Die Autoren danken Prof. Thomas Reiner, Dr. Jacob Houghton, und Dr. Serge Lyaschenko für hilfreiche Gespräche.

Alle beschriebenen In-vivo-Tierversuchen wurden nach einer genehmigten Protokoll und unter den ethischen Richtlinien des Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) durchgeführt. 1. Konjugation von DFO-NCS bis J591 <ol><li> In einem 1,7 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, bereiten eine 2-5 mg / ml-Lösung von J591 in 1 ml von entweder 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4) oder 0,5 M HEPES-Puffer (pH 7,4). </li><li> Löse DFO-NCS in trockenem DMSO in einer Konzentration zwischen 5-10 mM (3,8 bis 7,6 mg / ml). Mit Ultraschall oder Wirbel die Lösung sorgfältig durch, um eine vollständige Auflösung zu erleichtern. </li><li> Den pH-Wert der Lösung auf 8,8-9,0 J591 durch Zugabe kleiner Aliquots (&lt;10 &amp; mgr; l) von 0,1 M Na 2 CO 3. </li><li> Nachdem die Antikörperlösung in der richtigen pH, einen Volumen des DFO-NCS-Lösung entsprechend einem 3-4-fachen molaren Überschuß des bifunktionellen Chelators. <ol><li> Zur Prüfungweise hinzuzufügen 4-5 ul einer 10 mM (7,6 mg / ml) DFO-NCS-Lösung (40,4 nmol DFO-NCS) zu 1 ml einer 2 mg / ml J591 Körperlösung (13,3 nmol J591). Die Menge an DMSO im fertigen wäßrigen Reaktionsmischung sollte 2% v / v nicht übersteigen. </li></ol></li><li> Inkubieren der Reaktion für 30 Minuten bei 37 ° C auf einem Heizblock Rühren bei 350 Upm. </li><li> Nach 1 h bei 37 ° C, Reinigen des resultierenden Immunkonjugat mit einem vorverpackten Einweg Grßenausschluß Entsalzungssäule mit einer 50.000 Molekulargewicht-Cut-off unter Verwendung von 0,5 M HEPES-Puffer (pH 7,4) als Elutionsmittel. Mit diesem Schritt wird eine 2 ml Lösung des fertigen J591-DFO Konstrukt ergeben. </li><li> Messung der Konzentration des J591-DFO Konstrukt auf einem UV-Vis-Spektrophotometers. </li><li> Wenn eine höhere Konzentration des Konstrukts gewünscht wird, konzentrieren die J591-DFO Lösung unter Verwendung einer Zentrifugalfiltereinheit mit einer 50.000 Molekulargewicht-Cut-off. </li><li> Bewahren Sie die Lösung des fertigen J591-DFO Immunkonjugat bei -20 ° C im Dunkeln. </ol> 2. Radiomarkierung J591-DFO mit 89 Zr VORSICHT: Dieser Schritt des Protokolls umfaßt die Handhabung und Manipulation von Radioaktivität. Vor der Durchführung dieser Schritte oder bei anderen Arbeiten mit Radioaktivität Forscher sollten mit Strahlenschutzabteilung ihrer Heimateinrichtung konsultieren. Alle möglichen Schritte unternommen werden sollten, um die Exposition gegenüber ionisierender Strahlung zu minimieren. HINWEIS: Im Interesse einer ordnungsgemäßen radiochemische Hinweis Haltung, sollte die Menge an Radioaktivität in der Probe unter Verwendung einer Dosiskalibrator gemessen und aufgezeichnet werden vor und nach den Schritten von 2,2 bis 2,13 in der folgenden Protokoll. Dies wird mit der genauen Bestimmung der radiochemischen Ausbeuten und spezifischen Aktivitäten zu helfen. <ol><li> Es wird eine Lösung von 0,5-2,0 mg J591-DFO in 200 ul 0,5 M HEPES-Puffer, pH 7,5. </li><li> Pipettieren Volumen des &lt;sup&gt; 89 Zr 4+ Stammlösung (in der Regel in 1,0 M Oxalsäure im Lieferumfang enthalten), entsprechend 1,0 bis 6,0 mCi (37-222 MBq) in ein 2-ml-Plastik Schraubverschluss Reaktionsgefäß. Stellen Sie die Lautstärke dieser Lösung auf insgesamt 300 ul mit 1,0 M Oxalsäure. </li><li> Den pH-Wert des 89 Zr 4+ Lösung auf 6,8-7,5 unter Verwendung von 1,0 M Na 2 CO 3. Beginnen durch Zugabe von 250 ul 1,0 M Na 2 CO 3 zu dem 89 Zr 4+ Lösung und anschließend Hinzufügen kleiner (&lt;10 ul) Aliquots von Base, um den gewünschten pH zu erreichen. </li><li> Fügen Sie die gewünschte Menge des pH-eingestellten 89 Zr 4+ Lösung der J591-DFO-Lösung in Schritt 2.1 vorbereitet. </li><li> Der pH-Wert des Radiomarkierungsreaktionsgemisch zu gewährleisten, dass sie innerhalb des gewünschten Bereichs von 6,8-7,5 fällt. </li><li> Inkubieren der Radiomarkierungsreaktion 60 Minuten lang bei RT auf einer Rührwerkskugelmühle Heizblock bei 350 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Nach 60 min Inkubation, messen Sie den radiolabeling Ausbeute der Reaktion mit radio TLC. <ol><li> Hierzu Spot 1 uCi Radiomarkierungsreaktionsmischung auf einem Kieselsäure-TLC imprägnierten Streifen. Lassen Sie den aliquoten trocknen, führen Sie den TLC unter Verwendung eines Elutionsmittels von 50 mM DTPA (pH 5,5) und analysieren die TLC Streifen mit Hilfe eines Radio-TLC-Scanner. 89 Zr 4+ mit dem J591-DFO Konstrukt gebunden wird am Ursprung angezeigt (R f &lt;0.1), während die freien 89 Zr 4+ Kationen werden von DTPA Chelat werden und wird mit der Lösungsmittelfront (Rf eluieren&gt; 0,9). </li><li> Berechnen der Radiomarkierungsausbeute der Reaktion durch Integrieren des Radiochromatogramm, indem die Fläche unter der Kurve von R f 0,0-0,1 durch die gesamte Fläche unter der Kurve, multipliziert mit 100. </li></ol></li><li> Wenn die Radiomarkierungsausbeute ausreicht (typischerweise eine theoretische spezifische Aktivität von&gt; 2 mCi / mg) Die Reaktion wird mit 5 ul 50 mM DTPA, pH 5,5. </li><li> Man reinige den resultierenden Immunkonjugat using eine vorverpackte Einweg Grßenausschluß Entsalzungssäule mit einer 50.000 Molekulargewicht-Cut-off unter Verwendung eines Elutionsmittels von entweder 0,9% sterile Kochsalzlösung mit 5 mg / ml Gentisinsäure oder 0,25 M Natriumacetat (pH 5,5) mit 5 mg / ml Gentisinsäure . Mit diesem Schritt wird eine 2 ml Lösung des fertigen 89 Zr-DFO-J591 Radioimmunkonjugats ergeben. </li><li> Nach der Reinigung, überprüfen Sie die radiochemische Reinheit der 89 Zr-DFO-J591 mit Radio-TLC wie in Schritt 2.7 beschrieben. </li><li> Berechnen der Gesamtradiomarkierungsausbeute der Reaktion durch Dividieren der Menge an Aktivität zu Beginn auf die Antikörperlösung durch die Menge an Radioaktivität mit dem gereinigten 89 Zr-DFO-J591 Radioimmunkonjugat getrennt zugegeben. </li><li> Berechnen Sie die endgültige spezifische Aktivität durch Dividieren der Menge an Aktivität mit dem gereinigten 89 Zr-DFO-J591 Radioimmunkonjugat isoliert von der Ausgangsmasse der DFO-J591 in der Radiomarkierungsreaktion. </li><li> Wenn eine höhere Konzentration gewünscht wird, konzentrieren the 89 Zr-DFO-J591 Lösung unter Verwendung einer Zentrifugalfiltereinheit mit einer 50.000 Molekulargewicht-Cut-off. HINWEIS: Die Gentisinsäure im letzten Reinigungsschritt verwendet wird, ein radioSchutz verwendet, um den Abbau des Antikörpers durch Radiolyse minimieren 46 Während die Speicherung des 89 Zr-DFO-J591 Radioimmunkonjugat für bis zu 48 Stunden bei 4 ° C. möglich ist, ist es nicht empfehlenswert. Wenn das Radioimmunkonjugat gespeichert werden soll, zu verwenden 0,25 M Natriumacetat (pH 5,5) mit 5 mg / ml Gentisinsäure als Pufferspeicher, um das Risiko von Hypochlorit-vermittelte Radiolyse minimieren. 47 </li></ol> 3. In-vivo-PET-Bildgebung mit 89 Zr-DFO-J591 ACHTUNG: Wie in Protocol Abschnitt 2 dieser Schritt des Protokolls umfaßt die Handhabung und Manipulation von Radioaktivität. Vor der Durchführung dieser Schritte Forscher sollten mit Strahlenschutzabteilung ihrer Heimateinrichtung konsultieren. Alle possible Schritte sollten unternommen werden, um die Exposition gegenüber ionisierender Strahlung zu minimieren. <ol><li> Bei männlichen athymischen Nacktmäusen subkutan Implantat 5 x 10 6 LNCaP-Prostatakrebszellen und lassen diese zu einem 100-150 mm 3 Xenograft (3-4 Wochen nach der Beimpfung) wachsen. 44 </li><li> Verdünne das 89 Zr-DFO-J591 Radioimmunkonjugat auf eine Konzentration von 1,0 mCi / ml in 0,9% steriler Kochsalzlösung. </li><li> Injizieren 200 ul des 89 Zr-DFO-J591-Lösung (200 &amp; mgr; Ci; 7.4 MBq). In die laterale Schwanzvene der Xenotransplantat-tragenden Mäusen 48 </li><li> Bei der gewünschten Abbildungs ​​Zeitpunkt (zB 12, 24, 48, 72, 96 oder 120 h post-Injektion), betäuben die Maus mit einer 2% Isofluran: Sauerstoff-Gasgemisch. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf dem Bett des Kleintier-PET-Scanner, und Aufrechterhaltung einer Narkose bei der Untersuchung mit einem 1% Isofluran: Sauerstoff-Gasgemisch. Vor Inbetriebnahme des Tieres auf das Scanner-Bett, überprüfen Anästhesie mit dem Zehe-Pinch-Methode und apply Augensalbe für die Augen der Maus, um das Trocknen während einer Narkose zu verhindern. 49 </li><li> Erwerben die PET-Daten für die Maus über einen statischen Abtastung mit einem Minimum von 40 Millionen koinzident Ereignisse unter Verwendung eines Energiefensters 350-700 keV und eine Koinzidenzzeitfenster von 6 nsec. 50 </li><li> Nach Abschluss der Akquisition des Bildes, darf die Maus nicht unbeaufsichtigt zu lassen, und stellen Sie sie nicht in einem Käfig mit anderen Mäusen, bis sie wieder zu sich kam. </li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Während die Konstruktion, radioaktive Markierung, und Abbildung 89 Zr-DFO-beschriftet Radioimmunkonjugate ist in der Regel ein ziemlich einfaches Verfahren, ist es wichtig, ein paar wichtige Überlegungen bei jedem Schritt des Prozesses zu halten. Beispielsweise, wenn die wahrscheinlichste Ursache für Bedenken während der Konjugation Schritt der Prozedur ist die Aggregation des Antikörpers während der Konjugationsreaktion. Dieses Problem ist häufig ein Produkt von schlechter Vermischung der Konjugations...

Aufgrund ihrer bemerkenswerten Empfindlichkeit, Affinität und Selektivität wurden Antikörper langem als vielversprechende Vektoren für die Abgabe von Radioisotopen an Tumorzellen. Jedoch wurde ihre Anwendung in der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) durch das Fehlen eines geeigneten Positronen emittierende Radioisotope für die Etikettierung behindert. 1-3 Einer der kritischsten Aspekte bei der Konzeption der Radioimmunkonjugate wird passend zum physikalischen Zerfall Halb Zeit des Radioisotops für die in vivo Pharmakokinetik des Antikörpers. Genauer gesagt wurden Antikörper oft relativ lang, mehrtägigen biologischen Halbwertszeit und müssen daher mit Radioisotopen mit vergleichbaren physikalischen Halbwertszeit gekennzeichnet sein. Für PET-Imaging-Anwendungen, haben Antikörper traditionell mit radioaktiv markiertem 64 Cu (t 1/2 = 12,7 h), 86 Y (t 1/2 = 14,7 Stunden) oder 124 I (t 1/2 = 4,18 d). 4, 5 jedoch jedediese Radioisotope besitzt erhebliche Einschränkungen, die ihre Eignung für die klinische Bildgebung behindern. Während Radioimmunkonjugate mit 86 Y und 64 Cu beschriftet sind vielversprechend in präklinischen Untersuchungen nachgewiesen, beide Isotope besitzen physikalische Halbwertszeiten, die zu kurz, um effektiv für die Bildgebung beim Menschen sind. 124 I hingegen hat eine nahezu ideale physikalische Halbwertszeit für Bildgebung mit Antikörpern, aber es ist teuer und hat suboptimal Abklingeigenschaften, die relativ geringe Auflösung klinischen Bildern führen. Ferner können 124 I-markiertem Radioimmunkonjugaten Subjekt in vivo Dehalogenierung, ein Verfahren, das Tumor-zu-Hintergrund-Aktivitätsverhältnisse senken kann. 6,7 Der Antrieb, ein Positronen emittierende Radioisotop zu 64 Cu, 86 Y ersetzen zu finden, und 124 I in Radioimmunkonjugate hat den jüngsten Anstieg der Forschung über 89 Zr-markierten Antikörpern angeheizt. 8-12 Ter Grund für die Einführung der 89 Zr ist einfach: das Radiometall besitzt nahezu idealen chemischen und physikalischen Eigenschaften für den Einsatz in diagnostischen PET Radioimmunkonjugate 13 89 Zr wird über die 89 Y (p, n) 89 Zr Reaktion auf ein Zyklotron mit einer produziert. im Handel erhältlich und 100% natürlich reichlich 89 Y Ziel. 14,15 Die Radiometall hat eine Positronen-Ausbeute von 23%, zerfällt mit einer Halbwertszeit von 78,4 Stunden und Positronen emittiert mit der relativ geringen Energie von 395,5 keV (Abbildung 1). 13,16,17 Es ist wichtig zu beachten, dass 89 Zr emittiert ebenfalls eine hohe Energie 909 keV γ-Strahl mit 99% Effizienz. Während dieser Emission nicht energetisch nicht mit den emittierten 511 keV Photonen, erfordert es zusätzliche Überlegung im Hinblick auf Transport, Handling und Dosimetrie. Trotz dieser Einschränkung, diese Zerfallseigenschaften letztlich bedeuten, dass 89 Zr hat nicht nur eine günstigere hAlf-Lebensdauer für die Bildgebung mit Antikörpern als 86 Y und 64 Cu kann aber auch erzeugen Bilder mit höherer Auflösung als 124 I, welche mit Positronen höheren Energien von 687 bis 975 keV und einer Anzahl von Photonen mit Energien innerhalb 100-150 keV emittiert die 511 keV Positronen erzeugt Photonen. 13. Darüber hinaus ist 89 Zr auch sicherer in der Handhabung und weniger teuer herzustellen und residualizes in Tumoren wirksamer als sein Gegenstück Radiojod. 18,19 Eine mögliche Einschränkung von 89 Zr ist, dass es keinen ein therapeutisches Isotopolog zB 86 Y (PET) vs. 90 Y (Therapie). Dies schließt die Konstruktion von chemisch identischen, Surrogat-Bildgebungsmittel, die als dosimetrische scouts für ihre therapeutischen Gegen eingesetzt werden können. Das heißt, Untersuchungen legen nahe, dass 89 Zr-markierten Antikörpern zu tun haben Potenzial als Bild Surrogate für 90 Y und 177 Lu-markierten Immunkonjugate.20,21 Vom chemischen Standpunkt aus als ein Metall der Gruppe IV, besteht 89 Zr als vier Kationen in wässriger Lösung. Die Zr 4+ Ion hoch geladenen, relativ groß (effektive Ionenradius = 0,84 Å), und kann als eine &quot;harte&quot; Kation klassifiziert werden. Als solches weist es eine Präferenz für die Liganden mit bis zu acht Fest anionische Sauerstoffdonatoren. Einfach die häufigste Chelator in 89 Zr-markierten Radioimmunkonjugate verwendete Desferrioxamin (DFO), ein Siderophor-abgeleitete, azyklische Chelator, die drei Hydroxamatgruppen. Der Ligand stabil koordiniert den Zr 4+ Kationen schnell und sauber bei RT bei biologisch relevanten pH-Werten, und das erhaltene Zr-DFO-Komplex bleibt stabil im Laufe mehrerer Tage in Kochsalzlösung, Blutserum und Vollblut. 22 Computational Studien stark darauf hin, dass DFO bildet einen sechsfach koordinierten Komplex mit Zr 4+ in dem das Metallzentrum an die Drei Neut koordiniertral und drei anionische Sauerstoffdonoren des Liganden sowie zwei exogene Wasserliganden (Abbildung 2). 23,24 Die in vivo Verhalten Radioimmunkonjugate Einsatz der 89 Zr-DFO Konjugation Gerüst war im Allgemeinen sehr gut. Jedoch in einigen Fällen, Bildgebung und Biodistribution akuten Studien erhöhten Aktivität in den Knochen von Mäusen mit 89 Zr-markierte Antikörper injiziert wird, Daten, die zeigt, dass die osteophiles 89 Zr 4+ Kation aus der Chelator in vivo freigesetzt und anschließend mineralisiert ergab in den Knochen. 25 Kürzlich, insbesondere Liganden eine Reihe von Untersuchungen über die Entwicklung von neuartigen 89 Zr 4+ Chelatoren mit acht Sauerstoffspender sind in der Literatur erschienen. 24,26,27 Dennoch derzeit DFO ist die am weitesten verbreiteten Chelator mit großem Abstand in 89 Zr-markierten Radioimmunkonjugate. Eine Vielzahl von unterschiedlichenBiokonjugation Strategien wurden angewendet, um den DFO Antikörper binden, einschließlich bioorthogonalen Click-Chemie, die Reaktion von thiolreaktiven DFO Konstrukte mit Cysteine ​​im Antikörper, und die Reaktion des aktivierten Esters tragenden DFO Konstrukte mit Lysinen in den Antikörper. 4,28- 30 leicht die häufigste Strategie jedoch ist die Verwendung von einem Isothiocyanat tragende Derivat von DFO, DFO-NCS (Abbildung 2). 22 Diese kommerziell verfügbaren bifunktionellen Chelator robust und zuverlässig stabile, kovalente Bindungen mit Thioharnstoff Lysine der Formen Antikörper (Abbildung 3). In den vergangenen Jahren wurde eine Vielzahl von 89 Zr-DFO-markierten Radioimmunkonjugaten in der Literatur berichtet worden. Präklinische Untersuchungen haben besonders reichlich gewesen, mit Antikörpern, die von der bekannteren Cetuximab, Bevacizumab und Trastuzumab mehr esoterischen Antikörper wie die CD105-Targeting-TRC105 und fPSA-Targeting 5A10. 30-36 In jüngerer Zeit sind eine geringe Anzahl von frühen Phase der klinischen Studien mit 89 Zr-DFO-markierte Antikörper in der Literatur aufgetaucht. Insbesondere Gruppen in den Niederlanden veröffentlichten Studien beschäftigt 89 Zr-DFO-CMAB U36, 89 Zr-DFO-Ibritumomab-Tiuxetan, und 89 Zr-DFO-Trastuzumab. 21,32,37 Darüber hinaus eine Reihe von weiteren klinischen Studien mit 89 Zr-markierten Radioimmunkonjugate sind derzeit im Gange, einschließlich Untersuchungen hier am Memorial Sloan Kettering Cancer Center mit dem PSMA-Targeting 89 Zr-DFO-J591 für Prostata-Krebs-Bildgebung und die HER2-Targeting 89 Zr-DFO-Trastuzumab bei Brustkrebs Bildgebung. 23, 30 Darüber hinaus, während radiomarkierten Antikörpern bleiben die häufigsten 89 Zr-markierte Radiopharmaka, die Radio auch zunehmend mit anderen Vektoren, einschließlich Peptide, Proteine ​​und Nanomaterialien eingesetzt. 38-43 </sup&gt; Die Modularität dieser 89 Zr-DFO Kennzeichnungsmethode ist eine enorme Bereicherung. Das Repertoire der Biomarker-Targeting-Antikörper ist immer größer, und das Interesse an der Durchführung in vivo PET-Bildgebung mit diesen Konstrukten legt kräftig zu. Als Ergebnis, glauben wir, dass die Entwicklung standardisierter Verfahren und Protokolle können Sie das Feld profitieren. Eine ausgezeichnete schriftliche Versuchsprotokoll für DFO-NCS Konjugation und 89 Zr Radiomarkierung wurde bereits von Vosjan veröffentlicht, et al. 22 Wir sind der Meinung, dass die visuelle Demonstration von dieser Arbeit bereitgestellt könnte weiter helfen Ermittler neue zu diesen Techniken. In dem Protokoll bei Seits wird die Prostata-spezifischen Membran-Antigen-Targeting-Antikörper J591 als Modellsystem verwendet, um zu veranschaulichen (1) die Biokonjugation des bifunktionellen Chelators DFO-Isothiocyanat an einen Antikörper, (2) die Radiosynthese und Reinigung des 89 Zr-DFO-mAb Radioimmunkonjugats,und (3) in vivo PET mit 89 Zr-DFO-mAb Radioimmunkonjugat in einem Mausmodell von Krebs. 23,44,45

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:183px;">Company</td>
			<td style="width:99px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:179px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">p-SCN-Bn-DFO</td>
			<td>Macrocyclics</td>
			<td>B-705</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">[89Zr]Zr-oxalate</td>
			<td>Various, including Perkin-Elmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Caution: Radioactive material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD-10 Desalting Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0851-01&#160;</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC805024</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silica Gel Impregnanted RadioTLC Paper</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>SGI0001</td>
			<td>Cut into strips 0.5 cm wide</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the bioconjugation and radiosynthesis of 89zr-dfo-labeled antibodies

Die außergewöhnliche Affinität, Spezifität und Selektivität der Antikörper machen sie außergewöhnlich attraktive Vektoren für den Tumor gerichtet PET-Radiopharmaka. Aufgrund ihrer mehrtägigen biologische Halbwertszeit muss Antikörper mit Positronen emittierende Radionuklide mit relativ langen physischen Verfall Halbwertszeiten zu kennzeichnen. Traditionell sind die Positronen emittierende Isotope 124 I (t 1/2 = 4,18 d), 86 Y (t 1/2 = 14,7 h) und 64 Cu (t 1/2 = 12,7 h) wurden verwendet, um Antikörper zu beschriften PET-Bildgebung. In jüngerer Zeit jedoch hat das Feld eine dramatische Zunahme in der Verwendung der Positronen emittierende Radiometall 89 Zr in Antikörper-basierten PET-Bildgebungsmittel beobachtet. 89 Zr ist ein nahezu ideales Radioisotop für die PET-Bildgebung mit Immunkonjugaten, da sie eine physikalische Halb besitzt -Leben (t 1/2 = 78,4 Stunden), die mit den in-vivo-Pharmakokinetik von Antikörpern kompatibel ist und gibt eine relativ niedrige energy Positronen, die Bilder mit hoher Auflösung produziert. Außerdem Antikörper können unkompliziert mit 89 Zr mit dem Siderophor abgeleitete Chelator Desferrioxamin (DFO) gekennzeichnet werden. Bei diesem Protokoll wird die Prostata-spezifische Membran-Antigen-Targeting-Antikörper J591 als Modellsystem verwendet, um zu veranschaulichen (1) die Biokonjugation des bifunktionellen Chelators DFO-Isothiocyanat an einen Antikörper, (2) die Radiosynthese und Reinigung eines 89 Zr- DFO-mAb Radioimmunkonjugat, und (3) in-vivo-PET mit einem 89 Zr-DFO-mAb Radioimmunkonjugat in einem Mausmodell von Krebs.

Der erste Schritt bei diesem Protokoll die Konjugation DFO-NCS an den Antikörper ist typischerweise ziemlich robust und zuverlässig. Im Allgemeinen kann die gereinigte Chelator modifizierten Immunkonjugat in&gt; 90% Ausbeute erhalten werden, und unter Verwendung von 3 Moläquivalenten DFO-NCS in der Anfangs Konjugationsreaktion wird eine Anpassungsgrad-Markierung der Chelatbildner von etwa 1,0-1,5 DFO zu erhalten / mAb. Die 89 Zr radioaktiven Markierung und Reinigungsschritte des Verfahrens sind ebenfalls e...

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The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described.

Die Biokonjugation und Radiosynthese<sup&gt; 89</sup&gt; Zr-DFO-markiertem Antikörper

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

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Anatomy and Physiology

Chemistry

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The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Fundamentals of Chemistry

SCIENTISTS IN ACTION

17.0K Aufrufe.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described. 

Serie: The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two dimensional (2D) structures. These technologies are mature, offer high precision and many of them can be implemented in a high-throughput manner. We leverage the advantages of planar lithography and combine them with self-folding methods1-20 wherein physical forces derived from surface tension or residual stress, are used to curve or fold planar structures into three dimensional (3D) structures. In doing so, we make it possible to mass produce precisely patterned static and reconfigurable particles that are challenging to synthesize.
In this paper, we detail visualized experimental protocols to create patterned particles, notably, (a) permanently bonded, hollow, polyhedra that self-assemble and self-seal due to the minimization of surface energy of liquefied hinges21-23 and (b) grippers that self-fold due to residual stress powered hinges24,25. The specific protocol described can be used to create particles with overall sizes ranging from the micrometer to the centimeter length scales. Further, arbitrary patterns can be defined on the surfaces of the particles of importance in colloidal science, electronics, optics and medicine. More generally, the concept of self-assembling mechanically rigid particles with self-sealing hinges is applicable, with some process modifications, to the creation of particles at even smaller, 100 nm length scales22, 26 and with a range of materials including metals21, semiconductors9 and polymers27. With respect to residual stress powered actuation of reconfigurable grasping devices, our specific protocol utilizes chromium hinges of relevance to devices with sizes ranging from 100 &mu;m to 2.5 mm. However, more generally, the concept of such tether-free residual stress powered actuation can be used with alternate high-stress materials such as heteroepitaxially deposited semiconductor films5,7 to possibly create even smaller nanoscale grasping devices.

We describe experimental details of the synthesis of patterned and reconfigurable particles from two dimensional (2D) precursors. This methodology can be used to create particles in a variety of shapes including polyhedra and grasping devices at length scales ranging from the micro to centimeter scale.

Origami Inspired Selbstorganisation von Patterned und Reconfigurable Particles

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Forschung

Chemie

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

Isolierung und chemische Charakterisierung von Lipid A von gramnegativen Bakterien

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox reactions. The Cu (I) complex of the peptide model of a Cu (I) binding metallochaperone protein, which includes the sequence MTCSGCSRPG (underlined is conserved), was determined in solution under inert conditions by NMR spectroscopy.
NMR is a widely accepted technique for the determination of solution structures of proteins and peptides. Due to difficulty in crystallization to provide single crystals suitable for X-ray crystallography, the NMR technique is extremely valuable, especially as it provides information on the solution state rather than the solid state. Herein we describe all steps that are required for full three-dimensional structure determinations by NMR. The protocol includes sample preparation in an NMR tube, 1D and 2D data collection and processing, peak assignment and integration, molecular mechanics calculations, and structure analysis. Importantly, the analysis was first conducted without any preset metal-ligand bonds, to assure a reliable structure determination in an unbiased manner.

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

The NMR-solution structure of a metallochaperone model peptide with Cu (I) was determined, and a detailed protocol from sample preparation and 1D and 2D data collection to a three-dimensional structure is described.

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

A High-throughput-compatible FRET-based Platform for Identification and Characterization of Botulinum Neurotoxin Light Chain Modulators

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and cleaves intracellular proteins that are essential for neurotransmitter release. BoNT is comprised of a heavy chain (HC), which mediates host cell binding and internalization, and a light chain (LC), which cleaves intracellular host proteins essential for acetylcholine release. While therapies that inhibit toxin binding/internalization have a small time window of administration, compounds that target intracellular LC activity have a much larger time window of administrations, particularly relevant given the extremely long half-life of the toxin. In recent years, small molecules have been heavily analyzed as potential LC inhibitors based on their increased cellular permeability relative to larger therapeutics (peptides, aptamers, etc.). Lead identification often involves high-throughput screening (HTS), where large libraries of small molecules are screened based on their ability to modulate therapeutic target function. Here we describe a FRET-based assay with a commercial BoNT/A LC substrate and recombinant LC that can be automated for HTS of potential BoNT inhibitors. Moreover, we describe a manual technique that can be used for follow-up secondary screening, or for comparing the potency of several candidate compounds.

The botulinum neurotoxin type A light chain (BoNT/A LC) is a metalloprotease that enters motor neurons, cleaves its substrate SNAP-25, and disrupts neurotransmission, thereby resulting in flaccid paralysis. Utilizing a high-throughput-compatible FRET-based assay, large libraries of small molecules can be screened for their impact on BoNT/A LC enzymatic activity.

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control self-assembly and mimicking this process in vitro will bring about major advances in the areas of materials science and nanotechnology. Among the available biological building blocks, peptides have several advantages as they present substantial diversity, their synthesis in large scale is straightforward, and they can easily be modified with biological and chemical entities1,2. Several classes of designed peptides such as cyclic peptides, amphiphile peptides and peptide-conjugates self-assemble into ordered structures in solution. Homoaromatic dipeptides, are a class of short self-assembled peptides that contain all the molecular information needed to form ordered structures such as nanotubes, spheres and fibrils3-8. A large variety of these peptides is commercially available.
This paper presents a procedure that leads to the formation of ordered structures by the self-assembly of homoaromatic peptides. The protocol requires only commercial reagents and basic laboratory equipment. In addition, the paper describes some of the methods available for the characterization of peptide-based assemblies. These methods include electron and atomic force microscopy and Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR). Moreover, the manuscript demonstrates the blending of peptides (coassembly) and the formation of a &#34;beads on a string&#34;-like structure by this process.9 The protocols presented here can be adapted to other classes of peptides or biological building blocks and can potentially lead to the discovery of new peptide-based structures and to better control of their assembly.

This paper describes the formation of highly ordered peptide-based structures by the spontaneous process of self-assembly. The method utilizes commercially available peptides and common lab equipment. This technique can be applied to a large variety of peptides and may lead to the discovery of new peptide-based assemblies.

Bildung geordneter Strukturen Biomolekulare durch die Selbstorganisation von kurzen Peptiden

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid phase by using combinatorial chemistry. One of the most well studied classes of peptidomimetics is peptoids. Peptoids are easy to synthesize and have been shown to be proteolysis-resistant and cell-permeable. Over the past decade, many useful protein ligands have been identified through screening of peptoid libraries. However, most of the ligands identified from peptoid libraries do not display high affinity, with rare exceptions. This may be due, in part, to the lack of chiral centers and conformational constraints in peptoid molecules. Recently, we described a new synthetic route to access peptide tertiary amides (PTAs). PTAs are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. With side chains on both &#945;-carbon and main chain nitrogen atoms, the conformation of these molecules are greatly constrained by sterical hindrance and allylic 1,3 strain. (Figure 1) Our study suggests that these PTA molecules are highly structured in solution and can be used to identify protein ligands. We believe that these molecules can be a future source of high-affinity protein ligands. Here we describe the synthetic method combining the power of both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a sample one-bead one-compound (OBOC) library of PTAs.

Peptide tertiary amides (PTAs) are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. Here we describe a synthetic method which combines&#160;both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a one-bead one-compound library of PTAs.

Split-and-Pool-Synthese und Charakterisierung von Peptid-Amid-Tertiär-Bibliothek

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

Synthese von Protein Biokonjugate<em&gt; über</em&gt; Cystein-maleimid Chemie

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

Einblicke in die Wechselwirkungen von Aminosäuren und Peptide mit anorganischen Materialien Verwendung von Einzelmolekülkraftspektroskopie

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential nutrients. The objective of this work is to demonstrate the qualitative and quantitative analysis of encapsulated fish oil supplements using high-resolution 1H and 13C NMR spectroscopy utilizing two different NMR instruments; a 500 MHz and an 850 MHz instrument. Both proton (1H) and carbon (13C) NMR spectra can be used for the quantitative determination of the major constituents of fish oil supplements. Quantification of the lipids in fish oil supplements is achieved through integration of the appropriate NMR signals in the relevant 1D spectra. Results obtained by 1H and 13C NMR are in good agreement with each other, despite the difference in resolution and sensitivity between the two nuclei and the two instruments. 1H NMR offers a more rapid analysis compared to 13C NMR, as the spectrum can be recorded in less than 1 min, in contrast to 13C NMR analysis, which lasts from 10 min to one hour. The 13C NMR spectrum, however, is much more informative. It can provide quantitative data for a greater number of individual fatty acids and can be used for determining the positional distribution of fatty acids on the glycerol backbone. Both nuclei can provide quantitative information in just one experiment without the need of purification or separation steps. The strength of the magnetic field mostly affects the 1H NMR spectra due to its lower resolution with respect to 13C NMR, however, even lower cost NMR instruments can be efficiently applied as a standard method by the food industry and quality control laboratories.

Here, high-resolution 1H and 13C Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy was used as a rapid and reliable tool for quantitative and qualitative analysis of encapsulated fish oil supplements.

NMR-Spektroskopie als robustes Werkzeug für die schnelle Bewertung des Lipidprofil von Fischöl

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have been thought of as a type of molecular information storage. Mass spectrometry analysis has been considered the method of choice for sequencing peptoids. Peptoids can be synthesized via solid phase chemistry using a repeating two-step reaction cycle. Here we present a method to manually synthesize oligo-peptoids and to analyze the sequence of the peptoids using tandem mass spectrometry (MS/MS) techniques. The sample peptoid is a nonamer consisting of alternating N-(2-methyloxyethyl)glycine (Nme) and N-(2-phenylethyl)glycine (Npe), as well as an N-(2-aminoethyl)glycine (Nae) at the N-terminus. The sequence formula of the peptoid is Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, where Ac is the acetyl group. The synthesis takes place in a commercially available solid-phase reaction vessel. The rink amide resin is used as the solid support to yield the peptoid with an amide group at the C-terminus. The resulting peptoid product is subjected to sequence analysis using a triple-quadrupole mass spectrometer coupled to an electrospray ionization source. The MS/MS measurement produces a spectrum of fragment ions resulting from the dissociation of charged peptoid. The fragment ions are sorted out based on the values of their mass-to-charge ratio (m/z). The m/z values of the fragment ions are compared against the nominal masses of theoretically predicted fragment ions, according to the scheme of peptoid fragmentation. The analysis generates a fragmentation pattern of the charged peptoid. The fragmentation pattern is correlated to the monomer sequence of the neutral peptoid. In this regard, MS analysis reads out the sequence information of the peptoids.

A protocol is described for the manual synthesis of oligo-peptoids followed by sequence analysis by mass spectrometry.

Synthese- und Massenspektrometrie der Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...