Wir danken Dr. Pina Colarusso und das Live Cell Imaging Facility für ihre Unterstützung bei der Bildgebung und Bildanalyse; Frau Lailey für ihre technische Hilfe; und Einheit 51 an den Ausläufern Hospital in Calgary, AB für die Bereitstellung von menschlichen Nabelschnur. Dr. KD Patel ist eine Alberta Innovates: Health Solutions Scientist. Diese Arbeit wurde durch einen Betriebskostenzuschuss von der kanadischen Institutes for Health Research und Ausrüstung und Infrastruktur Zuschüsse von der kanadischen Stiftung für Innovation und dem Alberta Behörde für Wissenschaft und Forschung unterstützt.

1. Isolierung und Erhaltung des menschlichen vaskulären Endothelzellen <ol><li> Biosafety Level 2 Verfahren müssen bei der Arbeit mit menschlichem Blut und Gewebe werden. Mit einer Schere durchschnitt die Nabelschnur aus der Plazenta und dann genau untersuchen Sie das Kabel für Blutgerinnsel und Schäden, die durch Spannen Sie das Kabel während der Geburt verursacht werden. Schneiden Sie und entsorgen Sie diese Teile des Rückenmarks. </li><li> Ansetzen Kollagenase-Lösung mit 1 mg / ml durch Gießen 50 ml warmem Kabel Puffer in einer Röhre, die 50 mg Collagenase enthält. </li><li> Ändern Sie in sterile Handschuhe und öffnen Sie ein Fach mit autoklavierten Instrument sterilisiert stumpfe Kanülen, Kabel Klemmen, Scheren, Drei-Wege-Hähne und Gaze in einer sterilen Werkbank. </li><li> Identifizieren Sie die zwei Arterien und Venen die einzigen in der Schnur. Die Arterien sind kleiner und sind in der Regel eng eingeschnürt, während die Vene ist groß und leicht zu kanülieren. Um das Blut aus der Vene zu spülen, schieben Sie eine Kanüle mit einem Zwei-Wege-Hahn befestigt, um es zu iNTO einem Ende der Vene und Stelle eine Klammer um Kanüle, um es fest in Position halten. Perfundieren Schnur Puffer durch die Vene. Wiederholen, bis Durchströmung ist klar und dann klemmen die Ende der Schnur. </li><li> Perfundieren Kollagenase in die Vene, den Absperrhahn schließen, legen Sie das Kabel in ein Becherglas mit warmen Schnur Puffer und Inkubation für 10 Minuten. Nach 10 Minuten, entfernen Sie das Netzkabel und sanft massieren Sie das Kabel an Endothelzellen aus dem Lumen der Vene lösen. Entleeren Sie die Lösung in das Röhrchen mit Endothelzellen Medien (ECM). Spülen Sie mit Kordel Puffer zweimal, um verbliebene Zellen zu entfernen. Entleeren Sie die Lösung in das gleiche Rohr. </li><li> Zentrifugation der Zellen bei 350 g für 10 Minuten zu Pellets der Endothelzellen. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und 10 ml ECM zu dem Pellet. Erythrozyten vorsichtig resuspendieren in ECM, dann übertragen Sie die Zellen, um eine T75-Flasche vorbeschichtet mit 0,2% Gelatine. Pre-Beschichtung mit Gelatine wurde für mindestens 1 Stunde bei 37 ° C durchgeführt Wachsen der Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Am nächsten Tag, sanft geschüttelt zwecks vertreiben keine roten Blutkörperchen entfernen Sie dann den Überstand und waschen mit physiologischer Kochsalzlösung warmen Hank-Lösung (HBSS). Entfernen Sie HBSS und füttern die Zellen mit 10 ml warmem ECM. Die Zellen werden unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die roten Blutkörperchen entfernt wurden. Bewerten Sie den Grad der Zusammenfluss und die Morphologie der Endothelzellen. Endothelzellen in diesem Stadium sollten ohne Anzeichen von Vakuolen verlängert werden. </li><li> Weiter, um die Medien ändern alle drei Tage, bis die Zellen Konfluenz, dann spalten Zellen unter Verwendung eines 0,08%-Lösung von Trypsin mit 1 mM EDTA zu erreichen. Platte Endothelzellen in gewünschten Gerichte mit 0,2% Gelatine vorbeschichtet. Die Zellen sollten Einmündung in 3-6 Tagen erreichen. </li><li> Bei der Verwendung ibidi Kammern, Precoat-jede Kammer mit 0,2% Gelatine. Entfernen Sie das überschüssige Gelatine und Fibronektin und fügen Sie dann 1,5 x 10 6 / ml von Endothelzellen in ECM in die Kammer ausgesetzt. Ändern Sie die Medien jeden zweiten Tag bis confluent. Die Zellen sollten in 2-3 Tagen, je nach Kabel konfluent. </li></ol> 2. Vorbereitung von Neutrophilen <ol><li> Neutrophile wurden aus dem peripheren Blut von gesunden Freiwilligen mittels Dichte-Zentrifugation isoliert. Ein detailliertes Protokoll mit einer visuellen Demonstration für neutrophilen Isolation kann in der früheren Ausgabe dieser Zeitschrift 6 zu finden. Einmal isoliert, resuspendieren Neutrophilen bei einer Konzentration von 1x10 6 / ml in HBSS, enthaltend 0,5% Humanalbumin. </li></ol> 3. Einrichten des ibidi Kammer <ol><li> Wachsen Endothelzellen in einer Gelatine-beschichteten ibidi Kammer. Untersuchen sie jeden Tag mit Phasenkontrast-Mikroskopie, bis sie dicht konfluent geworden. </li><li> Stimulieren die Endothelzellen die Expression von Adhäsionsmolekülen und Aktivierung Moleküle erhöhen. Für die Zwecke dieses Protokolls wurden Endothelzellen mit 10 ng / ml rekombinantem TNF-α für vier Stunden bei 37 ° C stimuliert und 5% CO <sub&gt; 2 vor der Einrichtung des ibidi Kammer für die Bildgebung unter Strömungsbedingungen. </li><li> Bereiten Sie das Mikroskop, und Spritzenpumpe als visuell durch Wiese und seine Kollegen 11 beschrieben, mit einem leeren ibidi Kammer. </li><li> Die wichtigsten Unterschiede zwischen diesem Protokoll und die Wiese Verfahrens gehören Vorfüllen des Schlauchs, um die Exposition der Endothelzellen in die Luft zu verhindern, die Aufrechterhaltung der Puffer bei 37 ° C unter Verwendung eines Wasserbades mit PharMed-Schlauch, um den Puffer vor dem Verlust Temperatur zu halten und mit verschiedenen Ziele auf dem Mikroskop je nachdem, ob Bildgebung mit Phasenkontrast oder Fluoreszenz. </li><li> Sobald das Mikroskop ist eingerichtet und der Schlauch wird mit HBSS, schließen Sie alle Hähne gefüllt und die leere Kammer ibidi. </li><li> Verbinden der Kammer mit ibidi TNF-α stimulierte Endothelzellen an das Rohr. </li></ol> 4. Rekrutierung von Neutrophilen und Transmigration <ol><li> Visualisieren Sie die Endothelzell-Monolayer im Mikroskopope mit einem 10x-Phasenkontrast Ziel. </li><li> Stellen Sie die Spritzenpumpe beginnt, sich zurückzuziehen und den Fluss von HBSS bei der gewünschten Scherspannung (typischerweise zwischen 0,5 und 2 dyn / cm 2). </li><li> Auf der Eingangsseite, Schalter aus HBSS zu isolierten neutrophilen Granulozyten (1x10 6 / ml) durch Drehen des Drei-Wege-Hahn. </li><li> Beginnen Aufnahme über eine CCD-Kamera entweder mit einem DVD-Recorder oder direkt an den Computer angeschlossen ist. Starten Sie den Timer, wenn Neutrophilen die Kammer eintreten. Perfundieren Neutrophilen für vier Minuten. Insgesamt 3 ml des Neutrophilensuspension genügt einem einzigen Experiment. </li><li> Nach vier Minuten wechseln Sie wieder in HBSS, um die Anlage von neuen Neutrophilen zu verhindern. Wenn Daten zur gesamten Interaktionen, Rollen und feste Haftung gewünscht werden, mit Bild 6 zufällige Felder für jeweils 10 Sekunden einen 10x Phasenkontrast-Objektiv zwischen 4 und 5 Minuten. </li><li> Wechseln Sie zu einem 40x-Objektiv und Aufzeichnung einer einzigen Sichtfeld zwischen 5 und 10 Minuten. In 10 Minuten, sammelnzwischen 5 und 10 zufällig Sehfelder. </li><li> Stoppen Sie den Durchfluss-und an die nächste Kammer. </li></ol> 5. Fluoreszenz-Imaging unter Flussbedingungen Mit einem ibidi Kammer <ol><li> Etikett entweder Endothelzellen oder Neutrophilen mit einer fluoreszierenden Sonde von Interesse. Zum Beispiel kann ein Anti-VE-Cadherin-Antikörper, konjugiert an Alexa-[547] verwendet werden, um Endothelzellverbindungen visualisieren. </li><li> Montieren ibidi Kammer auf einem Mikroskop mit Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) und fluoreszierende Fähigkeiten. Wir verwenden eine FluoView 1000 konfokalen (Olympus) mit einer Klimakammer. Konzentrieren Sie mit einem Ziel für DIC und Fluoreszenz-Arbeit entwickelt. </li><li> Erwerben gleichzeitige DIC und Fluoreszenz-Bilder mit einer Software von Lieferanten geliefert, während nach den zeitlichen Verlauf in Abschnitt 4 beschrieben. </li></ol> 6. Die Analyse der Rekrutierung von Neutrophilen <ol><li> Analyse von Wälz-und interagierenden Zellen wird von Wiese et al 11 beschrieben. </li&gt; <li> Um den Prozentsatz der Neutrophilen Rollen auf der Endothelzellen zählen die Anzahl von Neutrophilen, die mehr als eine Zelle bewegt haben Durchmesser in einem Zeitraum von 5 Sekunden zu messen. Teilen Sie diese Zahl durch die Gesamtzahl der Leukozyten im Bereich um den Prozentsatz der rollenden Zellen zu bestimmen. Durch die Erweiterung, werden die restlichen Zellen als fest haftend. </li><li> Messen Sie die Walzgeschwindigkeit von Neutrophilen durch Berechnung des Abstands der Neutrophilen in einer bestimmten Zeitperiode reist und dann geteilt durch diese Zeit in Sekunden. </li><li> Transmigration durch Zählen der Anzahl von Neutrophilen, die ihre Form verändert haben und migriert unterhalb der Monoschicht 10 bestimmt. Diese Neutrophilen werden durch die Tatsache, dass sie andere als helle Phase ändern identifiziert werden, wenn auf der Oberseite der Monoschicht zum Sein Phase dunkel, wenn unterhalb der Monoschicht 10. Die Anzahl der Zellen transmigrierten kann als Prozentsatz der gesamten Zellen in der Blickfeld oder als Ausgangsmaterial ausgedrückt werden betäubtER von transmigrierten Zellen pro Flächeneinheit. In diesem Modellsystem, in der Regel 50% der Neutrophilen nach 10 Minuten transmigrieren. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Unstimulierten Endothelzellen unterstützen keine Rekrutierung von Neutrophilen. Im Gegensatz dazu stimulieren Endothelzellen mit TNF-α führt zu neutrophilen Rollen, feste Adhäsion und. Ein Beispiel für diese Daten ist in den 1 und 2 gezeigt. 1A zeigt Neutrophilen Interaktion mit TNF-α-stimulierte Endothelzellen hemmt. Diese Wechselwirkungen können quantifiziert werden, offenbart die Gesamtzahl der Neutrophilen die Interaktion mit den Endothelzellen sowie die Zahl der Neutrophilen Walzgut, fest haftende oder transmigrierten (Abbildung 2). Neutrophile Transmigration kann bei Zellverbindungen oder durch die Endothelzellen selbst auftreten. Um zwischen diesen zwei Bedingungen zu unterscheiden, werden endotheliale Zellen mit einem Anti-VE-c gekennzeichnet<html> adherin Antikörper und Transmigration wird als vorkommenden paracellularly oder transzellulär (Abbildung 1B und C) erzielt. In diesem Modell ist praktisch alles parazellulären Transmigration 7. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4032/4032fig1.jpg" /> Abbildung 1. Gleichzeitige DIC und Fluoreszenz-Imaging unter Flussbedingungen mit einem ibidi Kammer. (A) DIC Bild frisch Humanneutrophilen Migration auf menschliche Nabelschnur-Endothelzellen isoliert. Der gelbe Pfeil zeigt eine haftende Neutrophilen, die weiße Pfeilspitze zeigt eine transmigrierende Neutrophilen. (B) Endothelzellverbindungen wurden mit einem anti-VE-Cadherin-Antikörper, konjugiert an Alexa-[547] und abgebildet gefärbt. (C) zeigt Überlagerung von Kanal A und B aufschlussreich, dass praktisch alle transmigrierende in diesem Modell parazellulären ist. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4032/4032fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . _content &quot;&gt; <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4032/4032fig2.jpg" /> 2. Endothelzellen wurden links unstimuliert oder mit 10 ng / ml TNF-α stimuliert. Nach 4 Stunden wurde eine parallele Platte Strömungskammer montiert und Neutrophile wurden hinüber zu 1 dyn / cm 2 perfundiert. (A) Neutrophilen-Interaktionen untersucht und gemessen mit ImageJ Software von NIH. Die Summe der interagierenden Zellen wurden als (b) Walz, fest haftende oder (C) transmigrierende gekennzeichnet. Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± SEM von 3 bis 5 Experimenten. Der Unterschied zwischen Kontroll-und TNF in Abb. A und C war signifikant (p &lt;0,001).

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	<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).</li><li>Diacovo, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+rolling,+arrest,+and+transmigration+across+activated,+surface-adherent+platelets+via+sequential+action+of+P-selectin+and+the+beta+2-integrin+CD11b/CD18.">Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18.</a> Blood. 88, 146-157 (1996).</li><li>Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eosinophil+adhesion+under+flow+conditions+activates+mechanosensitive+signaling+pathways+in+human+endothelial+cells.">Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells.</a> J. Exp. Med. 202, 865-876 (2005).</li><li>Massia, S. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+endothelial+cell+interactions+with+surface-coupled+adhesion+peptides+on+a+nonadhesive+glass+substrate+and+two+polymeric+biomaterials.">Human endothelial cell interactions with surface-coupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials.</a> J. Biomed. Mat. Res. 25, 223-242 (1991).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

<html> Forscher haben routinemäßig Endothelzellen aus verschiedenen Gefäßbetten zur Rekrutierung von Neutrophilen und Seelenwanderung zu studieren. Beispiele umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, dermale mikrovaskuläre Endothelzellen 12, Leber sinusoidalen Endothelzellen 13 und Endothelzellen aus menschlichen Nabelvene 10 begrenzt. Unter ihnen HUVEC gewonnen großer Beliebtheit wegen ihrer relativen Einfachheit der Isolation und Verfügbarkeit. HUVEC sind eine starke In-vitr...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenzien und Geräte </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Collagenase Typ 1 </td><td> Worthington </td><td> 4197 </td><td></td></tr><tr><td> Cord-Puffer </td><td></td><td></td><td> Zusammensetzung: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-Glucose in 1 mM NaH 2 PO 4 / Na 2 HPO 4-Puffer bei pH 7,4 </td></tr><tr><td> Endothelial Cell Medien (ECM) </td><td></td><td></td><td> M199 mit Adler-Salzen mit 16% Humanserum mit 100 Einheiten Penicillin 100 ug Streptomycin und 0,3 mg L-glutamine/ml ergänzt </td></tr><tr><td> M199 </td><td> GIBCO </td><td> 31100-035 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin Streptomycin Glutamat (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 10378-016 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Ibidi Kammern </td><td> Ibidi </td><td> 80606 </td><td></td></tr><tr><td> TNF-α </td><td> Prepro Tech </td><td> 300-01A </td><td></td></tr><tr><td> Human Albumin 20% ige Lösung </td><td> Zwillinge Bioproducts </td><td> 800120050 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS ohne Ca 2 + und Mg 2 + </td><td> Sigma </td><td> H2487-10X </td><td></td></tr><tr><td> HBSS mit Ca 2 + und Mg 2 + </td><td> Sigma </td><td> H1387-10X </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions

Neutrophile sind die am häufigsten vorkommende Art von weißen Blutkörperchen. Sie bilden einen wesentlichen Teil des angeborenen Immunsystems ein. Während der akuten Entzündung, Neutrophile sind die ersten Entzündungszellen an der Stelle der Verletzung zu migrieren. Rekrutierung von Neutrophilen an eine verletzte Stelle ist ein schrittweiser Prozess, der erste, Erweiterung der Blutgefäße, um den Blutfluss zu erhöhen beinhaltet, zweitens mikrovaskulären strukturellen Veränderungen und die Flucht von Plasmaproteinen aus der Blutbahn, drittens, Walzgut, Adhäsion und Transmigration der neutrophilen Granulozyten über die Endothel, und eine vierte Akkumulation von Neutrophilen an der Stelle der Verletzung 2,3. Eine Vielzahl von in vivo und in vitro-Methoden entwickelt hat, das Studium dieser Prozesse 4 ermöglichen. Diese Methode konzentriert sich auf die Transmigration neutrophiler über menschliche Endothelzellen. Eine beliebte Methode zur Untersuchung der molekularen Vorgänge in neutrophilen Transmigration beteiligt nutzt menschliche neutrophils Interaktion mit primären humanen Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) 5. Neutrophile isoliert wurde optisch an anderer Stelle 6 beschrieben, so wird dieser Artikel die Methode zur Isolierung von HUVEC zeigen. Wenn sie einmal isoliert und bis zur Konfluenz werden die aktivierten Endothelzellen, was zur Hochregulierung von Adhäsion und Aktivierung Moleküle. Zum Beispiel, Aktivierung von Endothelzellen mit Cytokinen wie TNF-α zu einer erhöhten E-Selectin und IL-8-Expression 7. E-Selektin vermittelt Abscheidung und-rollen von Neutrophilen und IL-8 vermittelt die Aktivierung und feste Adhäsion von Neutrophilen. Nach Adhäsion Neutrophilen transmigrieren. Transmigration kann paracellularly auftreten (durch Endothelzellverbindungen) oder transzellulär (durch die Endothelzellen selbst). In den meisten Fällen treten diese Wechselwirkungen unter Strömungsverhältnisse im Gefäßsystem 7,8 gefunden. Die parallele Platte Flusskammer ist ein weit verbreitetes System, dass miMikrofone der hydrodynamische Schubspannungen in vivo gefunden und die Untersuchung der Rekrutierung von Neutrophilen unter Strömungsbedingungen in vitro 9,10. Mehrere Unternehmen produzieren parallele Platte Strömungskammern und haben jeweils Vor-und Nachteile. Wenn Fluoreszenz-Bildgebung erforderlich ist, muss Glas oder einem optisch ähnlichen Polymer verwendet werden. Endothelzellen nicht so wachsen wie auf Glas. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und schnelle Methode zur Phasenkontrast-, DIC-und Fluoreszenz-Imaging von neutrophilen Transmigration mit einem geringen Volumen ibidi Kanal Rutsche aus einem Polymer, dass die rasche Adhäsion und das Wachstum von humanen Endothelzellen unterstützt und verfügt über optische Eigenschaften, die vergleichbar sind gemacht Glas. Bei diesem Verfahren wurden Endothelzellen wachsen und stimuliert einen ibidi μslide. Neutrophile wurden unter Strömungsbedingungen eingeführt und Transmigration beurteilt. Fluoreszenz-Imaging der Übergänge ein Echtzeit-Bestimmung des Ausmaßes der parazellulären gegenübertranszellulären Seelenwanderung.

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Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Dieser Artikel beschreibt zunächst ein Verfahren zur Isolierung von humanen Endothelzellen aus Nabelschnur-Venen und zeigt dann, wie man diese Zellen verwenden, um Transmigration neutrophiler unter Strömungsbedingungen zu untersuchen. Durch die Verwendung eines geringen Mengen Strömungskammer aus einem Polymer mit den optischen Eigenschaften des Glases hergestellt ist, ist in lebenden Zellen Fluoreszenz-Bildgebung von seltenen Zellpopulationen möglich.

Isolierung von humanen Nabelschnur-Endothelzellen und ihre Verwendung in der Studie von neutrophilen Transmigration unter Strömungsbedingungen

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.0K Aufrufe.  University of Calgary. Dieser Artikel beschreibt zunächst ein Verfahren zur Isolierung von humanen Endothelzellen aus Nabelschnur-Venen und zeigt dann, wie man diese Zellen verwenden, um Transmigration neutrophiler unter Strömungsbedingungen zu untersuchen. Durch die Verwendung eines geringen Mengen Strömungskammer aus einem Polymer mit den optischen Eigenschaften des Glases hergestellt ist, ist in lebenden Zellen Fluoreszenz-Bildgebung von seltenen Zellpopulationen möglich.

Serie: Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Ein Flow-Assay zur Haftung Leukozyten-Rekrutierung Human Lebersinus Endothel unter den Bedingungen der Schubspannung Studieren

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

Humanen neutrophilen Flusskammer Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

Echtzeit-Bildgebung von Zell-Zell-Endothelial Junctions Während Neutrophile Transmigration unter physiologischen Fluss

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In-vitro- und In-vivo-Modell, um die bakterielle Adhäsion an der Gefäßwand unter Strömungsbedingungen Studieren

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

Die Verwendung von Durchflusszytometrie, um den Zustand von Chromatin in T-Zellen bewerten

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolation und In-vitro- Kultur von murinen und menschlichen alveoläre Makrophagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

Gleichzeitige Untersuchung der Rekrutierung von Monocyte Subpopulationen unter Strömung In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Vorbereitung des ganzen Knochenmarks für die Mass Cytometry Analyse von Neutrophilen-Linienzellen

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...