This work has been supported by the DFG grant JE 252/7.

Peptit Dizilerinin 1. Hazırlık <ol><li> Peptit Dizilerin Programlama <ol><li> MultiPep gözcü yazılımı kullanılarak sentez için peptid sekansları sunabilirler. Tek harf kodları peptid dizileri girin. Peptid 1: TARKSTGGKA </li><li> Tanımlanmış bir tabakanın tanınması için gerekli önemli amino asitleri ekrana belirli bir komutla (.Kapağı, A) alanin veya arginin yürüyüş kütüphaneleri oluşturun. Aşağıdaki örnekte Örneğin birinci hat yabanıl tip sekans, ikinci hattan bir peptid içinde bulunan her bir amino asit alanin arda değiştirilir. , A yerine TARKSTG Bir -ARKSTG T A -RKSTG TA-A -KSTG TAR A -STG TARK- bir -TG TARKS- bir -G TARKST- A </li><li> Benzer komutları (.Kapağı R kullanın.Tüm doğal mevcut amino asit kalıntısının (sonunda sistein, metionin ve triptofan iptaliyle 1.1.2 tarif edildiği gibi, bu tortuları, oksitlenmeye eğilimlidir ve bazen daha düşük sentez verimi olduğu için), N, vs.) yerine konsensüs saptanması için bir peptit dizisini sentezleme Bir enzim için alt-tabaka dizisi motifi. NOT: Şekil 4A&#39;da gösterildiği gibi, yatay eksen verilen peptit dizisini temsil eder ve dikey eksen ise bir komut için, seçilen amino asitleri temsil eder. 1.1.2 gösterilen sekansına benzer bir şekilde, dikey bir eksen üzerinde bir Ala şekil l&#39;de ilk satırda verilmiştir dizisinin her pozisyonunu değiştirir anlamına gelir. 4A. Benzer şekilde arjinin sekans ve bu başka amino asitler ile ikinci sırada bulunan her bir amino asidi değiştirir. Tam peptid dizisi kütüphaneleri sistematik th ile birlikte gelen peptid alt-tabakası sırayla her bir tortu yerine sentezlenire diğer doğal olarak mevcut amino asit kalıntıları, bu verilen sırada, her pozisyonda her bir kalıntı etkisi anlamaya yardımcı olur. </li><li> Seçenek olarak ise, bilinen ya da tahmin edilen peptit alt tabakasma metilasyonu kolayca pozitif ve negatif kontroller metilasyon ile birlikte PKMT hedef peptidleri ile (metillenmiş bilinen ya da metile olduğu bilinmemektedir örneğin peptitler) peptid kütüphaneleri sentezlenmesi doğrulanabilir. Manuel programlama ile aşağıda gösterildiği gibi hedef lizin metilasyonunu onaylamak için alanin için varsayılan hedef lisin alışverişi peptidler sentez. Yabani tip peptit STGG K PRQFL Mutant peptit STGG bir PRQFL NOT: Yazılım aynı zamanda bir etkileşim için gerekli önemli amino asitleri eşleştirmek için dizinin istenen çerçeve kayması ile epitop haritalama gibi, çeşitli kütüphaneleri oluşturmak için doğal komut vardır. </li></ol></li><li> Membranın hazırlanması, amino asitler, bird Reaktifler <ol><li> 10 dakika boyunca, DMF (N, N-dimetilformamid) SPOT membran Ön kabarma ve bundan sonra da hava kabarcığı ve kırışıklık olmadan yerinde birleştirici çerçeve ıslak membran yerleştirin. </li><li> Membrana% 100 etanol ile üç kez yıkayın. Sentez programına başlamadan önce en az 10 dakika boyunca tamamen membranlar kurulayın. </li><li> Buna paralel olarak, taze NMP içinde çözdürülerek ticari olarak temin edilebilen Fmoc-korumalı amino asitler, 0.5 M çalışma konsantrasyonları hazırlamak ve Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi, aynı zamanda aktivatörü ve baz hazırlar. </li><li> SPOT synthesizer tüm atık çözüm kapları boşaltılması emin olun ve DMF, etanol ve piperidin solvent rezervuarları doldurun. NOT: Şimdi makine sentezi için hazır hale gelir. </li></ol></li><li> Birinci Amino Asit lekelenme <ol><li> Reklam tarafından gelen bir amino asidin karboksi grubunun aktif hale, zar üzerinde serbest amino grubu ile amit bağı oluşturmak içinDing aktivatör (N, N &#39;diizopropilkarbodiimid) ve amino asit türevine baz çözeltisi (Etil hidroksiimino siyanoasetat). </li><li> Programlanabilir robot kullanarak Amino-PEG işlevlendirilmiş membran üzerinde aktif amino asitler istenen hacimleri Nokta. NOT: Bu şekilde, bir amino asit, C-terminali zar amino grubuna birleştirilir. </li><li> İlk aktive amino asitin iyi kavramayı sağlamak için bu adımı üç kez tekrarlayın. Bağlanmamış amino asitlerini ayırmak için DMF ile yıkama, daha sonra 20 dakika boyunca zarın inkübe ve. </li></ol></li><li> Sigara nokta Alanları Ücretsiz Mekanların Engelleme Not: membran amino grubuna tüm peptitlerin birinci C-terminal amino asidin bağlanmasından sonra, lekeler ve ayrıca bir yer alanları içinde amino gruplarının bazıları arasındaki amino grupları, amino asitler ile bağlar oluşturmazlar. <ol><li> Kapama çözeltisi ile inkübe edilerek, bu, serbest amino grubu bloke (DMF içinde% 20 asetik anhidrit)5 dakika karıştırıldı. NOT: Bu membran yerine büyüyen peptid zinciri ile diğer çevrimlerde amino asitlerin bağlanmasını önler. </li></ol></li><li> Fmoc grubunun çıkarılması, <ol><li> Bloke edildikten sonra, DMF ile 4 kez zarın yıkanması ve daha sonra Fmoc koruma grubunun ayrılması için 20 dakika süre ile, DMF içinde% 20 piperidin ile inkübe edilir. NOT: Bu adım, bir amino-koruyucu Fmoc gruplarının bertaraf yol açar ve bu korumanın kaldırılması olarak adlandırılır. </li><li> Daha sonra etanol ile iki kez DMF ile birlikte iki kez, zarı yıkamak ve kurutun. Not: Hemen zar sonraki amino asitleri bağlamak için hazır hale gelir. </li></ol></li><li> Zincir uzama Not: her bir amino asit ilave edilmesi, bir devir denir. Yanı sıra, birinci amino asidin bağlanması ile ilgili çevrim bağlanmış amino asidin N Fmoc grubunun korumasının bozulması ile başlamakta ve büyüyen girişken amino grubuna gelen bir amino asidin aktive edilmiş karboksil grubunun bağlanması izlergelgit zinciri. <ol><li> İstenen peptid uzunluğu elde edilinceye kadar tekrarlayın 1.3 ve 1.5 adımları. </li></ol></li><li> Boyanma NOT: Son devirden sonra, peptid dizileri peptitlerin başarılı bir sentez teyit etmek için bromofenol mavisi ile boyanır. Bromofenol mavisi peptidlerin serbest amino grupları ile bağlanmaktadır. Peptit noktalar boyandıktan sonra açık mavi renk göstermek ama noktalar yoğunluğu peptid dizisi bağlı olarak değişir. Bu boyama peptidlerin renklendirilmesi çünkü piperidin bromofenol mavisi mevcudiyetinde, piperidin tamamen kaldırılması onay sağlar. Buna ek olarak, bu aynı zamanda daha fazla kullanım için peptid dizilerini işaretlemek için yardımcı olur. <ol><li> Son sentez çevriminde Fmoc grubunun korumasının giderilmesinden sonra, DMF ve% 100 etanol ile zarın yıkanması. Bu tamamen mavi olana kadar daha sonra 5 dakikalık bir minimum bromofenol mavisi (DMF içinde% 0.02 bromofenol mavisi) ile membran tedavi. </li><li> Daha sonra, DMF ve ETH ile kesilmesi, zarı yıkamakAnole 10 dakika boyunca kurutuldu. Şimdi synthesizer gelen zarı çıkar ve elle yan zincir Deproteksiyon (bölüm 1.8) gerçekleştirin. Gerekirse, peptid sentezi (Şekil. 2) sonuçlarını belgelemek için membran fotoğraflamak. </li></ol></li><li> Yan zincir korumasının bozulması <ol><li> Yan zincir koruma grupları ve tutucu reaktifler (% 2.5 su ve% 2.5 triizopropilsilan) amino asit yan zincirleri korumak bölmek için% 95 trifloroasetik asit (TFA) &#39;den oluşan bir yan zincir koruma kaldırma karışımının 20-25 ml membranlar tedavi Bu aşama sırasında değişiklik. Tamamen sıkıca kapalı kimyasal dirençli kutusunda zarı kapsamaktadır sağlamak ve yavaşça çalkalayarak 1-2 saat kuluçkaya yatırmaktır için korumayı kaldırma karışımın yeterli bir hacmi al. </li><li> 2 dakika her biri için, DCM (Diklorometan), 20-25 ml, membran altı kez yıkayın ve son olarak iki kez% 100 etanol ile ve gece boyunca bir kurutucu içinde kurutun. NOT: ŞimdiMembran deneyleri için de kullanılabilir. Peptid dizisi bir sentezleme şeması Şekil 1 &#39;de verilmiştir. </li></ol></li></ol> 2. Protein Ekspresyonu ve Saflaştırma <ol><li> GST füzyonları olarak PKMTs Protein Ekspresyonu <ol><li> Standart teknikler kullanılarak GST-füzyon proteini olarak ifade etmek tam uzunluktaki PKMT ya da (pGEX-6p2) gibi bir bakteriyel ekspresyon vektörü içine katalitik domenini kodlayan genin klonlanması. </li><li> BL21 BL21 veya kodon artı E. takın istenen PKMT ile vektör aktarın ısı şoku yöntemi ya da herhangi bir başka yöntem ile coli hücreleri. </li><li> İfade gün Luria-Bertani (LB) ortamı içinde 30 ml bir ön-kültür hazırlanması ve sürekli çalkalanarak 7-8 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Daha sonra, LB ortamı 1 L ihtiva eden bir 2 L&#39;lik büyük saptırma plakalı şişeler içine ön kültür, 10 ml transferi ve 37 ° C&#39;de inkübe Kültür ulaşamayacağı kadar sürekli sallayarak inkübatör ° C600 nm &#39;de tanımlanan bir optik yoğunluk, es. Not: Bu, her bir protein için optimize edilebilir birlikte, rutin olarak yaklaşık 0.8 olan bir OD 600Nm neden olur. indüksiyon sıcaklığı her bir protein için optimize edilmiş olması gerekir, bazı proteinler 22 ° C&#39;de iyi bir ifade göstermektedir ° C ve daha yüksek sıcaklıklarda bir. </li><li> Daha sonra izopropil-p-D-tiyogalaktopiranosid 1 mM; özellikle, 15 dakika boyunca indüksiyon sıcaklığına hücreleri Shift Kültür indüksiyon sıcaklığında 10-12 saat boyunca büyümeye olanak sağlar. </li><li> Daha sonra 15 dakika boyunca 5000 x g&#39;de santrifüj ile hücreler hasat ve son olarak da daha fazla kullanım için -20 ° C &#39;de STE tampon maddesi (10 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCI ve 0.1 mM EDTA) ve mağaza 30 ml pelet yıkayın. </li></ol></li><li> Protein Saflaştırma <ol><li> Hücre topağı çözülme ve sonikasyon tamponu (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCI, 1 mM DTT ve% 5 gliserol) 30 ml yeniden askıya ve sonikasyon ile bozmaktadır. NOT: Bu tampon nEEDS sonuç olarak her bir protein için optimize edilmiş olması. </li><li> 1 saat süre ile 22,000 x g&#39;de hücre lizat santrifüj ve daha sonra süpernatan toplamak ve glutatiyon Sefaroz 4B reçine 600 ul ihtiva eden bir sütun içinden geçer. </li><li> 50 sonikasyon tamponu ml yüksek tuz tamponu (7.5 50 mM Tris pH, 500 mM NaCI, 1 mM DTT ve% 5 gliserol), belirlenmemiş biçimde bağlı proteinleri uzaklaştırmak için 100 ml bir sonraki ile kolon yıkayın. 40 mM glutatiyon içeren yüksek tuz tamponu, 5 ml ile bağlı proteini elüte. </li><li> Düşük gliserol (20 mM Tris pH 7.4, 100 mM KCI, 0.5 mM DTT ve% 10 gliserol), pH 7.4, 2 saat boyunca ve daha sonra 20 mM Tris, 100 mM KCI, 0.5 mM diyaliz tampon maddesinin 2 L Tasfiye edilen proteini Dialyze DTT ve% 70 gliserol 8 saat veya gece boyunca karıştırılmıştır. Tüm saflaştırma tampon, 4 ° C &#39;de olduğundan emin olun ve protein denatürasyonunu önlemek için soğuk bir odada, protein saflaştırma gerçekleştirmek. </li></ol></li></ol> 3. Peptid dizisi Metilasyon <ol><li> Ön incuPeptit Dizilerin lenme <ol><li> Enzim ve pahalı radyoaktif etiketli AdoMet israfını önlemek için uygun büyüklükte bir kutu ya da plastik bir torbaya ya peptit dizisi metilasyon gerçekleştirin. 10 dakika boyunca enzimsiz ilgili metilasyon tampon içeren plastik torba içinde peptid dizisi membran ve etiketlenmiş [metil-3H] -AdoMet önceden inkübe edin. Örnek tam özellik profilini peptid dizisi için metilasyon tamponu 8 ml kullanmak için tampon hacmi, dizinin boyutuna bağlıdır. Her enzim için miktar ve AdoMet konsantrasyonu optimize. </li></ol></li><li> Peptit Dizilerinin metilasyonu <ol><li> Ön kuluçka tamponu atılır ve ilgili PKMT içeren metilasyon tamponu 8 ml membran inkübe ve etiketli [metil-3H] -AdoMet 1 saat ila 2. Not: bir metilasyon reaksiyonu için gerekli olan enzim miktarı belirli PKMT aktivitesine bağlıdır, bizim tarama deneyleri, 50 nM enzim yüzgeç genellikle başlatmaark konsantrasyonu. </li></ol></li><li> Peptit Dizilerinin Yıkama <ol><li> Daha sonra radyoaktif atık konteynerine metilasyon tampon atın ve bağlanmış proteinin ayrılması için 5 dakika için 100 mM amonyum bikarbonat ve% 1 SDS içeren tampon içinde, 20 ml ile 5 kez peptid dizileri yıkayın. Bir radyoaktif atık kabına yıkama tampon atın. </li></ol></li><li> Radyoaktif Sinyal Algılama <ol><li> Yıkamalardan sonra, radyo frekans sinyallerini çözeltisi (NAMP100V), 10 ml, 5 dakika boyunca zarın inkübe edilir. </li><li> Sonra, organik çözücüler için radyoaktif atık kabına güçlendir çözüm atmak bir plastik torba içinde peptit dizisi mühür ve bir otoradyografisidir kasetine koymak. </li><li> Karanlık bir odada peptid dizisindeki otoradyografisi filmi yerleştirin. Dikkatle kaseti kapatın ve en maruz -80 Gerekli süre için C °. Sonra, sonuçları analiz filmi geliştirmek. Farklı Expositio ile kez görüntü birkaç Yakalaman kere kuvvetle metile peptid yüzeylerde doygunluğunu önlemek için. </li></ol></li></ol> 4. Veri İşleme ve Analizi <ol><li> Nokta şiddetler dansitometrik Analizi <ol><li> Geleneksel tarayıcı filmi tarayın ve densitometri spot yoğunluklarını analiz. (Ücretsiz) bu kullanarak ImageJ veya ticari bir program yapın. NOT: Bu görev için Phoretix yazılımını kullanın. </li></ol></li><li> Normalleştirme ve Farklı Membranların gelen Sonuçlarının Ortalaması <ol><li> En az üç kez peptit dizisi metilasyon deneyler. 1.0 gibi bir referans yüzeyde arka plan çıkarma ve aktivitesini ayarlayarak her deney için taranan yoğunluklarını Normale. Bireysel noktalar için veri ortalama ve onlara olarak ortalama değerleri ve standart sapmaları rapor. </li></ol></li><li> Veri Analizi ve Görüntü <ol><li> Göreceli aktivitesini belirtmek için bir gri tonlama veya renk düzeni kullanarak 2D verileri çizilir. Bu wi yapınth Excel veya SigmaPlot burada gösterildiği gibi. Aynı zamanda, veri kalitesi analizi için tekrarlanan deneylerde standart sapmalarının bir dağılım grafiği hazırlanır. </li><li> Karşılaştırarak nicel substrat peptit her bakiyenin tanıma doğruluğu görüntülemek için bir ayrım faktör D 16,17 pozisyonunda x her bir amino asit i PKMT göreli tercih hesaplanır: D X i = &lt;V j ≠ i&gt; / V i - 1 V I pozisyon X ve amino asit i taşıyan peptit varyantının metilasyon oranı Burada &lt;h j ≠ i&gt; de dahil olmak üzere, x konumuna, farklı bir amino asit j ≠ i taşıyan 19 peptitlerin metilasyonu ortalama oranı (bir Vahşi tip sekansı). NOT: Bu tanımlanan ayrımcılık faktörü arka plan düzeyine bağlıdır. Tek Tortu,% 3 bir arka plan, bir ayrım ile belli bir pozisyonda kabul edilirse32,3 faktör elde edilmiştir. Bir pozisyonda hiçbir tercih 0 bir ayrımcılık faktörü sonuçlanır. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Margueron, R., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+structure+and+the+inheritance+of+epigenetic+information.">Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information.</a> Nat. Rev. Genet. 11, 285-296 (2010).</li><li>Dawson, M. A., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenetics:+from+mechanism+to+therapy.">Cancer epigenetics: from mechanism to therapy.</a> Cell. 150, 12-27 (2012).</li><li>Helin, K., Dhanak, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+proteins+and+modifications+as+drug+targets.">Chromatin proteins and modifications as drug targets.</a> Nature. 502, 480-488 (2013).</li><li>Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+methylation+at+the+surface+and+buried+deep:+thinking+outside+the+histone+box.">Protein methylation at the surface and buried deep: thinking outside the histone box.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38, 243-252 (2013).</li><li>Rathert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+lysine+methyltransferase+G9a+acts+on+non-histone+targets.">Protein lysine methyltransferase G9a acts on non-histone targets.</a> Nature Chemical Biology. 4, 344-346 (2008).</li><li>Hornbeck, P. V., Chabra, I., Kornhauser, J. M., Skrzypek, E., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhosphoSite:+A+bioinformatics+resource+dedicated+to+physiological+protein+phosphorylation.">PhosphoSite: A bioinformatics resource dedicated to physiological protein phosphorylation.</a> Proteomics. 4, 1551-1561 (2004).</li><li>Reineke, U., Volkmer-Engert, R., Schneider-Mergener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+peptide+arrays+prepared+by+the+SPOT-technology.">Applications of peptide arrays prepared by the SPOT-technology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 12, 59-64 (2001).</li><li>Winkler, D. F., Andresen, H., Hilpert, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPOT+synthesis+as+a+tool+to+study+protein-protein+interactions.">SPOT synthesis as a tool to study protein-protein interactions.</a> Methods Mol. Biol. 723, 105-127 (2011).</li><li>Leung, G. C., Murphy, J. M., Briant, D., Sicheri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+kinase+target+phosphorylation+consensus+motifs+using+peptide+SPOT+arrays.">Characterization of kinase target phosphorylation consensus motifs using peptide SPOT arrays.</a> Methods Mol. Biol. 570, 187-195 (2009).</li><li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SPOT-synthesis+technique.+Synthetic+peptide+arrays+on+membrane+supports--principles+and+applications.">The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications.</a> Journal of immunological methods. 267, 13-26 (2002).</li><li>Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+arrays+on+cellulose+support:+SPOT+synthesis,+a+time+and+cost+efficient+method+for+synthesis+of+large+numbers+of+peptides+in+a+parallel+and+addressable+fashion.">Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion.</a> Nature protocols. 2, 1333-1349 (2007).</li><li>Li, S. S., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+peptide+array+to+identify+binding+motifs+and+interaction+networks+for+modular+domains.">Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains.</a> Methods Mol. Biol. 570, 67-76 (2009).</li><li>Winkler, D. F., Hilpert, K., Brandt, O., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+peptide+arrays+using+SPOT-technology+and+the+CelluSpots-method.">Synthesis of peptide arrays using SPOT-technology and the CelluSpots-method.</a> Methods Mol. Biol. 570, 157-174 (2009).</li><li>Toepert, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+SPOT+synthesis+and+native+peptide+ligation+to+create+large+arrays+of+WW+protein+domains.">Combining SPOT synthesis and native peptide ligation to create large arrays of WW protein domains.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 42, 1136-1140 (2003).</li><li>Volkmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+application+of+peptide+arrays:+quo+vadis+SPOT+technology.">Synthesis and application of peptide arrays: quo vadis SPOT technology.</a> Chembiochem : a EuropeanJournal of Chemical Biology. 10, 1431-1442 (2009).</li><li>Rathert, P., Zhang, X., Freund, C., Cheng, X., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+substrate+specificity+of+the+Dim-5+histone+lysine+methyltransferase+using+peptide+arrays.">Analysis of the substrate specificity of the Dim-5 histone lysine methyltransferase using peptide arrays.</a> Chemistr., &amp; biology. 15, 5-11 (2008).</li><li>Kudithipudi, S., Dhayalan, A., Kebede, A. F., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SET8+H4K20+protein+lysine+methyltransferase+has+a+long+recognition+sequence+covering+seven+amino+acid+residues.">The SET8 H4K20 protein lysine methyltransferase has a long recognition sequence covering seven amino acid residues.</a> Biochimie. 94, 2212-2218 (2012).</li><li>Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Rathert, P., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+analysis-based+identification+of+new+methylation+targets+of+the+SET7/9+protein+lysine+methyltransferase.">Specificity analysis-based identification of new methylation targets of the SET7/9 protein lysine methyltransferase.</a> Chemistr., &amp; Biology. 18, 111-120 (2011).</li><li>Kudithipudi, S., Lungu, C., Rathert, P., Happel, N., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+analysis+and+novel+substrates+of+the+protein+lysine+methyltransferase+NSD1.">Substrate specificity analysis and novel substrates of the protein lysine methyltransferase NSD1.</a> Chemistr., &amp; Biology. 21, 226-237 (2014).</li><li>Obenauer, J. C., Cantley, L. C., Yaffe, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scansite+2.0:+Proteome-wide+prediction+of+cell+signaling+interactions+using+short+sequence+motifs.">Scansite 2.0: Proteome-wide prediction of cell signaling interactions using short sequence motifs.</a> Nucleic Acids Research. 31, 3635-3641 (2003).</li><li>Takahashi, M., Ueno, A., Mihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+design+based+on+an+antibody+complementarity-determining+region+(CDR):+construction+of+porphyrin-binding+peptides+and+their+affinity+maturation+by+a+combinatorial+method.">Peptide design based on an antibody complementarity-determining region (CDR): construction of porphyrin-binding peptides and their affinity maturation by a combinatorial method.</a> Chemistry. 6, 3196-3203 (2000).</li><li>Kramer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spot+synthesis:+observations+and+optimizations.">Spot synthesis: observations and optimizations.</a> J. Pept. Res. 54, 319-327 (1999).</li><li>Stadler, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+synthesis+of+peptide+arrays+with+a+laser+printer.">Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 47, 7132-7135 (2008).</li><li>Schnack, C., Hengerer, B., Gillardon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+substrates+for+Cdk5+and+new+targets+for+Cdk5+inhibitors+using+high-density+protein+microarrays.">Identification of novel substrates for Cdk5 and new targets for Cdk5 inhibitors using high-density protein microarrays.</a> Proteomics. 8, 1980-1986 (2008).</li><li>Mah, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+analysis+of+protein+kinase+complex+Dbf2-Mob1+by+peptide+library+and+proteome+array+screening.">Substrate specificity analysis of protein kinase complex Dbf2-Mob1 by peptide library and proteome array screening.</a> BMC Biochemistry. 6, 22 (2005).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

Burada tarif edildiği gibi SPOT sentezi, protein-protein etkileşimi sitesi harita ve peptit değiştirici enzim alt-tabaka tanıma araştırmak için güçlü bir yöntemdir. SPOT yöntemi ile sentezlenmiş peptitler, bu, her bir durumda teyit etmek zordur% 90&#39;dan daha fazla saflığa 21 için rapor edilmiştir, ancak Ancak, SPOT sentezi, hala bazı dezavantajlara sahiptir. Bu nedenle, sonuçlar örneği kullanılarak protein etki ya da standart yöntemlerle sentezlenebilir saflaştırılmış peptidler...

Son iki yılda, çeşitli raporlar hücresel gelişim ve kanser gibi çeşitli hastalıkların, ancak son zamanlarda protein lisin metilasyonu bir başka hayati PTM olarak ortaya çıkmıştır içinde post-translasyonel modifikasyonlar (PTM) önemini göstermiştir. Başlangıçta sübstrat olarak histon lizin metilasyon önemli bir kromatin işareti olarak bulunurken, daha sonra çalışmalar da çeşitli sivil histon proteinler 1-4 lizin metilasyon gösterdi. lizin kalıntılarının ε-amino grubunda ve S-adenosil-L-metionin metil gruplarının bir transferi insan genomunda 60 proteinleri içeren protein Lizin metiltransferaz (PKMTs) olarak adlandırılan bir enzim ailesi tarafından katalize edilmektedir. PKMTs başlangıçta belirli lizin kalıntısı metillenmesi ancak daha sonra raporlar da olmayan histon proteinler 5 metillenmesi olabilir gösterdi histon modifiye enzimler olarak tespit edildi. Şimdiye kadar, yaklaşık 5.000 lizin metilasyon siteleri farklı proteinler 6 tespit edildi </skadar&gt;, ancak bu değişiklikler sorumlu enzimler genellikle tespit edilmez. Bunun bir nedeni, çoğu PKMTs özgünlüğü yoğun çalışılmamıştır olmasıdır. Bu nedenle, tekrar tekrar PKMTs yeni alt-tabakalar tespit edilmesi meydana gelir. PKMTs substrat seçiciliği detaylı bilgi eksikliği biyolojik fonksiyon ve rol anlayış engellemektedir. Ayrıntılı olarak PKMT özgünlüğünü incelemek için, bir veya birkaç amino asitin farklı bir çok peptit alt tabakasma metilasyonu oranları ölçülebilir olmalı ve ideal olarak peptid dizileri kullanılarak yapılır ki, karşılaştırıldı. Elde edilen özgüllük profilleri göre PKMTs potansiyel alt-tabakalar bundan başka incelenebilir olduğu tespit edilebilir. Peptid dizileri yaygın olarak antikorlar, peptid değiştirici enzimler ve protein-protein etkileşim bölgeleri (antikor-antijen, reseptör-ligand), 7-9 haritalama biyokimyasal analizi için kullanılan araçlardır. Peptidlerin birkaç yüz suc için gerekli olanh uygulamaları. Farklı yöntemler onları çok yaygın olarak kullanılan bir reçine üzerinde sentez peptit arasında, peptid sentezi için kullanılabilir, ancak bu verim değeri sınırlıdır ve bu nispeten pahalıdır. Bu sorunlar Frank ve arkadaşları 10 tarafından SPOT sentez yöntemi tanıtımıyla çözüldü. SPOT sentez yöntemi paralel olarak birkaç yüz peptitlerin sentezini sağlar ve ortalama reçine sentezi göre ucuzdur. selüloz zarı üzerinde sentezlenen peptidler zar ayrılır ve çözelti deneylerinde serbest peptidler olarak kullanılabilir ya da peptid mikrodiziler 10-13 hazırlamak için edilebilir çeşitli uygulamalar veya peptidlere doğrudan kullanılabilir. SPOT sentezi katı bir destek olarak bir selüloz zar kullanılır ve standart Fmoc kimyası kullanan 10-13 katı fazlı peptit sentezi, bir çeşididir. Bu nedenle, peptid zincirlerinin sentezlenmesi C-terminal ucunda başlar ve doğru ilerlerRibozomlar biyolojik sentezi aksine N-terminal ucu. Selüloz membranlar ilk olarak aktif amino asitler (Şek. 1) bağlanması için fonksiyonalize edilir. SPOT yöntem otomatik bir pipet sistemi kullanılarak zar üzerinde tanımlanan noktalar için çözücünün bir damlacık içinde aktive edilmiş bir amino asitlerin ardışık doğum dayanmaktadır. sıvı damlacık daha sonra peptit sentezinde kimyasal reaksiyonlar için açık bir reaktör olarak işlev yapan bir dairesel ıslak nokta oluşturur gözenekli zar üzerinde dağıtılır. spot büyüklüğü tevzi hacmi ve membran emme kapasitesi ile belirlenir, bu noktalar katları dizileri olarak düzenlenmiştir. sentez ölçekli nokta büyüklüğü ve membran yükleme kapasitesi ile ilişkilidir. noktalar ve dizilerin yoğunluğu arasındaki mesafe nokta boyutları değişen yönetilmektedir. Selüloz membran peptid sentezinde katı faz olarak bir çok avantajı vardır, bu kullanılan kimyasal için, ucuz toleranslıdırsulu çözeltiler içinde kararlı ve kolay olarak peptid sentezinde kullanılan als. Buna ek olarak, hidrofil bir karakter gösterir çeşitli biyolojik tahlil sistemleri için uygun yapar. SPOT Sentez elle gerçekleştirilir veya peptitler gerekli sayısına bağlı olarak, peptidler (1000&#39;ler için) otomatik hale getirilebilir. INTAVIS (Köln, Almanya) Tam otomatik SPOT sentezleyici bizim uygulamalar için kullanılır. Farklı miktarlarda ve farklı uzunlukta peptit sentezini mümkün kılar. Ayrıca, adım adım sentezi 14,15 hazırlanabilir doğrusal peptidler düzenli 42 amino asidin eklenmesi peptitlerde, 15-20 amino asit uzunluğunda sentezlenir. Bununla birlikte, amino asit sayısının artması peptidlerin kalitesini etkiler genel birleştirme verimi, azalmalara yol açar. Çünkü nokta başına peptidler düşük bir miktarının bu ürünler genel olarak saflaştırılması zor olan ve ayrı ayrı peptitlerin ürünlerin kalitesi daha kolay değerlendirilemez. Bu nedenle, sonuçlar SPOT Pept eldeide dizileri saflaştırılmış ve peptid sentezinde veya arzu edilen peptid dizilerini ihtiva eden proteinlerin sentezlenmesi ile standartlara göre analiz edilebilir büyük ölçekli standart yöntemler ile sentezlenir peptidler ya onaylanmalıdır. Yine, biz son derece güvenilir olması için SPOT sentezini buldum ve tekrarlanabilir olması genellikle sonuçları. SPOT sentez olan peptidler daha önce ve bundan başka son yan zincir koruma grubunun yarılması ve sonra modifiye sağlayan, amino asitler, aynı zamanda sentezi için kullanılabilecek çeşitli ticari olarak temin edilebilen tadil edilmiş amino asitler, proteinojenik ile sınırlı değildir, aynı zamanda dahil edilmesini sağlar fosforile metillenmiş ya da asitile edilmiş amino asitler, 11. SPOT yöntemi ile sentezlenmiş Hareketsizleştirilmiş peptit kolleksiyonları, çok sayıda biyolojik ve biyokimyasal analizler için de kullanılabilir. Bu PKMTs sübstrat spesifitesinin incelenmesi için 300-400 peptidleri içeren peptid dizileri kullanılabilir. Enzimatik modifi için, peptit dizileri, ilgili PKMT ile inkübe edilir ve uygun bir tampon maddesi içinde [metil- 3H] -AdoMet etiketli. ilgili alt-tabaka metilasyon otoradyografi ile peptid alt-tabakaya AdoMet gelen radyoaktif olarak etiketlenmiş metil grubu enzimatik transferi (Şek. 3) aşağıdaki şekilde analiz edilir. Bu prosedür ile, peptid dizileri, aynı zamanda, farklı peptit alt tabakasma metilasyonu çalışma sağlar. Bu yöntemin önemli bir avantajı, tüm peptidler metilasyon kinetiği doğrusal aşamasında, her bir peptidin nispi metilasyon ayrılma sabiti (k cat / K bölü katalitik hız sabiti ile orantılı olacak şekildedir, rekabet metillenmiş olmasıdır İlgili peptid maddesi için, enzim D). Bu nedenle, her bir nokta ile radyoaktivite miktarı, doğrudan belirli bir peptid karşı enzimatik aktivitesi ile ilişkilidir. Kullanmabir peptit dizisi metilasyon deneyin sonuçları, PKMT özgüllüğü profili teyit edilebilecektir, bu yeni yüzeylerde tanımlandığı gibidir ve dayalı olabilir. Peptit diziler peptid düzeyinde yeni yüzeylerde metilasyonu hızlı ve maliyet etkin doğrulama sağlar. Bunun için, dizi hedef bölgelerde yerine Lys Ala ihtiva eden modifiye edilmiş peptidler olarak pozitif ve negatif kontrol peptidleri ile birlikte tahmin edilen yeni alt tabakaların içeren hazırlanır. Son olarak, yeni alt-tabakalar bir araya mutantları ile protein, burada hedef Lys Ala ile değiştirilmiş olduğu ve metilasyon protein seviyesinde doğrulanabilir gibi hazırlanabilir. Sonuçlarına bağlı olarak, bu daha sonra yeni açıklanan protein maddelerinin metilasyonu potansiyel rolleri ele biyolojik çalışmalar takip edilmektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="734">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:112px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:179px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol abs Gradient Grade HPLC</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>10299901</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">4193302</td>
			<td>Flammable, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piperidine &#8805; 99 % for Peptide Synthesis</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A122.1</td>
			<td>Flammable, Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate )</td>
			<td>Novabiochem</td>
			<td>8510860100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">N,N&#8217;-Diisopropylcarbodiimide purum &#8805; 98% GC</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>38370</td>
			<td>Flammable, Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetic anhydride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CP28.1</td>
			<td>Flammable, Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triisopropylsilane 99%,</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>233781</td>
			<td>Flammable, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dichlormethane &#8805;99,9%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P089.1</td>
			<td>Carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Methyl-2-Pyrrolidone</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4306.2</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Derivatized cellulose Membrane</td>
			<td style="width:112px;">Intavis AG K&#246;ln</td>
			<td style="width:119px;">32.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P088.2</td>
			<td>Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromphenolblue</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3640.0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T871.2</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Dodecyl Sulfate Pellets</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CN30.3</td>
			<td>Toxic, Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">MultiPep Synthesizer</td>
			<td style="width:112px;">Intavis AG K&#246;ln</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">HyperfilmTM high performance film</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28906837</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Phoretix software</td>
			<td style="width:112px;">TotalLab</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

specificity analysis of protein lysine methyltransferases using spot peptide arrays

Lizin metilasyonu yükselen bir translasyon sonrası modifikasyon olup, hücre gelişimi ve bir çok hastalıkta önemli bir rol oynar burada bu, birkaç histon ve histon olmayan proteinleri üzerinde tespit edilmiştir. Yaklaşık 5.000 lisin metilasyon siteleri, protein lisin methyltransferases birkaç onlarca tarafından belirlenen farklı proteinler, tespit edilmiştir. Bu artık, sadece bir ya da iki alt-tabakalar, bu enzimlerin birkaç için tespit edilmiştir, ancak kadar her PKMT birden proteinleri metile işaret etmektedir. Bu sorunu yaklaşım, biz girmiştik peptit dizisi bazlı substrat özgüllüğü PKMTs analizleri. Peptid dizileri farklı dizi ile çeşitli substratların metilasyon bir dizi test edilebilir, çünkü PKMTs özgüllüğünü tanımlamak için güçlü araçlardır. Biz INTAVIS SPOT sentezleyici kullanılarak selüloz zarı üzerinde peptid dizileri sentezlenmiş ve çeşitli PKMTs özgüllüğünü analiz edilmiştir. Bu enzimlerin birçoğu için, sonuçlara göre, yeni substrates tanımlanabilir. Örneğin peptit dizileri kullanılarak NSD1 için, bunun H4 K44 yerine rapor H4K20 metile ve buna ek olarak H1.5K168 önceden bilinen H3K36 üzerinde yüksek ölçüde tercih edilen alt-tabaka olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, peptid dizileri biyokimyasal PKMTs karakterize güçlü araçlardır.

Bu yaklaşım 5,16-19 ile peptid dizileri başarılı bir şekilde biyokimyasal olarak PKMTs özgüllüğünü tanımlamak için kullanılmıştır ve PKMT birkaç yeni histon ve histon olmayan alt-tabakalar tanımlanmıştır. Bir PKMT (veya herhangi bir enzim) doğru substrat spektrumunu tanımlama moleküler mekanizması ve hücresel fonksiyonların anlaşılması yönünde önemli bir adımdır. Peptid SPOT dizi metilasyon yöntemin bir uygulama örnek olarak, NSD1 PKMT 1...

Watch this Scientific Journal Video about Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays at JoVE.com

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

SPOT Peptit Diziler Protein Lizin Methyltransferases Özgünlüğü Analizi

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

specificity-analysis-protein-lysine-methyltransferases-using-spot

Research

JoVE Journal

Biology

13.8K Görüntüleme.  Stuttgart University. Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

Video: Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biyoloji

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Sıvı Faz Kurtarma Moleküler Ağırlık Tabanlı Fraksiyonu GELFREE 8100 Fraksiyonu Sisteminin Kullanılması

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

Proteinler Peptid immunoaffiniti Zenginleştirme kullanarak Niceleme Kütle Spektrometresi ile birleştiğinde

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small molecule studies and drug development 4. Many epigenetic regulators have only recently been discovered and are still in the process of being classified. Among these enzymes are lysine demethylases which remove methyl groups from lysines on histones and other proteins. Due to the novel nature of this class of enzymes, few assays have been developed to study their activity. This has been a road block to both the classification and high throughput study of histone demethylases. Currently, very few demethylase assays exist. Those that do exist tend to be qualitative in nature and cannot simultaneously discern between the different lysine methylation states (un-, mono-, di- and tri-). Mass spectrometry is commonly used to determine demethylase activity but current mass spectrometric assays do not address whether differentially methylated peptides ionize differently. Differential ionization of methylated peptides makes comparing methylation states difficult and certainly not quantitative (Figure 1A). Thus available assays are not optimized for the comprehensive analysis of demethylase activity.
Here we describe a method called MassSQUIRM (mass spectrometric quantitation using isotopic reductive methylation) that is based on reductive methylation of amine groups with deuterated formaldehyde to force all lysines to be di-methylated, thus making them essentially the same chemical species and therefore ionize the same (Figure 1B). The only chemical difference following the reductive methylation is hydrogen and deuterium, which does not affect MALDI ionization efficiencies. The MassSQUIRM assay is specific for demethylase reaction products with un-, mono- or di-methylated lysines. The assay is also applicable to lysine methyltransferases giving the same reaction products. Here, we use a combination of reductive methylation chemistry and MALDI mass spectrometry to measure the activity of LSD1, a lysine demethylase capable of removing di- and mono-methyl groups, on a synthetic peptide substrate 5. This assay is simple and easily amenable to any lab with access to a MALDI mass spectrometer in lab or through a proteomics facility. The assay has ~8-fold dynamic range and is readily scalable to plate format 5.

We present a method for using MALDI mass spectrometry and reductive methylation chemistry to quantify changes in lysine methylation.

Lizin demetilaz Faaliyet Kantitatif Ölçümler MassSQUIRM Uygulaması

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Peptid Epitopların Kantitatif Analiz için bir yüksek veri akışı MHC II Bağlanma Deneyi

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Peptit Diziler protein-protein etkileşim Siteleri belirlenmesi

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

Peptit bağlanma floresan protein DNA ile yüzey-gergin büyük DNA moleküllerinin Görselleştirme

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...