300013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 gauge 1 ml syringe&#160; with needle</td>
			<td>BD Plastipak&#160;</td>
			<td align="right">300015</td>
			<td>intra-peritoneal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810-R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td colspan="2">5811 000.320</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips (24x50)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BB02405A11</td>
			<td>Thickness No, 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHD 2000 Infusion</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td align="right">702100</td>
			<td>High-accuracy Harvard infusion pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio-observer DI</td>
			<td colspan="2">Carl-Zeiss</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td colspan="2">National Institute of Health</td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 5,0</td>
			<td colspan="2">Graphpad Software</td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam MRm</td>
			<td colspan="2">Carl-Zeiss&#160;</td>
			<td>Black and white camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro and in vivo model to study bacterial adhesion to the vessel wall under flow conditions

Um endovaskuläre Infektionen und Endokarditis führen, müssen Bakterien in der Lage, an der Gefäßwand, während sie mit der Schubspannung des strömenden Bluts ausgesetzt haften. Um die Bakterien und Wirtsfaktoren, die zu Gefäß Adhäsion von Mikroorganismen beitragen zu identifizieren, werden geeignete Modelle, die diese Interaktionen unter physiologischen Scherbedingungen zu studieren benötigt. Hier beschreiben wir ein in-vitro-Strömungskammer Modell, das die bakterielle Adhäsion an verschiedenen Komponenten der extrazellulären Matrix zu untersuchen oder zu Endothelzellen ermöglicht und eine Intravitalmikroskopie Modell, das entwickelt wurde, um die anfängliche Adhäsion der Bakterien an die splanchnic Zirkulation in vivo direkt visualisieren . Diese Verfahren können verwendet werden, um die Bakterien und Wirtsfaktoren für die Adhäsion von Bakterien unter Strömung erforderlich identifizieren. Wir veranschaulichen die Bedeutung der Scherbelastung und die Rolle der von Willebrand-Faktor für die Adhäsion von Staphyaureus unter Verwendung von sowohl in vitro als auch in vivo-Modell.

S. aureus Haftung an VWF ist subendothelialen Matrix und Endothelzellen eine Scherspannung abhängiges Phänomen Um die Rolle der Scherbeanspruchung in der Wechselwirkung zwischen S. betonen aureus und VWF, führten wir Perfusionen über VWF beschichtete Deckgläser bei unterschiedlichen Schergeschwindigkeiten (eine schematische Übersicht über die in vitro-Perfusions-Modell ist in Abbildung 1 zu 2000 gegeben. Die Adhäsion von S. aureus mit zunehmenden Scherraten von 250 sec -1 erhöhten vWF sec -1 (Figur 2), was anzeigt, daß hohe Scherkräfte nicht hemmen, sondern verstärkt die Adhäsion von Bakterien an VWF. Um den Beitrag von VWF an die bakterielle Adhäsion an Kollagen zu untersuchen, die Hauptkomponente der subendothelialen Matrix, wir perfundiert fluoreszierend markierten S. aureus als Kollagen in Gegenwart oder Abwesenheit von VWF. In Abwesenheit von VWF, Adhäsion von S. einureus Kollagen nahm mit zunehmenden Scherraten. Wenn jedoch VWF im Medium vorhanden war, die Haftung von S. aureus mit zunehmenden Scherraten (Abbildung 3). Die in vitro-Flussmodell ermöglicht uns auch, um die Adhäsion von Bakterien untersucht, um Zellen unter Strömungs endotheliale. Wir durchbluteten HUVECs mit fluoreszenzmarkierten S. aureus bei Scherraten von 500 bis 2000 sec -1. Wo angegeben, wurden HUVECs mit einem Ca 2+ -ionophore aktiviert ist, um die Freisetzung von VWF verursachen. Endothelzellaktivierung und die anschließende VWF Release, erhöhte Adhäsion von S. aureus (4A), die typische &quot;strangartige&quot; Muster gebildet von fluoreszenzBakterienHaufen in der Richtung der Scherkraft (4B) ausgerichtet sind, was auf die Bindung von Bakterien entlang einer linearen gestreckte VWF Molekül markiert. Initial in vivobakteriellen Adhäsion in splanchnischen Venen wird durch VWF vermittelt Da S. aureus kann in VWF haften verwendeten wir Wildtyp-Mäusen (Vwf + / +) und vWF-defizienten Mäusen (vWF - / -), um die bakterielle Adhäsion an die aktivierte Gefßwand in vivo zu untersuchen. Echtzeit-Videomikroskopie des splanchnic Adern erlaubt die in vivo-Visualisierung zirkulierender fluoreszierend markierten S. aureus (Schematische Übersicht über die in vivo-Perfusions-Modell ist in Abbildung 5 dargestellt). Nach pharmakologische Aktivierung des Endothels durch die Ca 2+ -ionophore beobachteten wir rasche lokale Ansammlung von einzelnen Bakterien und Aggregate von Bakterien an der Gefäßwand von WT-Mäusen (ergänzende Videos 1 und 2). Fast keine Adhäsion von Bakterien wurde auf der aktivierten Gefäßwand von vWF -deficie beobachtetnt-Mäuse (ergänzende Video 3) im Vergleich zu Haft in WT-Mäusen (Figur 6). Das Fehlen von VWF verringert die Fähigkeit von S. aureus in den aktivierten Gefäßwand haftet. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig1.jpg" /> Figur 1 Eine schematische Darstellung der in-vitro-Strömungsmodells. Die in vitro-Flussmodell ist ein multifunktionales Modell, das die Untersuchung von verschiedenen Scher abhängige Mechanismen ermöglicht, wie die bakterielle Adhäsion an der subendothelialen Matrix, sondern auch die Thrombusbildung. Der Mikro parallelen Strömungskammer auf einem Deckglas (Kunststoff oder Glas) mit unterschiedlichen Beschichtungen von Proteinen und Endothelzellen gegeben. Die Adhäsion von verschiedenen Bakterien (orange und graue Punkte) können analysiert werden, und die Auswirkungen der Gegenwart von Plasmaproteinen, Blutplättchen und Vollblut bewertet werden. Fluoreszenzmarker für Thrombozyten (blaue Ovale) oder fibrinogen (blau strings) kann in Kombination mit verschiedenen Inhibitoren (black Ovale) zur Behandlung bakterieller und Wirtsfaktoren unterscheiden. Repräsentative Bilder der bakteriellen Adhäsion von S. aureus, Kollagen Beschichtung in Gegenwart (unten) oder Abwesenheit (oben) von VWF gezeigt (Maßstab ist 100 &amp; mgr; m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die Haftung von S. aureus an VWF steigt mit zunehmenden Scherraten. Micro-parallelen Strömungskammer durch Perfusion über die beschichtete VWF (50 ug / ml) mit fluoreszenzmarkierten S. aureus Newman bei Scherraten von 250 bis 2000 s -1 (sec -1) in Medium (n&gt; 5). Alle Ergebnisse sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. * P &lt;0,05, ** p &lt;0,01. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig3.jpg" /> Abbildung 3. Die Haftung von S. aureus an Subendothel ist Scherung und VWF abhängig. Micro-parallelen Strömungskammer durch Perfusion über die beschichtete Kollagen (160 &amp; mgr; g / ml) mit fluoreszenzmarkierten S. aureus Newman bei Scherraten von 250 bis 2000 sec -1 in Medium (n&gt; 5). VWF (60 ug / ml) wurde in dem Medium vorhanden sind angegeben. Alle Ergebnisse sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. ** P &lt;0,01. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig4.jpg" /> Abbildung 4. Haftung von S. aureus an aktivierte Endothelzellen scherabhängig. Micro-parallelen Strömungskammer durch Perfusion über die Endothelzellen. (A) Menschliche Nabelvenen-Endothelzellen wurden mit dem Ca 2+ -ionophore A aktiviert23187 (0,1 mM), gefolgt von einer 10-minütigen Perfusion von fluoreszierend markierten S. aureus Newman bei Scherraten von 500 bis 2000 sec -1 in Medium (n&gt; 5). Alle Ergebnisse sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. * P &lt;0,05. (B) Bild von Mikro-Durchflusskammer parallel Perfusion über aktivierten HUVECs mit S. aureus bei einer Schergeschwindigkeit von 1000 s -2. S. aureus bildet Saiten von ± 200 Mikrometer Länge, was die Haftung an VWF-Multimere (Maßstab ist 100 &amp; mgr; m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig5.jpg" /> Abbildung 5: Eine schematische Übersicht über die in vivo mesenterica Perfusionsmodell. Eine rechte Halsschlagader-Katheter (gelbe Linie) ist für die Verwaltung der Fluor eingesetztescently markierten Bakterien (orange dots), zusätzliche Anästhetika oder andere Komponenten, wie pharmazeutische Inhibitoren und Antikörper. Die Bauchhöhle wird geöffnet und das Mesenterium verteilt wird, um die Blutgefäße (Venen und Arterien) unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar zu machen. Nach pharmakologische Aktivierung des Endothels durch eine Ca 2+ -ionophore, die die Freisetzung von VWF induziert können Bakterien durch die Jugularvene Katheter injiziert werden. Echtzeit-intravaskulären Video-Mikroskopie ermöglicht es dem in vivo Visualisierung der zirkulierenden fluoreszenzmarkierten Bakterien und die daraus resultierende Bildung von Bakterien-Plättchenthromben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig6.jpg" /> Abbildung 6. Die Anfangshaftung von S. aureus. - / - Mäusen an aktiviertes Endothel in vivo wird durch VWF In vivo venösen mesenterica Perfusionsmodell mit C57BL / 6- Vwf + / + und C57BL / 6- Vwf vermittelt. Adhäsion von fluoreszierend markierten S. aureus an den Ort aktiviert Gefßwand ist deutlich niedriger in Vwf - / - Mäusen. Alle Ergebnisse sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. *** P &lt;0,001, n&gt; 7. <img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV1.jpg" /> Video 1: Echtzeit-Haftung von S. aureus aktiviert Gefäßwand in Vwf + / + Mäusen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video1JorienClaes.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.</a> Video 2: Echtzeit-Aggregatbildung und Embolisation von S. aureus in Vwf + / + Mäusen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video2JorienClaes.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.</a> <img alt="Video 3" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV3.jpg" /> Video 3: Echtzeit-Haftung von S. aureus aktiviert Gefäßwand in Vwf - / -. Mäusen in vivo mesenterica Perfusionsmodell mit Vwf + / + und vWF - / - Mäusen. Fünf ul einer Ca 2+ -ionophore (10 mM) war Anwened auf den Bereich des visualisierten Gefßbett. Eine Suspension von Carboxy-Fluorescein-markierten S. aureus wurde durch die Vena Katheter injiziert. Die mesenterialen Zirkulation wurde unter einem inversen Mikroskop sichtbar gemacht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video3JorienClaes.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.</a>

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In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In-vitro- und In-vivo-Modell, um die bakterielle Adhäsion an der Gefäßwand unter Strömungsbedingungen Studieren

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

in-vitro-vivo-model-to-study-bacterial-adhesion-to-vessel-wall-under

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

10.5K Aufrufe.  KU Leuven. To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion. 

Serie: In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

In-vitro-Assay der bakteriellen Adhäsion auf Mammalian Epithelzellen

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Einsatz von künstlichen Sputum Mittlere bis antibiotische Wirkung gegen die getestet<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; AGB in einen engeren Bezug zu den Mukoviszidose-Lunge

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Isolierung von humanen Nabelschnur-Endothelzellen und ihre Verwendung in der Studie von neutrophilen Transmigration unter Strömungsbedingungen

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell zur Heterogenität des menschlichen Makrophagen Differenzierung und Polarisierung Studieren

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood vessels resulting in vascular leak, the development of purpuric rashes and eventual tissue necrosis. Studying the pathogenesis of this infection was previously limited by the human specificity of the bacteria, which makes in vivo models difficult. In this protocol, we describe a humanized model for this infection in which human skin, containing dermal microvessels, is grafted onto immunocompromised mice. These vessels anastomose with the mouse circulation while maintaining their human characteristics. Once introduced into this model, N. meningitidis adhere exclusively to the human vessels, resulting in extensive vascular damage, inflammation and in some cases the development of purpuric rash. This protocol describes the grafting, infection and evaluation steps of this model in the context of N. meningitidis infection. The technique may be applied to numerous human specific pathogens that infect the blood stream.

Neisseria meningitidis is a human specific pathogen that infects blood vessels. In this protocol human microvessels are introduced into a mouse by grafting human skin onto immunocompromised mice. Bacteria adhere extensively to the human vessels, leading to vascular damage and development of the purpuric rash typically observed in human cases.

Humanisierten Maus-Modell, um bakterielle Infektionen Studieren Targeting der Mikrogefäß

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Ein Flow-Assay zur Haftung Leukozyten-Rekrutierung Human Lebersinus Endothel unter den Bedingungen der Schubspannung Studieren

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Test der Haftung unter Scherspannung für das Studium der T-Lymphozyten-Adhäsions-Molekül-Wechselwirkungen

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin acquisition at the bacterial cell surface plays in resistance to the host immune system. Flow cytometry experiments identified human plasma vitronectin as a ligand for the bacterial receptor outer membrane protein H of Haemophilus influenzae type f. An enzyme-linked immunosorbent assay was employed to characterize the protein-protein interactions between purified recombinant protein H and vitronectin, and binding affinity was assessed using bio-layer interferometry. The biological importance of the binding of vitronectin to protein H at the bacterial cell surface in evasion of the host immune response was confirmed using a serum resistance assay with normal and vitronectin-depleted human serum. The importance of vitronectin in bacterial adherence was analyzed using glass slides with and without vitronectin coating, followed by Gram staining. Finally, bacterial adhesion to human alveolar epithelial cell monolayers was investigated. The protocols described here can be easily adapted to the study of any bacterial species of interest.

This report describes protocols for characterizing interactions between bacterial outer membrane proteins and the human complement regulator vitronectin. The protocols can be used to study the binding reactions and biological function of vitronectin in any bacterial species.

Assays für die Untersuchung der Rolle von Vitronectin in bakterielle Adhäsion und Serum-Widerstand

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...