This work has been supported by the DFG grant JE 252/7.

1. Preparación del péptido Arrays <ol><li> Programación de la secuencias peptídicas <ol><li> Diseñar secuencias de péptidos para la síntesis utilizando el software MultiPep Spotter. Introduzca las secuencias de péptidos en los códigos de una sola letra. Péptido 1: TARKSTGGKA </li><li> Generar alanina o arginina pie bibliotecas con un comando específico (.replace, A) para detectar los aminoácidos importantes que se requieren para el reconocimiento de un sustrato definido. Por ejemplo, en el siguiente ejemplo, la primera línea es la secuencia de tipo salvaje y de la segunda línea de cada aminoácido en un péptido se altera secuencialmente a alanina. sustituir, A TARKSTG Un -ARKSTG T- A -RKSTG TA A -KSTG TARGET A -STG TARK- Un -TG TARKS- A -G TARKST- A </li><li> Utilice comandos similares (.replace R,.reemplazar N etc.) como se describe en 1.1.2 con todos los residuos de aminoácidos naturalmente disponibles (eventualmente omitiendo cisteína, metionina y triptófano, debido a que estos residuos son propensos a la oxidación y, a veces menor rendimiento de síntesis) para sintetizar una matriz de péptido para la determinación del consenso sustrato motivo de secuencia para una enzima. NOTA: Como se muestra en la Figura 4A, el eje horizontal representa la secuencia de péptido dado y el eje vertical representa los aminoácidos que se seleccionan para el comando. Similar a la secuencia mostrada en 1.1.2, A en el eje vertical significa que un secuencialmente Ala reemplaza cada posición de la secuencia dada en la primera fila en la Fig. 4A. Del mismo modo secuencial arginina sustituye cada aminoácido en la segunda fila y así sucesivamente con los otros aminoácidos. Bibliotecas completas de matriz péptido se sintetizan mediante la sustitución sistemática de cada residuo en la secuencia de sustrato peptídico proporcionado con cada uno de ºe otros residuos de aminoácidos disponibles de forma natural, lo que ayuda a comprender la influencia de cada residuo en cada posición de la secuencia dada. </li><li> Alternativamente, la metilación de los sustratos peptídicos conocidos o previstos puede ser fácilmente verificada la síntesis de bibliotecas de péptidos con los péptidos diana de la PKMT junto con controles de metilación positivo y negativo (es decir, péptidos que se sabe que metilado o conocidos no ser metilado). Sintetizar péptidos mediante el intercambio de la lisina putativo objetivo a alanina para confirmar la metilación de la lisina de destino como se muestra a continuación mediante la programación manual. Wild tipo péptido: LTGG K PRQFL Péptido mutante: LTGG Un PRQFL NOTA: El software también tiene secuencias de comandos inherentes para crear varias bibliotecas, como el mapeo de epítopos con un cambio de marco deseada de la secuencia para mapear los aminoácidos importantes que se requieren para una interacción. </li></ol></li><li> Preparación de membrana, Amino Acids unaReactivos d <ol><li> Pre-hinchar la membrana SPOT en DMF (N, N-dimetilformamida) durante 10 min y luego se coloca la membrana húmeda sobre el bastidor sintetizador SPOT sin burbujas de aire o arrugas. </li><li> Lavar la membrana tres veces con etanol al 100%. Secar las membranas completamente durante al menos 10 min antes de iniciar el programa de síntesis. </li><li> En paralelo, recién preparar 0,5 M concentraciones de trabajo de aminoácidos protegidos con Fmoc comercialmente disponibles mediante su disolución en NMP y también preparar el activador y base como se describe en la Tabla 1. </li><li> Asegúrese de que todos los contenedores de solución de residuos del sintetizador SPOT se vaciaron y rellenar los depósitos de disolvente con la DMF, etanol y piperidina. NOTA: Ahora la máquina está lista para la síntesis. </li></ol></li><li> Manchas de la Primera Amino Acid <ol><li> Para generar el enlace amida con el grupo amino libre en la membrana, activar el grupo carboxi del aminoácido entrante adding el activador (N, N &#39;-Diisopropylcarbodiimide) y la solución de base (cianoacetato de etilo hidroxiimino) para el derivado de ácido amino. </li><li> Detectar los volúmenes deseados de aminoácidos activados en la membrana funcionalizado amino-PEG usando el robot programable. NOTA: este modo, el C-terminal del aminoácido se acopla al grupo amino de la membrana. </li><li> Repita este paso tres veces para asegurar un mejor acoplamiento del primer aminoácido activado. Incubar la membrana durante 20 min y luego se lava con DMF para eliminar aminoácidos desacoplados. </li></ol></li><li> El bloqueo de los espacios libres en zonas no al contado NOTA: Después de que el acoplamiento del primer aminoácido C-terminal de todos los péptidos con el grupo amino de la membrana, los grupos amino entre las manchas y también algunos de los grupos amino dentro de las áreas de punto de no formar enlaces con los aminoácidos. <ol><li> Bloquear estos grupos amino libres mediante la incubación con la solución de empaquetado (20% de anhídrido acético en DMF)durante 5 min. NOTA: Esto evita el acoplamiento de los aminoácidos en los ciclos adicionales con la membrana en lugar de la cadena peptídica en crecimiento. </li></ol></li><li> La eliminación de Fmoc Grupo <ol><li> Tras el bloqueo, lavar la membrana con DMF 4 veces y luego se incuba con 20% de piperidina en DMF durante 20 min para eliminar el grupo de protección Fmoc. NOTA: Este paso lleva a la eliminación de los grupos protectores de amino Fmoc y se llama desprotección. </li><li> Después, lavar la membrana dos veces con DMF y dos veces con etanol y deje que se seque. NOTA: Ahora la membrana está listo para el acoplamiento de los siguientes aminoácidos. </li></ol></li><li> Elongación de la cadena NOTA: La adición de cada aminoácido se denomina un ciclo. Aparte del acoplamiento del primer aminoácido, el ciclo comienza con la desprotección del grupo Fmoc del aminoácido acoplado y es seguida por el acoplamiento del grupo carboxilo activado de un ácido amino entrante para el grupo amino de la pep crecientecadena de marea. <ol><li> Repetir los pasos 1.3 y 1.5 hasta que se consigue la longitud del péptido deseado. </li></ol></li><li> La tinción NOTA: Después de que el ciclo final, los arrays de péptidos se tiñeron con azul de bromofenol para confirmar la exitosa síntesis de péptidos. Azul de bromofenol se une con los grupos amino libres de los péptidos. Manchas de péptidos muestran de color azul claro después de la tinción, pero la intensidad de las manchas varía en función de la secuencia del péptido. Esta tinción permite la confirmación de la completa eliminación de la piperidina, debido a que en presencia de azul de bromofenol piperidina no mancha los péptidos. Además, esto también ayuda a marcar los arrays de péptidos para su uso posterior. <ol><li> Después de la desprotección del grupo Fmoc en el último ciclo de síntesis, se lava la membrana con DMF y etanol 100%. Luego, trate la membrana con azul de bromofenol (0,02% de azul de bromofenol en DMF) durante un mínimo de 5 minutos hasta que se vuelva completamente azul. </li><li> Después, lavar la membrana con DMF y ethanol seguido por secado durante 10 min. Ahora saca la membrana del sintetizador y realizar la desprotección de la cadena lateral (sección 1.8) manualmente. Si es necesario, fotografiar la membrana para documentar los resultados de la síntesis del péptido (Fig. 2). </li></ol></li><li> La desprotección de la cadena lateral <ol><li> Tratar las membranas con 20 a 25 ml de mezcla de desprotección de la cadena lateral que consiste en 95% de ácido trifluoroacético (TFA) para escindir los grupos de protección de cadena lateral y reactivos scavenger (2,5% de agua y 2,5% triisopropilsilano) para proteger las cadenas laterales de aminoácidos a partir de modificación durante este paso. Tome un volumen suficiente de mezcla de desprotección para asegurarse de que cubra completamente la membrana en una caja herméticamente cerrada resistente a productos químicos y se incuba durante 1 a 2 horas mientras se agita suavemente. </li><li> Lavar la membrana seis veces con 20 a 25 ml de DCM (diclorometano) durante 2 minutos cada uno y finalmente dos veces con etanol al 100% y se seca en un desecador durante la noche. NOTA: Ahorala membrana puede ser utilizado para los experimentos. Un esquema de la síntesis de matriz de péptido se proporciona en la Figura 1. </li></ol></li></ol> 2. Expresión y Purificación de Proteínas <ol><li> Expresión de proteínas de PKMTs como fusiones GST <ol><li> Utilizando técnicas estándar, clonar el gen que codifica la PKMT longitud completa o su dominio catalítico en un vector de expresión bacteriano (como pGEX-6P2) para expresarlo como proteína de fusión con GST. </li><li> Transferir el vector con el PKMT deseada insertar en BL21 o BL21 codón más E. células de E. coli por el método de choque térmico o cualquier otro método. </li><li> Preparar un pre-cultivo con 30 ml de medio Luria-Bertani (LB) en el día de expresión y se incuba a 37 ° C durante 7 a 8 horas con agitación continua. </li><li> A continuación, transferir 10 ml de la pre-cultivo en unas 2 L grandes matraces con deflectores que contienen 1 L de medio LB y se incuba a 37 ° C en la incubadora con agitación continua hasta que el alcance de la culturaes una densidad óptica definida a 600 nm. NOTA: Mientras que esto puede ser optimizado para cada proteína, inducimos rutinariamente a una OD 600 nm de aproximadamente 0,8. La temperatura de inducción tiene que ser optimizado para cada proteína individual, algunas proteínas mostrar buena expresión a las 22 ° C y algunos a temperaturas más altas. </li><li> Shift las células a la temperatura de inducción de 15 min, a continuación, inducir con 1 mM de isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido y permitir que el cultivo crezca durante 10-12 horas a la temperatura de inducción. </li><li> Después recoger las células por centrifugación a 5000 xg durante 15 min y finalmente lavar el sedimento con 30 ml de tampón STE (10 mM Tris pH 8,0, NaCl 100 mM y EDTA 0,1 mM) y se almacena a -20 ° C para su posterior uso. </li></ol></li><li> Protein Purification <ol><li> Descongelar el pellet de células y volver a suspender en 30 ml de tampón de sonicación (50 mM Tris pH 7,5, NaCl 150 mM, DTT 1 mM y 5% de glicerol) y perturbar por sonicación. NOTA: Este buffer nECESIDADES para ser optimizado para cada proteína con el tiempo. </li><li> Centrifugar el lisado de células a 22.000 xg durante 1 hora y, posteriormente, recoger el sobrenadante y pasar a través de una columna que contiene 600 l de resina de glutatión Sepharose 4B. </li><li> Lavar la columna con 50 ml de tampón de sonicación y junto con 100 ml de tampón de alta concentración de sal (50 mM Tris pH 7,5, NaCl 500 mM, DTT 1 mM y glicerol al 5%) para eliminar las proteínas unidas inespecíficamente. Se eluye la proteína unida con 5 ml de tampón de sal alta que contiene glutatión 40 mM. </li><li> Se dializa la proteína eluida en 2 L de tampón de diálisis con baja glicerol (20 mM Tris pH 7,4, 100 mM KCl, 0,5 mM de DTT y 10% de glicerol) durante 2 horas y después en 20 mM Tris pH 7,4, KCl 100 mM, 0,5 mM TDT y el 70% de glicerol durante 8 horas o toda la noche. Asegúrese de que todos los buffers de purificación son a 4 ° C y efectuar la purificación de proteínas en el cuarto frío para evitar la desnaturalización de las proteínas. </li></ol></li></ol> 3. Péptido matriz metilación <ol><li> Pre-incubación del péptido Arrays <ol><li> Realizar péptido matriz de metilación ya sea en una caja de tamaño apropiado o en una bolsa de plástico para evitar el desperdicio de enzima y caro AdoMet marcado radiactivamente. Preincubar la membrana péptido matriz en bolsa de plástico sellada que contiene el respectivo búfer metilación sin enzima y etiquetado [metil-3H] -AdoMet durante 10 min. El volumen de tampón depende del tamaño de la matriz, por ejemplo usar 8 ml de tampón de metilación para una matriz de perfil péptido especificidad completa. Optimizar la cantidad y concentración de la AdoMet para cada enzima. </li></ol></li><li> La metilación del péptido Arrays <ol><li> Desechar el tampón de pre-incubación y se incuba la membrana en 8 ml de tampón de metilación que contiene el respectivo PKMT y etiquetado [metil-3H] -AdoMet durante 1 a 2 h. NOTA: La cantidad de enzima requerida para una reacción de metilación depende de la actividad de PKMT específica, iniciamos nuestros experimentos de cribado típicamente con 50 nM de la aleta de la enzimaconcentración al. </li></ol></li><li> Lavado del péptido Arrays <ol><li> Después desechar el tampón de metilación en un recipiente de desechos radiactivos y lavar los arrays de péptidos de 5 veces con 20 ml de tampón que contiene bicarbonato de amonio 100 mM y 1% de SDS durante 5 minutos para eliminar la proteína unida. Deseche el tampón de lavado en un contenedor de residuos radiactivos. </li></ol></li><li> La detección de la señal radiactiva <ol><li> Después de los lavados se incuba la membrana durante 5 min en 10 ml de solución de Amplify (NAMP100V). </li><li> Luego, deseche la solución amplificar en el contenedor de residuos radiactivos para disolventes orgánicos, sellar la matriz péptido en una bolsa de plástico y lo puso en un casete de autorradiografía. </li><li> Coloque la película autorradiografía en la matriz de péptido en el cuarto oscuro. Cierre la bandeja cuidadosamente y exponerlo a -80 ° C durante el tiempo necesario. Luego, el desarrollo de la película para analizar los resultados. Captura de la imagen Pares de veces con diferentes exposition veces para evitar la saturación de los sustratos peptídicos fuertemente metilados. </li></ol></li></ol> 4. Procesamiento y Análisis de Datos <ol><li> Análisis densitométrico de spot Intensidades <ol><li> Escanear la película en un escáner convencional y analizar las intensidades de terreno por densitometría. Para ello, utilice un programa comercial ImageJ (que es gratuito) o. NOTA: Nosotros usamos software Phoretix para esta tarea. </li></ol></li><li> Normalización y de promedio de los resultados de diferentes membranas <ol><li> Llevar a cabo los experimentos de metilación de matriz péptido al menos por triplicado. Normalizar las intensidades escaneados para cada experimento de extracción de fondo y ajuste de la actividad en un sustrato de referencia 1.0. La media de los datos correspondientes a los puntos individuales y reportarlos como valores medios y las desviaciones estándar. </li></ol></li><li> Análisis de Datos y Visualización <ol><li> Representar gráficamente los datos en 2D usando un esquema de escala de grises o de color para indicar la actividad relativa. Haga esto wiº Excel o Sigmaplot como se muestra aquí. Además, preparar un gráfico de la distribución de las desviaciones estándar de los experimentos repetidos para analizar la calidad de los datos. </li><li> Para comparar y mostrar la precisión del reconocimiento de cada residuo en el péptido sustrato cuantitativamente, calcular la preferencia relativa de la PKMT para cada aminoácido en la posición i x por un factor de discriminación D 16,17: D X; i = &lt;V j ≠ i&gt; / V i - 1 Donde v i es la tasa de metilación de la variante de péptido llevar aminoácido en la posición i y x &lt;v j ≠ i&gt; es la tasa media de metilación de los 19 péptidos que llevan un aminoácido diferente j ≠ i en la posición x (incluyendo el secuencia de tipo silvestre). NOTA: El factor de discriminación definido por esto depende del nivel de fondo. Si sólo un residuo es aceptado en una cierta posición con un fondo de 3%, una discriminaciónse obtiene el factor de 32,3. No preferencia en una posición resulta en un factor de discriminación de 0. </li></ol></li></ol>

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No conflicts of interest declared.

Síntesis SPOT como se describe aquí es un poderoso método para asignar sitios de interacción proteína-proteína e investigar el reconocimiento de sustrato de enzimas peptídicas modificar. Sin embargo, la síntesis SPOT todavía tiene ciertos inconvenientes, porque aunque se informó de los péptidos sintetizados por el método SPOT tener más de 90% de pureza 21 esto es difícil de confirmar en cada caso. Por lo tanto, los resultados tienen que ser reproducida por otros métodos, por ejemplo, el uso de ...

En las últimas dos décadas, varios informes han demostrado la importancia de las modificaciones posteriores a la traducción (PTM) en el desarrollo celular y varias enfermedades como el cáncer, pero recientemente la proteína metilación de la lisina se ha convertido en una otra PTM vital. Mientras histona inicialmente metilación de la lisina se encontró que era una marca esencial de la cromatina, el trabajo más tarde también mostró lisina metilación de varias proteínas no histonas 1-4. La transferencia secuencial de los grupos metilo de la S-adenosil-L-metionina al grupo ε-amino de residuos de lisina es catalizada por una familia de enzimas llamada proteína de lisina methyltransferases (PKMTs) que contiene más de 60 proteínas en el genoma humano. PKMTs fueron descubiertos inicialmente como enzimas histona modificación que metilan residuo de lisina específico, pero informes posteriores demostraron que también podían methylate proteínas no histonas 5. Hasta ahora, se han identificado aproximadamente 5,000 sitios de metilación de la lisina en diferentes proteínas 6 </shasta&gt;, pero las enzimas responsables de estas modificaciones a menudo no se identifican. Una razón para esto es que la especificidad de la mayoría de PKMTs no ha sido ampliamente estudiado. Por lo tanto, se produce de forma recurrente que los nuevos sustratos de PKMTs se descubren. La falta de un conocimiento detallado de la especificidad de sustrato de PKMTs dificulta la comprensión de su función biológica y el papel. Para estudiar la especificidad de un PKMT en detalle, las tasas de metilación de muchos sustratos peptídicos que difieren en uno o unos pocos aminoácidos deben ser medidos y comparados, que se realiza idealmente utilizando arrays de péptidos. Basándose en los perfiles de especificidad resultantes, potenciales sustratos de PKMTs se pueden identificar que puede ser estudiado más. Arrays de péptidos se utilizan ampliamente herramientas para el análisis bioquímico de anticuerpos, enzimas modificadoras de péptidos y el mapeo de sitios de interacción proteína-proteína (anticuerpo-antígeno, receptor-ligando) 7-9. Se necesitan varios cientos de péptidos para such aplicaciones. Diferentes métodos están disponibles para la síntesis de péptidos, entre ellos Peptide Synthesis sobre resina se utiliza muy comúnmente, pero tiene limitaciones en el rendimiento y es relativamente caro. Estos problemas se resolvieron con la introducción del método de síntesis SPOT por Frank y sus colegas 10. El método de síntesis SPOT permite la síntesis de varios cientos de péptidos en paralelo y en promedio es barato en comparación con la síntesis de resina. Los péptidos sintetizados sobre membrana de celulosa se ​​pueden utilizar ya sea directamente para diversas aplicaciones o péptidos se puede escindir de la membrana y se utiliza como péptidos libres en solución o ensayos para preparar microarrays de péptidos 10-13. Síntesis SPOT es una variante de la síntesis de péptidos en fase sólida, que utiliza una membrana de celulosa como un soporte sólido y emplea el Fmoc-química estándar 10-13. Por lo tanto, la síntesis de cadenas peptídicas comienza en el extremo C-terminal y procede haciael extremo N-terminal en contraste con la síntesis biológica en los ribosomas. Las membranas de celulosa están funcionalizados para la unión de la primera activado ácidos amino (Fig. 1). El método SPOT se basa en la entrega secuencial de aminoácidos activados en una gotita de disolvente a lugares definidos en la membrana usando un sistema de pipeteo automatizado. La gota de líquido se dispensa en la membrana porosa donde forma una mancha de humedad circular, que posteriormente actúa como un reactor abierto para las reacciones químicas en la síntesis de péptidos. El tamaño del punto se determina por el volumen dispensado y la capacidad de absorción de la membrana, múltiplos de tales puntos están dispuestos como arrays. La escala de la síntesis se correlaciona con el tamaño del punto y la capacidad de carga de la membrana. La distancia entre los puntos y la densidad de arrays se gestionan mediante la variación de los tamaños de punto. Membrana de celulosa tiene varias ventajas como fase sólida en la síntesis de péptidos, es barato, tolerante a la chemicals, utilizados en la síntesis de péptidos y estables en soluciones acuosas y fácil de manejar. Además, su naturaleza hidrofílica lo hace adecuado para varios sistemas de ensayo biológico. Síntesis SPOT puede llevarse a cabo de forma manual o automatizado (para 1000s de péptidos) en función del número requerido de péptidos. Un sintetizador SPOT totalmente automatizado desde Intavis (Köln, Alemania) se utiliza para nuestras aplicaciones. Permite la síntesis de péptidos en cantidades diferentes y de diferente longitud. Los péptidos lineales se sintetizaron regularmente con ácido longitud de 15 a 20 amino, en los péptidos de adición de hasta 42 aminoácidos también se pueden preparar por paso a paso la síntesis 14,15. Sin embargo, aumentar el número de aminoácidos conduce a reducciones en los rendimientos de acoplamiento en general, que afecta a la calidad de los péptidos. Debido a la baja cantidad de péptidos por punto, los productos son a menudo difíciles de purificar y la calidad de los péptidos individuales no se pueden evaluar fácilmente. Por lo tanto, los resultados obtenidos a partir de Pept SPOTarrays IDE deben ser confirmadas ya sea con péptidos sintetizados por métodos estándar en mayor escala, que pueden ser purificados y analizados de acuerdo a los estándares en la síntesis de péptidos o por la síntesis de las proteínas que contienen las secuencias de péptidos deseados. Aún así, encontramos la síntesis SPOT ser altamente fiable y resultados generalmente para ser reproducible. Síntesis SPOT no se limita a proteinogenic aminoácidos, varios ácidos disponibles comercialmente aminoácidos modificados también pueden ser utilizados para la síntesis, lo que permite péptidos para ser modificados antes y después de la escisión final del grupo de protección de cadena lateral y, además, también permite la incorporación de aminoácidos fosforilados, metilados o acetilados 11. Bibliotecas de péptidos inmovilizados sintetizados por el método de SPOT se pueden utilizar directamente para muchos ensayos biológicos y bioquímicos. Empleamos arrays de péptidos que comprenden 300-400 péptidos para investigar la especificidad de sustrato de PKMTs. Para modifi enzimáticacatión, las matrices de péptidos se incuban con el respectivo PKMT y etiquetado [metil- 3 H] -AdoMet en un tampón apropiado. La metilación del sustrato respectivo se analizó siguiendo la transferencia enzimática de los grupos metilo de AdoMet marcados radiactivamente en el sustrato péptido mediante autorradiografía (Fig. 3). Por este procedimiento, las matrices de péptidos permiten el estudio de metilación de diferentes sustratos peptídicos al mismo tiempo. Una ventaja importante de este método es que todos los péptidos están metiladas en la competencia, de modo que durante la fase lineal de la cinética de metilación, la metilación relativo de cada péptido es proporcional a la constante de velocidad catalítica dividido por la constante de disociación (k cat / K D) de la enzima por el sustrato peptídico respectiva. Por lo tanto, la cantidad de radiactividad incorporada en cada lugar se correlaciona directamente con la actividad enzimática hacia el péptido particular. Utilizando elresultados de un experimento de metilación matriz de péptido, el perfil de especificidad de la PKMT se pueden definir y basándose en este nuevo sustratos pueden ser afirmados. Arrays de péptidos permiten la validación rápida y eficiente costo de la metilación de nuevos sustratos en el nivel de péptido. Para esto, se preparan las matrices que contienen los nuevos sustratos predichos junto con péptidos modificados que contienen un Ala en lugar de Lys en los sitios diana, así como péptidos de control positivos y negativos. Finalmente, los nuevos sustratos se pueden preparar como proteínas junto con mutantes, en los que el objetivo Lys está reemplazado por Ala y la metilación puede ser confirmada a nivel de proteína. Dependiendo de los resultados, esto es seguido por los estudios biológicos que abordan posibles funciones de la metilación de los sustratos proteicos recién descritos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="734">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:112px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:179px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol abs Gradient Grade HPLC</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>10299901</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">4193302</td>
			<td>Flammable, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piperidine &#8805; 99 % for Peptide Synthesis</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A122.1</td>
			<td>Flammable, Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate )</td>
			<td>Novabiochem</td>
			<td>8510860100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">N,N&#8217;-Diisopropylcarbodiimide purum &#8805; 98% GC</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>38370</td>
			<td>Flammable, Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetic anhydride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CP28.1</td>
			<td>Flammable, Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triisopropylsilane 99%,</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>233781</td>
			<td>Flammable, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dichlormethane &#8805;99,9%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P089.1</td>
			<td>Carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Methyl-2-Pyrrolidone</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4306.2</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Derivatized cellulose Membrane</td>
			<td style="width:112px;">Intavis AG K&#246;ln</td>
			<td style="width:119px;">32.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P088.2</td>
			<td>Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromphenolblue</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3640.0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T871.2</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Dodecyl Sulfate Pellets</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CN30.3</td>
			<td>Toxic, Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">MultiPep Synthesizer</td>
			<td style="width:112px;">Intavis AG K&#246;ln</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">HyperfilmTM high performance film</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28906837</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Phoretix software</td>
			<td style="width:112px;">TotalLab</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

specificity analysis of protein lysine methyltransferases using spot peptide arrays

Metilación de la lisina es una modificación post-traducción emergentes y se ha identificado en varias proteínas histonas y no histonas, donde juega un papel crucial en el desarrollo de células y muchas enfermedades. Aproximadamente se identificaron 5.000 sitios de metilación de la lisina en diferentes proteínas, que son fijados por unos decenas de lisina methyltransferases proteína. Esto sugiere que cada PKMT methylates múltiples proteínas, sin embargo hasta ahora sólo uno o dos sustratos se han identificado varias de estas enzimas. Analiza la especificidad de sustrato de arreglo péptido Para abordar este problema, hemos introducido de PKMTs. Matrices de péptidos son herramientas poderosas para caracterizar la especificidad de PKMTs porque metilación de varios sustratos con diferentes secuencias se puede probar en un array. Hemos sintetizado arrays de péptidos en la membrana de celulosa usando un sintetizador Intavis SPOT y analizado la especificidad de los distintos PKMTs. Basándose en los resultados, para varias de estas enzimas, s novelaubstrates pudieron ser identificados. Por ejemplo, para NSD1 mediante el empleo de arrays de péptidos, mostramos que metila K44 de H4 en lugar de la H4K20 informado y además H1.5K168 es el sustrato altamente preferido sobre el H3K36 anteriormente conocido. Por lo tanto, las matrices de péptidos son herramientas poderosas para caracterizar bioquímicamente los PKMTs.

Arrays de péptidos se utilizaron con éxito para caracterizar bioquímicamente la especificidad de PKMTs, y se identificaron varios novela histonas y no histonas sustratos de PKMT por este enfoque 5,16-19. Definir el espectro de sustrato correcto de una PKMT (o cualquier enzima) es un paso esencial para la comprensión de su mecanismo molecular y funciones celulares. Como un ejemplo de la aplicación del método de matriz de metilación SPOT péptido, se describen los resultados ...

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Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

Análisis de la especificidad de la proteína lisina metiltransferasas Usando SPOT Péptido Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

specificity-analysis-protein-lysine-methyltransferases-using-spot

Research

JoVE Journal

Biology

13.9K vistas.  Stuttgart University. Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

Video: Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Investigación

Biología

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Utilizando el sistema de fraccionamiento GELFREE 8100 de peso molecular basado en Fraccionamiento con la recuperación de la fase líquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small molecule studies and drug development 4. Many epigenetic regulators have only recently been discovered and are still in the process of being classified. Among these enzymes are lysine demethylases which remove methyl groups from lysines on histones and other proteins. Due to the novel nature of this class of enzymes, few assays have been developed to study their activity. This has been a road block to both the classification and high throughput study of histone demethylases. Currently, very few demethylase assays exist. Those that do exist tend to be qualitative in nature and cannot simultaneously discern between the different lysine methylation states (un-, mono-, di- and tri-). Mass spectrometry is commonly used to determine demethylase activity but current mass spectrometric assays do not address whether differentially methylated peptides ionize differently. Differential ionization of methylated peptides makes comparing methylation states difficult and certainly not quantitative (Figure 1A). Thus available assays are not optimized for the comprehensive analysis of demethylase activity.
Here we describe a method called MassSQUIRM (mass spectrometric quantitation using isotopic reductive methylation) that is based on reductive methylation of amine groups with deuterated formaldehyde to force all lysines to be di-methylated, thus making them essentially the same chemical species and therefore ionize the same (Figure 1B). The only chemical difference following the reductive methylation is hydrogen and deuterium, which does not affect MALDI ionization efficiencies. The MassSQUIRM assay is specific for demethylase reaction products with un-, mono- or di-methylated lysines. The assay is also applicable to lysine methyltransferases giving the same reaction products. Here, we use a combination of reductive methylation chemistry and MALDI mass spectrometry to measure the activity of LSD1, a lysine demethylase capable of removing di- and mono-methyl groups, on a synthetic peptide substrate 5. This assay is simple and easily amenable to any lab with access to a MALDI mass spectrometer in lab or through a proteomics facility. The assay has ~8-fold dynamic range and is readily scalable to plate format 5.

We present a method for using MALDI mass spectrometry and reductive methylation chemistry to quantify changes in lysine methylation.

Aplicación de MassSQUIRM para mediciones cuantitativas de la actividad desmetilasa Lisina

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificación de los complejos de proteínas en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; La purificación mediante afinidad del péptido secuencial en combinación con espectrometría de masas tándem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This technique quickly proved advantageous over its solution-phase predecessor in both time and labor. Improvements concerning the nature of solid support, the protecting groups employed and the coupling methods employed over the last five decades have only increased the usefulness of Merrifield's original system. Today, use of a Boc-based protection and base/nucleophile cleavable resin strategy or Fmoc-based protection and acidic cleavable resin strategy, pioneered by R.C. Sheppard, are most commonly used for the synthesis of peptides1.
Inspired by Merrifield's solid supported strategy, we have developed a Boc/tert-butyl solid-phase synthesis strategy for the assembly of functionalized bis-peptides2, which is described herein. The use of solid-phase synthesis compared to solution-phase methodology is not only advantageous in both time and labor as described by Merrifield1, but also allows greater ease in the synthesis of bis-peptide libraries. The synthesis that we demonstrate here incorporates a final cleavage stage that uses a two-step "safety catch" mechanism to release the functionalized bis-peptide from the resin by diketopiperazine formation.
Bis-peptides are rigid, spiro-ladder oligomers of bis-amino acids that are able to position functionality in a predictable and designable way, controlled by the type and stereochemistry of the monomeric units and the connectivity between each monomer. Each bis-amino acid is a stereochemically pure, cyclic scaffold that contains two amino acids (a carboxylic acid with an &alpha;-amine)3,4. Our laboratory is currently investigating the potential of functional bis-peptides across a wide variety of fields including catalysis, protein-protein interactions and nanomaterials.

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using &quot;Safety Catch&quot; Methodology

The efficient solid-phase peptide synthesis of a functionalized bis-peptide trimer utilizing a "safety catch" cleavage procedure from HMBA resin is described.

Síntesis en fase sólida de un péptido funcionalizado Bis-El uso de &quot;Cierre de seguridad&quot; Metodología

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Un ensayo de unión de alto rendimiento MHC II para el análisis cuantitativo del péptido epítopos

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

Etiquetado específico de secuencia de ácidos nucleicos y proteínas con metiltransferasas y el cofactor Análogos

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

La identificación de sitios de interacción proteína-proteína utilizando péptido arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Fluorescente verde a base de proteína Expresión Proyección de proteínas de membrana en<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

La visualización de atado-gran superficie moléculas de ADN con un ADN Fluorescent Protein unión del péptido

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...