This work has been supported by the DFG grant JE 252/7.

1. Préparation d&#39;un peptide Arrays <ol><li> Programmation de la séquences peptidiques <ol><li> Concevoir des séquences peptidiques pour la synthèse en utilisant le logiciel MultiPep spotter. Entrez les séquences peptidiques dans les codes à une lettre. Peptide 1: TARKSTGGKA </li><li> Générer alanine ou l&#39;arginine marche bibliothèques avec une commande spécifique (.replace, A) pour dépister les acides aminés importants nécessaires à la reconnaissance d&#39;un substrat défini. Par exemple, dans l&#39;exemple suivant la première ligne représente la séquence de type sauvage et de la seconde ligne de chaque acide aminé dans un peptide est modifié séquentiellement en alanine. remplacer, A TARKSTG Un -ARKSTG T A -RKSTG TA-A -KSTG TARGET Un -STG TARK- Un -TG TARKS- A -G Un TARKST- </li><li> Utilisez des commandes similaires (.replace R,.remplacer N etc.), comme décrit au point 1.1.2 avec tous les résidus d&#39;acides aminés naturellement disponibles (éventuellement en omettant la cystéine, la méthionine et le tryptophane, parce que ces résidus sont sensibles à l&#39;oxydation et le rendement de synthèse parfois inférieur) pour synthétiser une matrice de peptide pour la détermination du consensus substrat motif de séquence pour une enzyme. Remarque: Comme le montre la figure 4A, l&#39;axe horizontal représente la séquence peptidique donnée et l&#39;axe vertical représente les acides aminés qui sont sélectionnées pour la commande. Semblable à la séquence représentée dans 1.1.2, A sur l&#39;axe vertical signifie qu&#39;une séquence Ala remplace chaque position de la séquence donnée dans la première rangée de la Fig. 4A. De la même façon séquentielle arginine remplace chaque acide aminé dans la seconde rangée et ainsi de suite avec les autres acides aminés. Complete bibliothèques de réseau peptidique sont synthétisés par substitution systématiquement chaque résidu dans la séquence de substrat peptidique munie de chaque ee autres résidus d&#39;acides aminés naturellement disponibles, cette aide à comprendre l&#39;influence de chaque résidu au niveau de chaque position de la séquence donnée. </li><li> Alternativement, la méthylation des substrats connus ou prédits peptidiques peut être facilement vérifié synthétiser des banques de peptides avec les peptides cibles du PKMT ainsi que les contrôles de méthylation positif et négatif (c.-à-peptides connus pour méthylé ou connus pour ne pas être méthylé). Synthétiser des peptides en échangeant la lysine cible putative en alanine pour confirmer la méthylation de la lysine cible comme indiqué ci-dessous par la programmation manuelle. Peptide de type sauvage: StGG K PRQFL Peptide mutant: StGG Un PRQFL REMARQUE: Le logiciel a aussi son inhérents à créer différentes bibliothèques, comme la cartographie d&#39;épitopes avec un décalage de la séquence d&#39;image souhaitée pour cartographier acides aminés importants nécessaires à une interaction. </li></ol></li><li> Préparation de membrane, acides aminés d&#39;uneRéactifs d <ol><li> Pré-gonfler la membrane SPOT dans le DMF (N, N-diméthylformamide) pendant 10 min, puis placez la membrane humide sur le cadre de SPOT synthétiseur sans bulles d&#39;air ou de plis. </li><li> Laver la membrane trois fois avec de l&#39;éthanol à 100%. Sécher les membranes complètement pendant au moins 10 min avant de commencer le programme de synthèse. </li><li> En parallèle, 0,5 M fraîchement préparer des concentrations de travail disponibles dans le commerce les acides aminés protégés par Fmoc en les dissolvant dans de la NMP et préparer également l&#39;activateur et une base comme décrit dans le Tableau 1. </li><li> Assurez-vous que tous les récipients de solution des déchets du synthétiseur de SPOT ont été vidés et remplir les réservoirs de solvant avec le DMF, l&#39;éthanol et pipéridine. NOTE: Maintenant la machine est prête pour la synthèse. </li></ol></li><li> Spotting du premier acide aminé <ol><li> Pour générer la liaison amide avec le groupe amino libre sur la membrane, activer le groupe carboxy de l&#39;acide aminé entrant par annonceding l&#39;activateur (N, N &#39;-Diisopropylcarbodiimide) et une solution de base (cyanoacétate d&#39;éthyle hydroxyimino) en le dérivé d&#39;acide aminé. </li><li> Découvrir les volumes désirés des acides aminés activés à la membrane fonctionnalisée amino-PEG en utilisant le robot programmable. REMARQUE: Ainsi, l&#39;extrémité C-terminale de l&#39;acide aminé est couplé au groupe amino de la membrane. </li><li> Répéter cette étape trois fois pour assurer un meilleur couplage du premier acide aminé activé. Incuber la membrane pendant 20 minutes, puis laver avec du DMF pour éliminer les acides aminés non couplés. </li></ol></li><li> Blocage des espaces libres sur les zones non-comptant REMARQUE: Après le couplage du premier acide aminé C-terminal de tous les peptides du groupe amino de la membrane, les groupes amino entre les taches ainsi que certains des groupes amino dans les zones ponctuelles ne forment pas de liaisons avec des acides aminés. <ol><li> Bloquer ces groupes amino libres par mise en incubation avec la solution de coiffage (20% de l&#39;anhydride acétique dans du DMF)pendant 5 min. REMARQUE: On évite ainsi le couplage des acides aminés dans les autres cycles avec la membrane au lieu de la chaîne peptidique en croissance. </li></ol></li><li> L&#39;élimination du groupe Fmoc <ol><li> Après le blocage, laver la membrane avec du DMF, puis 4 fois incuber avec 20% de pipéridine dans du DMF pendant 20 min pour éliminer le groupe de protection Fmoc. Remarque: Cette étape conduit à l&#39;élimination des groupes amino-protecteurs Fmoc et on l&#39;appelle déprotection. </li><li> Ensuite, laver la membrane deux fois avec DMF et deux fois à l&#39;éthanol et laisser sécher. REMARQUE: Maintenant, la membrane est prête pour le couplage des acides aminés suivants. </li></ol></li><li> Allongement de la chaîne NOTE: L&#39;addition de chaque acide aminé est appelé un cycle. Outre l&#39;accouplement des premier acide aminé, le cycle commence par la déprotection du groupe Fmoc de l&#39;acide aminé couplé et il est suivi par le couplage du groupe carboxyle activé d&#39;un acide aminé entrant au groupe amino du pep croissantla chaîne de la marée. <ol><li> Répéter les étapes 1.3 et 1.5 jusqu&#39;à ce que la longueur du peptide désiré. </li></ol></li><li> Tachant NOTE: Après le cycle final, les tableaux peptidiques sont colorées avec du bleu de bromophénol pour confirmer la synthèse réussie de peptides. Bleu de bromophénol se lie avec les groupes amino libres des peptides. Taches peptidiques montrent la couleur bleu clair après la coloration, mais l&#39;intensité des taches varie en fonction de la séquence peptidique. Cette coloration permet de confirmer la suppression complète de la pipéridine, car en présence de bleu de bromophénol pipéridine ne tache pas les peptides. En outre, cette aide aussi à marquer les tableaux peptidiques pour un usage ultérieur. <ol><li> Après la déprotection du groupe Fmoc dans le dernier cycle de synthèse, laver la membrane avec du DMF et 100% d&#39;éthanol. Ensuite, traiter la membrane avec du bleu de bromophénol (0,02% de bleu de bromophénol dans du DMF) pour un minimum de 5 min jusqu&#39;à ce qu&#39;il devienne complètement bleu. </li><li> Ensuite, laver la membrane avec du DMF et ethanol suivie d&#39;un séchage pendant 10 minutes. Maintenant, prenez la membrane du synthétiseur et effectuer la déprotection de la chaîne latérale (section 1.8) manuellement. Si nécessaire, la membrane photographier pour documenter les résultats de la synthèse de peptide (Fig. 2). </li></ol></li><li> La déprotection de la chaîne latérale <ol><li> Traiter les membranes avec 20 à 25 ml de mélange de déprotection de la chaîne latérale constituée de 95% d&#39;acide trifluoroacétique (TFA) à cliver les groupes de protection de chaîne latérale et des réactifs fixateurs (2,5% d&#39;eau et 2,5% de triisopropylsilane) pour protéger les chaînes latérales d&#39;acides aminés à partir de modification lors de cette étape. Prélever un volume suffisant de mélange de déprotection pour se assurer qu&#39;il couvre complètement la membrane dans un boîtier hermétiquement fermé résistant aux produits chimiques et incuber pendant 1 à 2 h tout en agitant doucement. </li><li> Laver la membrane six fois avec 20 à 25 ml de DCM (dichlorométhane) pendant 2 minutes chaque fois et enfin avec 100% d&#39;éthanol et sécher dans un dessiccateur pendant une nuit. NOTE: Maintenantla membrane peut être utilisée pour les expériences. Un schéma de la synthèse de la matrice de peptide est présenté à la figure 1. </li></ol></li></ol> 2. Protein Expression et purification <ol><li> Expression de la protéine de PKMTs que TPS Fusions <ol><li> En utilisant des techniques standards, de cloner le gène codant pour la pleine longueur PKMT ou son domaine catalytique dans un vecteur d&#39;expression bactérien (tel que pGEX-6P2) de l&#39;exprimer sous forme de protéine de fusion GST. </li><li> Transférer le vecteur avec la PKMT souhaité insérer dans BL21 ou BL21 codon ainsi E. cellules coli par la méthode de choc thermique ou toute autre méthode. </li><li> Préparer une pré-culture avec 30 ml de milieu Luria-Bertani (LB) à la date d&#39;expression et incuber à 37 ° C pendant 7-8 heures avec agitation continue. </li><li> Ensuite, transférer 10 ml de la pré-culture dans un 2 L grands flacons à déflecteurs contenant 1 litre de milieu LB et incuber à 37 ° C dans un incubateur avec agitation continue jusqu&#39;à ce que la portée de la culturees une densité optique défini à 600 nm. REMARQUE: Même si cela peut être optimisé pour chaque protéine, nous incitons régulièrement à une DO 600nm d&#39;environ 0,8. La température d&#39;induction doit être optimisé pour chaque protéine individuellement, certaines protéines montrer bonne expression à 22 ° C, et certains à des températures plus élevées. </li><li> Décaler les cellules à la température d&#39;induction pendant 15 min, puis à induire 1 mM d&#39;isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside et laisser la culture croître pendant 10-12 heures à la température d&#39;induction. </li><li> Après la récolte des cellules par centrifugation à 5000 xg pendant 15 min, et enfin laver le culot avec 30 ml de tampon STE (10 mM Tris pH 8,0, NaCl 100 mM et EDTA 0,1 mM) et conserver à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. </li></ol></li><li> Protein Purification <ol><li> Décongeler le culot cellulaire et remettre en suspension dans 30 ml de tampon de sonication (50 mM Tris pH 7,5, NaCl 150 mM, DTT 1 mM et 5% de glycerol) et perturber par sonication. NOTE: Ce tampon needs à être optimisés pour chaque protéine par la suite. </li><li> Centrifuger le lysat cellulaire à 22 000 x g pendant 1 heure et, ensuite recueillir le surnageant et passer à travers une colonne contenant 600 ul de résine glutathion-Sepharose 4B. </li><li> Laver la colonne avec 50 ml de tampon de sonication et ensuite avec 100 ml de tampon à haute teneur en sel (Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, DTT 1 mM et 5% de glycerol) pour éliminer les protéines non spécifiquement liées. Eluer la protéine liée avec 5 ml de tampon salin élevé contenant 40 mM de glutathion. </li><li> Dialyser la protéine éluée dans 2 L de tampon de dialyse à bas glycérol (20 mM Tris pH 7,4, 100 mM de KCl, 0,5 mM de DTT et 10% de glycerol) pendant 2 heures et ensuite dans du Tris 20 mM pH 7,4, 100 mM de KCl, 0,5 mM TNT et 70% de glycérol pendant 8 heures ou toute la nuit. Se assurer que toutes les mémoires tampon de purification sont à 4 ° C et d&#39;effectuer la purification de la protéine dans la chambre froide pour éviter la dénaturation des protéines. </li></ol></li></ol> 3. Peptide tableau méthylation <ol><li> Pré-incuprobation du peptide Arrays <ol><li> Effectuer peptide tableau méthylation soit dans une boîte de taille appropriée ou dans un sac en plastique pour éviter le gaspillage d&#39;enzyme et coûteux AdoMet marqué radioactivement. Pré-incuber la membrane de peptide de réseau dans un sac en plastique scellé contenant le tampon de méthylation respectif sans enzyme et marqué [méthyl-3H] -AdoMet pendant 10 min. Le volume de tampon dépend de la taille de la matrice, par exemple utiliser 8 ml de tampon de méthylation pour une spécificité toute la gamme profil peptidique. Optimiser la quantité et la concentration de l&#39;AdoMet pour chaque enzyme. </li></ol></li><li> La méthylation d&#39;un peptide Arrays <ol><li> Jeter le tampon de pré-incubation et incuber la membrane dans 8 ml de tampon de méthylation contenant le PKMT respectif et marqué [méthyl-3H] -AdoMet pour 1-2 heures. REMARQUE: La quantité d&#39;enzyme nécessaire à une réaction de méthylation dépend de l&#39;activité spécifique de PKMT, nous initions nos expériences de criblage typiquement avec 50 nM d&#39;enzyme ailetteconcentration al. </li></ol></li><li> Lavage de Peptide Arrays <ol><li> Ensuite, jeter le tampon de méthylation dans un conteneur de déchets radioactifs et laver les matrices de peptides pour 5 fois avec 20 ml de tampon contenant 100 mM de bicarbonate d&#39;ammonium et 1% de SDS pendant 5 min pour éliminer la protéine liée. Jeter le tampon de lavage dans un conteneur de déchets radioactifs. </li></ol></li><li> La détection du signal radioactif <ol><li> Après les lavages incuber la membrane pendant 5 minutes dans 10 ml de solution Amplify (NAMP100V). </li><li> Ensuite, jeter la solution Amplify dans le conteneur de déchets radioactifs aux solvants organiques, sceller la matrice de peptide dans un sac en plastique et le mettre dans une cassette d&#39;autoradiographie. </li><li> Placer le film d&#39;autoradiographie sur le réseau peptidique dans la chambre noire. Fermez la cassette attentivement et de l&#39;exposer à -80 ° C pendant le temps nécessaire. Ensuite, développer le film pour analyser les résultats. Capturez le couple d&#39;image de fois avec expositio différenten fois pour éviter la saturation des substrats peptidiques fortement méthylés. </li></ol></li></ol> 4. Traitement et analyse des données <ol><li> Densitométrique Analyse des intensités spot <ol><li> Scannez le film dans un scanner conventionnel et analyser les intensités au comptant par densitométrie. Pour ce faire, en utilisant ImageJ (qui est un freeware) ou un programme commercial. NOTE: Nous utilisons un logiciel Phoretix pour cette tâche. </li></ol></li><li> Normalisation et Moyenne des résultats de différentes membranes <ol><li> Effectuer les expériences méthylation de tableau de peptide au moins en trois exemplaires. Normaliser les intensités numérisées pour chaque expérience par soustraction de fond et la mise l&#39;activité à un substrat de référence 1.0. La moyenne des données pour les taches individuelles et de les signaler comme des valeurs moyennes et les écarts types. </li></ol></li><li> Analyse des données et Affichage <ol><li> Tracer les données en 2D utilisant un système de niveaux de gris ou de couleur pour indiquer l&#39;activité relative. Pour ce faire, wie Excel ou Sigmaplot comme indiqué ici. De même, préparer un graphique de la distribution des écarts-types des expériences répétées pour analyser la qualité des données. </li><li> Pour comparer afficher et la précision de la reconnaissance de chaque résidu dans le peptide de substrat quantitativement, calculer la préférence relative de la PKMT pour chaque acide aminé à la position x i par un facteur D 16,17 discrimination: D X; i = &lt;V j ≠ i&gt; / V i - 1 Où V i est le taux de méthylation de la variante de peptide portant l&#39;acide aminé i à la position x et &lt;v j ≠ i&gt; est le taux moyen de méthylation de tous les 19 peptides portant un j d&#39;acides aminés différente ≠ i à la position x (y compris la séquence de type sauvage). NOTE: Le facteur de discrimination en ce sens dépend du niveau de fond. Si un seul résidu est accepté à une certaine position avec un fond de 3%, une discriminationfacteur de 32,3 soit obtenu. Aucune préférence à une position se traduit par un facteur de discrimination de 0. </li></ol></li></ol>

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No conflicts of interest declared.

SPOT synthesis tel que décrit ici est une méthode puissante pour cartographier les sites d&#39;interaction protéine-protéine et d&#39;enquêter sur la reconnaissance de substrat de peptide enzymes de modification. Cependant, la synthèse SPOT a encore certains inconvénients, car bien que les peptides synthétisés par la méthode de SPOT sont signalés à avoir plus de 90% de pureté 21 ce est difficile de confirmer dans chaque cas. Par conséquent, les résultats doivent être reproduits par d&#39;autre...

Dans les deux dernières décennies, plusieurs rapports ont démontré l&#39;importance des modifications post-traductionnelles (PTM) dans le développement cellulaire et plusieurs maladies comme le cancer, mais récemment protéines lysine méthylation a émergé comme une autre PTM vitale. Alors qu&#39;initialement la méthylation des histones de la lysine a été jugée une marque essentielle de la chromatine, travail plus tard a également montré lysine méthylation de plusieurs protéines non-histones 1-4. Le transfert séquentiel des groupes méthyle de la S-adénosyl-L-méthionine dans le groupe des résidus de lysine ε-amino est catalysée par une famille d&#39;enzymes appelée protéine Lysine méthyltransférases (PKMTs) qui contient plus de 60 protéines dans le génome humain. PKMTs ont d&#39;abord découvert que la modification des histones enzymes qui méthylate résidus de lysine spécifique, mais des rapports ultérieurs ont démontré qu&#39;elles pouvaient aussi méthylation des protéines non-histones 5. Jusqu&#39;à présent, environ 5000 sites de méthylation de la lysine ont été identifiés sur différentes protéines 6 </sinscrire&gt;, mais les enzymes responsables de ces modifications sont souvent pas identifiés. Une raison à cela est que la spécificité de la plupart des PKMTs n&#39;a pas été étudié en profondeur. Par conséquent, il se produit de façon récurrente que de nouveaux substrats de PKMTs sont découverts. L&#39;absence d&#39;une connaissance détaillée de la spécificité de substrat de PKMTs entrave la compréhension de leur fonction biologique et son rôle. Pour étudier la spécificité d&#39;un PKMT en détail, les taux de plusieurs substrats peptidiques qui diffèrent par une ou quelques acides aminés méthylation doivent être mesurées et comparées, qui est idéalement effectuée en utilisant des réseaux de peptides. Basé sur les profils de spécificité résultant, substrats potentiels de PKMTs peuvent être identifiés qui peuvent être étudiées plus loin. matrices de peptides sont des outils largement utilisés pour l&#39;analyse biochimique des anticorps, des peptides et des enzymes de modification de la cartographie des sites d&#39;interaction protéine-protéine (anticorps-antigène, récepteur-ligand) 9.7. Plusieurs centaines de peptides sont nécessaires pour Such applications. Différentes méthodes sont disponibles pour la synthèse des peptides, parmi lesquels Peptide Synthesis de résine est très couramment utilisée, mais elle présente des limites du débit et il est relativement coûteux. Ces problèmes ont été résolus avec l&#39;introduction de la méthode de synthèse SPOT par Frank et ses collègues 10. Procédé de synthèse SPOT permet la synthèse de plusieurs centaines de peptides en parallèle et, en moyenne, il est peu coûteux par rapport à la synthèse de la résine. Les peptides synthétisés sur membrane de cellulose peuvent être utilisées soit directement pour diverses applications ou des peptides peut être clivé à partir de la membrane et utilisés comme peptides libres dans les analyses en solution ou pour préparer des puces à peptides 10-13. Synthèse SPOT est une variante de la synthèse peptidique en phase solide, qui utilise une membrane de cellulose comme support solide et emploie la chimie classique Fmoc-10-13. Par conséquent, la synthèse des chaînes de peptides à partir de l&#39;extrémité C-terminale et se dirige versl&#39;extrémité N-terminale à la différence de la synthèse biologique des ribosomes. Les membranes de cellulose sont fonctionnalisées pour la fixation du premier amino-acides activés (Fig. 1). Procédé SPOT est basé sur la livraison séquentielle des acides aminés activés dans une gouttelette de solvant à des endroits définis sur la membrane en utilisant un système de pipetage automatisé. La gouttelette de liquide est distribué sur la membrane poreuse, où il forme une tache humide circulaire, qui agit ensuite comme un réacteur ouvert pour les réactions chimiques dans la synthèse des peptides. La taille du spot est déterminée par le volume distribué et la capacité d&#39;absorption de la membrane, des multiples de ces taches sont disposées en rangées. L&#39;échelle de la synthèse en corrélation avec la taille de la place et la capacité de chargement de la membrane. La distance entre les points et la densité de réseaux sont gérés en faisant varier les tailles de spot. membrane de cellulose a plusieurs avantages en tant que phase solide dans la synthèse peptidique, il est peu coûteux, tolérant à la chemicals utilisés en synthèse peptidique, dans des solutions aqueuses stables et faciles à manipuler. De plus, sa nature hydrophile rend approprié pour plusieurs systèmes d&#39;analyse biologique. synthèse de SPOT peut être effectuée manuellement ou automatisé (pour 1000s des peptides) selon le nombre requis de peptides. Un synthétiseur de SPOT entièrement automatisé de Intavis (Köln, Allemagne) est utilisé pour nos applications. Il permet la synthèse de peptides en différentes quantités et de longueur différente. Peptides linéaires sont régulièrement synthétisés avec 15 à 20 amino acides de longueur, dans les peptides d&#39;addition de jusqu&#39;à 42 acides aminés peuvent également être préparés par synthèse par étapes 14,15. Cependant, l&#39;augmentation du nombre d&#39;acides aminés conduit à des réductions des rendements de couplage ensemble, ce qui affecte la qualité des peptides. En raison de la faible quantité de peptides par point, les produits sont souvent difficiles à purifier et la qualité de peptides individuels ne peuvent pas être facilement évalués. Par conséquent, les résultats obtenus à partir de SPOT Peptide matrices doivent être confirmées, soit avec des peptides synthétisés par des procédés standard à plus grande échelle, qui peuvent être purifiés et analysés selon les normes en synthèse peptidique ou par la synthèse des protéines contenant les séquences peptidiques souhaitées. Pourtant, nous avons trouvé la synthèse de SPOT pour être très fiable et des résultats généralement être reproductible. synthèse SPOT est pas limitée aux acides aminés protéinogènes, plusieurs acides aminés modifiés disponibles dans le commerce peuvent également être utilisés pour la synthèse, ce qui permet peptides à être modifiés avant et après le clivage final du groupe de protection de chaîne latérale et, en outre, elle permet également l&#39;incorporation de acides aminés phosphorylés, méthylés ou acétylés 11. Des banques de peptides immobilisés synthétisés par la méthode Spot peuvent être directement utilisés pour de nombreuses analyses biologiques et biochimiques. Nous avons utilisé des réseaux peptidiques comprenant les peptides 300-400 pour étudier la spécificité de substrat de PKMTs. Pour modifi enzymatiquecation, les matrices de peptides sont incubés avec la PKMT respectif et étiqueté [méthyl-3H] -AdoMet dans un tampon approprié. La méthylation du substrat respectif est analysé par la suite du transfert enzymatique des groupes méthyle à marqueur radioactif de l&#39;AdoMet pour le substrat peptidique par autoradiographie (fig. 3). Par ce procédé, les tableaux peptidiques permettent l&#39;étude de la méthylation de différents substrats peptidiques en même temps. Un avantage important de ce procédé est que tous les peptides sont méthylés en compétition, de telle sorte que pendant la phase linéaire de la cinétique de méthylation, la méthylation relative de chaque peptide est proportionnelle à la constante de vitesse catalytique divisée par la constante de dissociation (k cat / K D) de l&#39;enzyme pour le substrat peptidique respective. Par conséquent, la quantité de radioactivité incorporée dans chaque spot est directement corrélée à l&#39;activité enzymatique vers le peptide particulier. Utilisation de larésultats d&#39;une expérience de méthylation de réseau peptidique, le profil de spécificité de la PKMT peuvent être définis et sur cette base de nouveaux substrats peut être fondée. Matrices peptidiques permettent la validation rapide et efficace et de coût de la méthylation de nouveaux substrats au niveau des peptides. Pour cela, on prépare des tableaux qui contiennent les nouveaux substrats prédites avec des peptides modifiés contenant une Ala à la place de Lys à des sites cibles ainsi que les peptides témoins positifs et négatifs. Enfin, les nouveaux substrats peuvent être préparés comme des protéines ainsi que des mutants, dans lequel la cible Lys est modifiée à Ala et la méthylation peut être confirmée au niveau de la protéine. Selon les résultats, ce est alors suivi par des études biologiques portant sur les rôles potentiels de la méthylation des substrats protéiques nouvellement décrites.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="734">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:112px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:179px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol abs Gradient Grade HPLC</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>10299901</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">4193302</td>
			<td>Flammable, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piperidine &#8805; 99 % for Peptide Synthesis</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A122.1</td>
			<td>Flammable, Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate )</td>
			<td>Novabiochem</td>
			<td>8510860100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">N,N&#8217;-Diisopropylcarbodiimide purum &#8805; 98% GC</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>38370</td>
			<td>Flammable, Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetic anhydride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CP28.1</td>
			<td>Flammable, Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triisopropylsilane 99%,</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>233781</td>
			<td>Flammable, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dichlormethane &#8805;99,9%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P089.1</td>
			<td>Carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Methyl-2-Pyrrolidone</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4306.2</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Derivatized cellulose Membrane</td>
			<td style="width:112px;">Intavis AG K&#246;ln</td>
			<td style="width:119px;">32.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P088.2</td>
			<td>Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromphenolblue</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3640.0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T871.2</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Dodecyl Sulfate Pellets</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CN30.3</td>
			<td>Toxic, Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">MultiPep Synthesizer</td>
			<td style="width:112px;">Intavis AG K&#246;ln</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">HyperfilmTM high performance film</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28906837</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Phoretix software</td>
			<td style="width:112px;">TotalLab</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

specificity analysis of protein lysine methyltransferases using spot peptide arrays

Lysine méthylation est une modification post-traduction émergent et il a été identifié sur plusieurs protéines histones et non-histones, où il joue un rôle crucial dans le développement des cellules et de nombreuses maladies. Environ 5 000 sites de méthylation de la lysine ont été identifiés sur différentes protéines, qui sont fixés par quelques douzaines de protéines méthyltransférases de lysine. Ceci suggère que chaque PKMT méthylation de multiples protéines, mais jusqu&#39;à présent, seulement un ou deux substrats ont été identifiés pour plusieurs de ces enzymes. Analyse réseau de peptides Pour aborder ce problème, nous avons introduit la spécificité de substrat à base de PKMTs. Tableaux peptidiques sont des outils puissants pour caractériser la spécificité de PKMTs parce méthylation de plusieurs substrats avec différentes séquences peut être testée sur un réseau. Nous avons synthétisé tableaux peptidiques sur membrane de cellulose en utilisant un synthétiseur Intavis SPOT et analysé la spécificité des différents PKMTs. Basé sur les résultats, pour plusieurs de ces enzymes, romanubstrates pu être identifiés. Par exemple, en employant pour NSD1 matrices de peptides, nous avons montré qu&#39;il méthylation H4 K44 de la place de la H4K20 rapporté et en outre le substrat H1.5K168 est hautement préféré sur la H3K36 précédemment connu. Par conséquent, les tableaux peptidiques sont des outils puissants pour caractériser biochimiquement les PKMTs.

tableaux de peptides ont été utilisés avec succès pour caractériser biochimiquement la spécificité de PKMTs, et plusieurs roman histones et non-histones substrats de PKMT ont été identifiées par cette approche 5,16-19. Définir le spectre de substrat correcte d&#39;un PKMT (ou ne importe quelle enzyme) est une étape essentielle vers la compréhension de son mécanisme moléculaire et les fonctions cellulaires. A titre d&#39;exemple de l&#39;application de la méthode de...

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Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

Spécificité Analyse des protéines lysine Methyltransferases Utilisation SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

specificity-analysis-protein-lysine-methyltransferases-using-spot

Research

JoVE Journal

Biology

13.8K vues.  Stuttgart University. Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloration des protéines dans les gels de Coomassie G-250, sans solvant et l&#39;acide acétique organique

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Recherche

Biologie

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Utiliser le système de fractionnement GELFREE 8100 pour les Poids Moléculaire à base de fractionnement avec récupération de la phase liquide

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenèse et analyse fonctionnelle des canaux ioniques hétérologue exprimée dans les cellules de mammifères

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

La quantification des protéines à l&#39;aide d&#39;enrichissement d&#39;immunoaffinité peptide couplé à la spectrométrie de masse

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small molecule studies and drug development 4. Many epigenetic regulators have only recently been discovered and are still in the process of being classified. Among these enzymes are lysine demethylases which remove methyl groups from lysines on histones and other proteins. Due to the novel nature of this class of enzymes, few assays have been developed to study their activity. This has been a road block to both the classification and high throughput study of histone demethylases. Currently, very few demethylase assays exist. Those that do exist tend to be qualitative in nature and cannot simultaneously discern between the different lysine methylation states (un-, mono-, di- and tri-). Mass spectrometry is commonly used to determine demethylase activity but current mass spectrometric assays do not address whether differentially methylated peptides ionize differently. Differential ionization of methylated peptides makes comparing methylation states difficult and certainly not quantitative (Figure 1A). Thus available assays are not optimized for the comprehensive analysis of demethylase activity.
Here we describe a method called MassSQUIRM (mass spectrometric quantitation using isotopic reductive methylation) that is based on reductive methylation of amine groups with deuterated formaldehyde to force all lysines to be di-methylated, thus making them essentially the same chemical species and therefore ionize the same (Figure 1B). The only chemical difference following the reductive methylation is hydrogen and deuterium, which does not affect MALDI ionization efficiencies. The MassSQUIRM assay is specific for demethylase reaction products with un-, mono- or di-methylated lysines. The assay is also applicable to lysine methyltransferases giving the same reaction products. Here, we use a combination of reductive methylation chemistry and MALDI mass spectrometry to measure the activity of LSD1, a lysine demethylase capable of removing di- and mono-methyl groups, on a synthetic peptide substrate 5. This assay is simple and easily amenable to any lab with access to a MALDI mass spectrometer in lab or through a proteomics facility. The assay has ~8-fold dynamic range and is readily scalable to plate format 5.

We present a method for using MALDI mass spectrometry and reductive methylation chemistry to quantify changes in lysine methylation.

Application de la MassSQUIRM pour des mesures quantitatives de l&#39;activité Déméthylase Lysine

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identification des complexes protéiques dans<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En utilisant séquentielle Purification par affinité peptide en combinaison avec la spectrométrie de masse en tandem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Un essai de liaison à haut débit CMH II pour l&#39;analyse quantitative du peptide épitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Identifier les sites d&#39;interaction protéine-protéine à l&#39;aide de peptides tableaux

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein base Expression dépistage des protéines membranaires dans<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

La visualisation de la surface captif grande molécules d&#39;ADN avec un ADN fluorescent protein peptide de liaison

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...